DISPOSITIVO DE MEDICION DE LAS CARACTERISTICAS DE ABSORCION DE LUZ DE UNA MUESTRA DE TEJIDO BIOLOGICO.

Dispositivo de medición de las características de absorción luminosa de una muestra de tejido biológico,

que consta de:

- unos medios (7; 307) de iluminación de la muestra (1), adaptados para emitir alternativamente al menos una primera y una segunda radiaciones luminosas hacia la muestra, siendo dichas radiaciones respectivamente de una primera y de una segunda longitud de onda diferentes la una de la otra;

- unos medios (9) de recepción y de análisis de la radiación luminosa de salida procedente de la muestra (1), constando dichos medios de recepción y de análisis (9) de medios convertidores (23) de dicha radiación de salida en señal de control (S0);

- unos medios de control y mando (31; 331) que reciben de entrada la señal de control (S0) y emiten de salida al menos la primera (S1) y la segunda (S2) señales de mando de los medios de iluminación (7; 307), que corresponden respectivamente a la primera y segunda radiaciones, y al menos una señal de medición (Sm); y

- unos medios de cálculo (33) de las características de absorción de la muestra (1), adaptados para recibir de entrada dicha señal de medición (Sm) y calcular dichas características en función de dicha señal de medición (Sm),

caracterizado, porque dichos medios de control y mando (31; 331) están adaptados para que la intensidad luminosa (IUV, IR) de cada una de las radiaciones varíe de forma periódica, con el mismo periodo, en desfase una con respecto a la otra, y para regular al menos una de las señales de mando (S1, S2) en función de la señal de control (S0), de modo que, en un intervalo de tiempo de integración (Ti) de al menos un periodo (Tp) de variación de dichas radiaciones, la amplitud de dicha señal de control (S0), tomada en las fases de emisión de una de las radiaciones, sea igual a la amplitud de la señal de control (So), tomada en las fases de emisión de la otra radiación,

y porque la señal de medición (Sm) representa al menos una de dichas señales de mando (S1, S2) en el intervalo de tiempo de integración (Ti)

Dispositivo de medición de las características de absorción de luz de una muestra de tejido biológico.

La invención se refiere a un dispositivo de medición de las características de absorción de luz de una muestra de tejido biológico.

En particular, la invención está destinada a analizar el contenido de hojas de vegetales, es decir la concentración de ciertos compuestos químicos.

Durante su ciclo de vida las plantas deben adaptarse a unas variaciones, a veces importantes de sus condiciones ambientales, como por ejemplo la luz o la disponibilidad de agua y de recursos minerales. Estas adaptaciones, a menudo van acompañadas de variaciones en el contenido de determinados metabolitos de las hojas, en particular los del metabolismo llamado secundario, tal como los polifenoles. Esta clase de metabolitos designan los compuestos que tienen al menos una función fenol o que derivan directamente de compuestos fenólicos, por esterificación, por ejemplo. Otra denominación habitual, que se empleará en lo sucesivo para estos compuestos y los de las familias vecinas, es la denominación "fenilpropanoides", por su origen biosintético.

Se ha establecido que los fenilpropanoides varían de una especie a otra, que se acumulan principalmente en las vacuolas de las células epidérmicas y que pueden presentar variaciones importantes de concentración en función de las condiciones ambientales.

Por ejemplo, M.M. Cadwell y col., han demostrado en un artículo titulado "Internai filters: prospects for UV-acclimation in higher plants" (Physiol Plant. (1983) 58, pág. 445-450) que los fenilpropanoides se acumulan después de la exposición a la luz, probablemente con el fin de proteger a las hojas de la radiación ultravioleta.

Otra razón igualmente enunciada para las variaciones del contenido de fenilpropanoides de las hojas, implica el ajuste de las rutas metabólicas en función de las proporciones relativas de recursos disponibles de carbono y de nitrógeno. Cuando el nitrógeno es abundante en relación con la cantidad de carbono fijada, la planta invierte en la producción de biomasa consumidora de nitrógeno y favorece su crecimiento. Esto da como resultado una tasa baja de fenilpropanoides. Cuando el nitrógeno se enrarece con respecto al carbono, entonces la producción fotosintética se vuelve hacia la síntesis de compuestos pobres en nitrógeno que son los fenilpropanoides. A este respecto se puede consultar en la revista Oikos (1983, vol. 40, pág. 357-368), el artículo de J.P. Bryant y col. "Carbon/nutrient balance of boreal plants in relation to vertebrate herbivory"; en la revista "Journal of Chemical Ecology" (1989, vol. 15, pág. 1117-1131), el artículo de P. Price y col. "Carbon-nutrient balance hypothesis in within-species phytochemical variation of Salix lasiolepis"; en la revista "Quart. Rev. Biol." (1992, vol. 67, pág. 283-335), el artículo de D.A. Herms y W.J. Mattson "The dilemma of plants: To grow or to defend".

Se han mostrado otras funciones de los fenilpropanoides, como la selección de la nutrición por los herbívoros o la protección contra los agentes patógenos (Plant Cell, 1995, vol. 7, pág. 1085-1097, R.A. Dixon y N.L. Paiva, Stress-induced phenylpropanoid metabolism).

Por lo tanto, el seguimiento in situ del contenido de fenilpropanoides de las hojas o de la epidermis de las hojas aportaría unas informaciones susceptibles de ser usadas en diferentes campos de aplicación. En ecofisiología, permitiría seguir los efectos del aumento de las radiaciones UV debido al agujero de ozono y los del aumento del contenido de CO₂ atmosférico seguido del uso de los hidrocarburos fósiles, y estudiar las interacciones entre plantas y herbívoros. En biología vegetal, permitiría una evaluación de la productividad del metabolismo secundario y un seguimiento del desarrollo vegetal. En silvicultura, se dispondría de una herramienta de descripción de la estructura vegetal, que podría cuantificar el reparto de luz en el seno de la cubierta, o también calcular el reparto de los recursos nutritivos. Finalmente, en agricultura, se dispondría de una herramienta de diagnóstico rápido, no invasivo para el control de los aportes nutritivos o del ataque de agentes patógenos.

Un procedimiento conocido de análisis del contenido de fenilpropanoides consiste en extraer primero de todo sus pigmentos foliares por trituración e inmersión en un disolvente, tal como por ejemplo metanol. Después, se determina el contenido de fenilpropanoides del extracto por medición de la transmitancia en el ultravioleta donde los fenilpropanoides tienen una o varias bandas de absorción. (A este respecto, véase "Analysis of Phenolic Plant Metabolites. Methods in Ecology" de P.G. Waterman y S. Mole, eds. J.H. Lawton et G.E. Likens, 1994, Oxford: Blackwell Scientific Publications. 238). Pero este último procedimiento es destructivo y no puede aplicarse sobre el terreno debido al equipo de laboratorio que requiere. Una medición in situ por absorción ultravioleta tampoco es aplicable debido a la fuerte absorción de los pigmentos fotosintéticos (clorofila a y b) que interfiere con la absorción debida a los fenilpropanoides que se quieren medir.

Para poder usarse sobre el terreno, en el marco de sus diferentes aplicaciones, la medición del contenido de fenilpropanoides debe ser rápida, sencilla y debe poder efectuarse in situ de manera no destructiva con el fin de permitir un seguimiento regular.

Además, un procedimiento de evaluación in situ ventajoso consiste en determinar la transmitancia de la epidermis de las hojas, a partir de mediciones de la fluorescencia roja procedente de la clorofila excitada por una radiación ultravioleta de análisis por un lado, y excitada por una radiación visible de referencia por otra parte.

Así pues, a la longitud de onda de análisis ?1, la fluorescencia medida F1 vale:

F1 = k1 T1 I1

donde T1 es la transmitancia de la epidermis a la longitud de onda ?1, I1 la intensidad de la radiación de medición de incidencia a la misma longitud de onda, y k1 un factor de proporcionalidad.

A la longitud de onda de referencia ?0, la fluorescencia medida F0 se determina por una ecuación análoga:

F0 = k0 T0 I0

en la que T0 es la transmitancia de la epidermis a la longitud de onda ?0, I0 la intensidad de la radiación de medición de incidencia a la misma longitud de onda, y k0 un factor de proporcionalidad.

La absorbancia A debida a los fenilpropanoides presentes en la epidermis se define por la relación:

(1)A = -Log[T1/T0] = -Log[F1/F0 x (I0 k0)/(I1 k1)]

y si I1, k1 y k0 se mantienen constantes de una medición a otra:

A = -Log[F1/F0] + C,

donde C es una constante.

Como la absorbancia y el contenido de fenilpropanoides varían de manera paralela, se puede, por lo tanto, calcular el contenido de fenilpropanoides a partir de las mediciones de F1 y F0, y de un calibrado que determina el valor de la constante.

Ahora bien, C en realidad depende no solamente del instrumento de medición, sino también de las variaciones del rendimiento de la fluorescencia de la clorofila que pueden intervenir entre la medición a la longitud de onda de análisis ?1 y la medición a la longitud de onda de referencia ?0.

La patente DE 3518527 A1 describe un fluorómetro de pulsos adecuado para detectar las variaciones rápidas del rendimiento de la fluorescencia de la clorofila después de una irradiación de luz.

Efectivamente, en la fotosíntesis y en ecofisiología vegetal es sabido que el rendimiento cuántico de la fluorescencia de la clorofila es muy variable, y que depende en parte de la intensidad luminosa recibida anteriormente, por intermedio de mecanismos de "atenuación" fotoquímicos y no fotoquímicos.

En consecuencia, la medición de referencia a la longitud de onda ?0 es delicada de llevar a cabo, puesto que hay que asegurarse que el rendimiento cuántico de fluorescencia de la clorofila no ha variado, o ha variado en un factor conocido, entre el momento de la medición a la longitud de onda de análisis y el momento de la medición a la longitud de onda de referencia.

Una manera de hacerlo ha sido descrita por W. Bilger y col., en el artículo titulado "Measurement...

1. Dispositivo de medición de las características de absorción luminosa de una muestra de tejido biológico, que consta de:

caracterizado, porque dichos medios de control y mando (31; 331) están adaptados para que la intensidad luminosa (I_UV, I_R) de cada una de las radiaciones varíe de forma periódica, con el mismo periodo, en desfase una con respecto a la otra, y para regular al menos una de las señales de mando (S₁, S₂) en función de la señal de control (S₀), de modo que, en un intervalo de tiempo de integración (T_i) de al menos un periodo (T_p) de variación de dichas radiaciones, la amplitud de dicha señal de control (S₀), tomada en las fases de emisión de una de las radiaciones, sea igual a la amplitud de la señal de control (S_o), tomada en las fases de emisión de la otra radiación,

y porque la señal de medición (S_m) representa al menos una de dichas señales de mando (S₁, S₂) en el intervalo de tiempo de integración (T_i).

2. Dispositivo de medición según la reivindicación 1, caracterizado porque los medios de control y mando están adaptados para suministrar una primera señal de mando (S₁), de manera que la amplitud de la intensidad luminosa (I_UV) de la primera radiación sea constante, mientras que la amplitud de la segunda señal (S₂) está regulada por dichos medios de control y mando (31).

3. Dispositivo de medición según la reivindicación 2, caracterizado porque dicha señal de medición (S_m) está constituida por dicha segunda señal (S₂) en el intervalo de tiempo de integración (T_i).

4. Dispositivo de medición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los medios de iluminación constan de la primera (11) y la segunda (12) fuentes luminosas adaptadas para emitir respectivamente la primera y la segunda radiaciones, alimentadas eléctricamente por la primera (15) y la segunda (16) alimentación eléctrics respectivas, estando dirigidas dichas alimentaciones (15, 16) respectivamente por la primera y la segunda señales de mando.

5. Dispositivo de medición según la reivindicación 4, caracterizado porque una al menos de las fuentes luminosas (11, 12) es un diodo electroluminiscente.

6. Dispositivo de medición según la reivindicación 4 ó 5, caracterizado porque la primera fuente luminosa (11) emite la primera radiación en un intervalo de longitud de onda correspondiente a la banda ultravioleta, en particular de 300 a 390 nm, en particular aproximadamente 370 nm.

7. Dispositivo de medición según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque la segunda fuente luminosa (12) emite la segunda radiación en un intervalo de longitud de onda correspondiente a la banda de la luz roja, en particular 670 nm.

8. Dispositivo de medición según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, caracterizado porque los medios de iluminación (7; 307) constan de al menos un filtro óptico (19) adaptado para filtrar las radiaciones de las fuentes luminosas (11, 12) emitidas hacia la muestra (1).

9. Dispositivo de medición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque los medios de control y de mando (31; 331) constan de medios de sincronización (41) conectados a los medios de iluminación (7), que emiten al menos una señal periódica de sincronización (S_S) hacia dichos medios de iluminación (7), de modo que la intensidad luminosa (I_UV, I_R) de cada una de las radiaciones varía de manera periódica, en desfase la una con respecto a la otra.

10. Dispositivo de medición según la reivindicación 9, caracterizado porque los medios de sincronización (41) están adaptados para hacer variar la intensidad luminosa (I_UV, I_R) de la primera y segunda radiaciones con una frecuencia superior a un valor mínimo sustancialmente igual a 1 kHz.

11. Dispositivo de medición según la reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque los medios de control y mando (31; 331) constan de un dispositivo de mando y control (43) conectado a los medios de sincronización (41) de tal modo que reciben la señal de sincronización (S_S), y reciben de entrada la señal de control (S₀).

12. Dispositivo de medición según la reivindicación 11, caracterizado porque dicho dispositivo de mando y control consta de un filtro de paso alto (51) adaptado para filtrar la señal de control (S₀) de entrada.

13. Dispositivo de medición según la reivindicación 11 ó 12, caracterizado porque dicho dispositivo de mando y control (43) consta de un dispositivo desmultiplicador (53) que recibe de entrada, por una parte una señal que representa la señal de control (S₀) y por otra parte la señal de sincronización (S_S), estando adaptado dicho dispositivo desmultiplicador para proporcionar de salida una primera señal elemental (S_e1) que representa el nivel de intensidad de la radiación de salida (I_F) durante una fase de emisión de la primera radiación, y una segunda señal elemental (S_e2) que representa el nivel de intensidad de la radiación de salida durante una fase de emisión de la segunda radiación.

14. Dispositivo de medición según la reivindicación 13, caracterizado porque el dispositivo desmultiplicador (53) consta de al menos dos medios de interrupción (57, 58) dirigidos alternativamente para abrirse y cerrarse por la señal de sincronización (S_S) y un medio de memorización (60) asociado a cada uno de dichos medios de interrupción (57, 58).

15. Dispositivo de medición según las reivindicaciones 12 y 13 consideradas en conjunto, caracterizado porque dicha señal que representa la señal de control (S₀) es la señal de control filtrada por dicho filtro de paso alto (51).

16. Dispositivo de medición según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque el dispositivo de mando y control (43) consta de un amplificador diferencial (55) cuya entrada inversora recibe la primera señal elemental (S_e1) y la entrada no inversora recibe la segunda señal elemental (S_e2).

17. Dispositivo de medición según la reivindicación 16, caracterizado porque el dispositivo de mando y control (43) consta de un circuito integrador (61) alimentado de entrada por la señal de salida de dicho amplificador diferencial (55) y adaptado para emitir una señal integrada a lo largo de al menos un periodo de señal de sincronización (S_S).

18. Dispositivo de medición según la reivindicación 17, caracterizado porque dicha señal integrada constituye la señal de medición (S_m).

19. Dispositivo de medición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque los medios convertidores (23) constan de un fotodetector (25) que convierte una señal óptica en señal eléctrica, y un preamplificador (27) de la señal eléctrica procedente de dicho fotodetector (25).

20. Dispositivo de medición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque los medios de recepción y análisis (9) constan de un filtro óptico (21) interpuesto entre la muestra (1) y los medios convertidores (23).

21. Dispositivo de medición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque los medios de cálculo (33) está conectados de salida al menos a un periférico (35), en particular una pantalla de visualización y/o un dispositivo de almacenamiento de datos.

22. Dispositivo de medición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque los medios de iluminación (307) están adaptados para emitir alternativamente tres radiaciones de longitudes de onda diferentes, estando los medios de control y de mando (331) adaptados para suministrar tres señales de mando (S₁, S₂, S₃) correspondientes, siendo una primera señal de mando (S₁) de manera que la amplitud de la intensidad luminosa de la primera radiación sea constante, mientras que las amplitudes de la segunda (S₂) y tercera (S₃) señales respectivas están reguladas por dichos medios de control y de mando (331).

23. Dispositivo de medición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizado porque presenta una estructura de pinza (100) que consta de dos ramas (101, 102), articuladas la una sobre la otra de modo que pueden encerrar una muestra, estando provista la primera rama (101) de medios de iluminación (7) y estando provista la segunda rama (102) de medios de recepción y de análisis (9).

24. Dispositivo de medición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizado porque consta de un haz de fibras ópticas (201) por el que transitan la radiación procedente de los medios de iluminación (7) y la radiación procedente de la muestra (1), siendo esta última radiación una radiación reflejada.

25. Procedimiento de medición de las características de absorción luminosa de una muestra de tejido biológico, en el que se realizan las siguientes operaciones:

caracterizado porque se lleva a cabo dicha orden del siguiente modo:

26. Procedimiento según la reivindicación 25, caracterizado porque se mantiene constante la amplitud de intensidad (I_UV) de una de dichas primera y segunda radiaciones, mientras que se regula la amplitud de intensidad (I_R) de la otra de dichas radiaciones.

27. Procedimiento según la reivindicación 25 ó 26, caracterizado porque se filtra la radiación procedente de la muestra (1) antes de analizarla.

28. Uso del dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 o procedimiento siguiendo una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, para medir las características de absorción de luz de una hoja de vegetal, en particular para realizar la medición de la concentración de compuestos de la familia de fenoles o de fenilpropanoides de una epidermis de hoja.

29. Uso del dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 o procedimiento siguiendo una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, para calcular las necesidades nutricionales, en particular de nitrógeno, de un cultivo.

30. Uso del dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 o procedimiento siguiendo una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, para medir las características de absorción de luz de un tejido animal o humano que contiene derivados de hemoglobina.

31. Uso del dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 o procedimiento siguiendo una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, para realizar un diagnóstico médico o veterinario.