PROCEDIMIENTO PARA LA PURIFICACION DE RIBOFLAVINA.

Procedimiento para la producción de cristales de riboflavina con un contenido de ADN inferior a 0.

2 ppb, que se puede medir por PCR, comprendiendo los pasos de:

(a) precipitar una primera forma cristalina de riboflavina en el caldo de fermentación,

(b) aislar la primera forma cristalina de riboflavina,

(c) transformar la primera forma cristalina de riboflavina en una segunda forma cristalina de riboflavina en condiciones que descompongan el ADN diluido, y

(d) aislar la segunda forma cristalina de riboflavina en el que la primera forma cristalina es el dihidrato de riboflavina, que es termodinámicamente menos estable a temperatura ambiente que la segunda forma cristalina de riboflavina, y en el que la precipitación de la primera forma cristalina se controla mediante la adición de cristales iniciadores al caldo de fermentación

Procedimiento para la purificación de riboflavina.

La invención se refiere a un procedimiento para la purificación de riboflavina (vitamina B₂) particularmente adecuado para la eliminación de ADN asociado a cristales de riboflavina.

Aunque la riboflavina se ha producido de manera sintética en el pasado, por razones económicas los procesos modernos de producción de riboflavina se basan en la tecnología de fermentación. Los procesos de este tipo tienen en común que la riboflavina la producen microorganismos y que el producto puro se obtiene a través de pasos de purificación consecutivos partiendo de la suspensión de reacción cruda (el caldo de fermentación) que contiene la riboflavina.

Los procesos de fermentación para la producción de riboflavina se conocen en el estado anterior de la técnica. Con relación a estos se pueden consultar, por ejemplo, las publicaciones Takata, Ryohei, Nagata, Toshiomi, Shimamoto, Sumio; Solubility of riboflavin obtained from cultured Eremothecium ashbyii (1949) 27, p. 8-10 y 50-52; Sen Gupta, S. B.; Gupta, H. N.; Solubility of riboflavin (vitamin B2) in water; J. Proc. Inst. Chemists (India)(1949) 21, p. 1-4; Chemical Engineering, Abril 2002, p. 23; van Loon R.P.G.M. et al.; Development of a Fermentation Process for the Manufature of riboflavin; Chimia 50 (1996) N.º 9 p. 410-412; EP-A 428 767; EP-A 464 582 y DE-A 2 920 592.

La concentración de riboflavina en la fermentadora aumenta continuamente según transcurre el proceso de fermentación. Sin embargo, la solubilidad de la riboflavina en soluciones acuosas es ciertamente pobre; se ha establecido que, en soluciones acuosas neutras y a una temperatura entre 30ºC y 50ºC, la solubilidad de la riboflavina es aproximadamente de 0.014% a 0.031% en peso. Por lo tanto, cuando se alcanza un nivel particular de sobresaturación durante el proceso de fermentación, la riboflavina comienza a cristalizar de manera espontánea. Una vez se han formado los primeros cristalitos durante el proceso de fermentación, la riboflavina producida por la fermentación incesante cristaliza continuamente hasta que el proceso de fermentación llega a su fin.

En general, la suspensión de la reacción (el caldo de fermentación) que contiene los cristales de riboflavina se lleva al siguiente paso del procedimiento. Normalmente, la suspensión de la reacción se pasteriza en un primer paso, es decir, se matan los microorganismos en condiciones ácidas y a temperaturas elevadas. En un segundo paso, la mayor parte de la biomasa se elimina de la suspensión de la reacción decantándola. En un tercer paso, la suspensión de la reacción se acidifica y se calienta a una temperatura comprendida entre 95ºC y 115ºC a fin de descomponer y eliminar las impurezas restantes (por ejemplo, biomasa, proteínas, lípidos, ADN) hasta cierto punto, purificando así los cristales de riboflavina. La pureza de los cristales de riboflavina aumenta normalmente durante el tratamiento ácido desde aproximadamente un 85% hasta un 96% en peso. En un cuarto paso, se filtra y se lava la suspensión acidificada de la reacción. Los pasos adicionales posteriores incluyen pasos de purificación y/o pasos de formulación para obtener la forma final del producto.

En el paso de purificación (el tercer paso) se pueden apartar los lípidos, las proteínas, el ADN y otros compuestos orgánicos e inorgánicos solamente hasta cierto punto. Se ha publicado que se puede lograr una pureza de hasta 97% en peso añadiendo 2% en peso de ácido sulfúrico u otros ácidos minerales y calentando la suspensión de la reacción a una temperatura en el rango de 95ºC a 105ºC.

Sin embargo, la calidad de la riboflavina producida en los procesos de fermentación del estado anterior de la técnica no es satisfactoria ya que el producto sigue conteniendo una cantidad significativa de impurezas, ADN en particular. Por un lado, la pureza de la riboflavina debería ser lo más alta posible, en particular para fines farmacéuticos o nutricionales. Por otro lado, sin embargo, el procedimiento de purificación debería ser bastante simple, eficaz, cuantitativo y moderado (por ejemplo, la riboflavina no debería someterse a temperaturas altas durante un periodo de tiempo determinado para prevenir la formación de productos deteriorados).

Un objeto de la invención es proporcionar un procedimiento para la purificación de riboflavina mejorado con respecto a los procedimientos del estado anterior de la técnica.

Este problema técnico fundamental lo ha solucionado la materia de las reivindicaciones de la patente, es decir el procedimiento para la producción de cristales de riboflavina con un contenido de ADN inferior a 0.2 ppb, que se puede medir por PCR, comprendiendo los pasos de:

        (a)        precipitar una primera forma cristalina de riboflavina en el caldo de fermentación,

        (b)        aislar la primera forma cristalina de riboflavina,

        (c)        transformar la primera forma cristalina de riboflavina en una segunda forma cristalina de riboflavina en condiciones que descompongan el ADN diluido, y

        (d)        aislar la segunda forma cristalina de riboflavina

en el que la primera forma cristalina es el dihidrato de riboflavina, que es termodinámicamente menos estable a temperatura ambiente que la segunda forma cristalina de riboflavina, y en el que la precipitación de la primera forma cristalina se controla mediante la adición de cristales iniciadores al caldo de fermentación.

El término "temperatura ambiente" indica una temperatura ambiente media, preferiblemente de 23ºC.

Se ha descubierto de manera sorprendente que se puede reducir considerablemente el contenido de ADN de los cristales de riboflavina mediante dicho procedimiento, es decir, a un nivel inferior al límite de detección del análisis de PCR convencional (aproximadamente 0.2 ppb).

Este procedimiento de purificación de riboflavina se puede llevar a cabo en condiciones (temperatura, tiempo de residencia, concentración de ácido, etc.) mucho más moderadas que las de los procedimientos del estado anterior de la técnica, en los que no se transforma una primera forma cristalina de riboflavina en una segunda forma cristalina de riboflavina.

La invención se basa en el descubrimiento fortuito de que la cristalización de la riboflavina durante la fermentación genera diferentes formas cristalinas (modificaciones) dependiendo de las condiciones de la fermentadora. El análisis de los cristales de riboflavina en el caldo de fermentación desveló que en algunos lotes precipitaba un anhidrato (es decir anhidrato de riboflavina I) y en otros un hidrato (es decir dihidrato de riboflavina). En otros lotes se encontraron mezclas de ambas formas cristalinas. Se identificó incluso una tercera forma cristalina (es decir tetrahidrato de riboflavina) en algunos casos. Estas formas cristalinas, es decir los hidratos y anhidratos de riboflavina, se caracterizaron por difracción de rayos X en polvo (XRD) y sorción dinámica de vapor (DVS). Se investigaron las solubilidades de las diferentes formas cristalinas por espectroscopía Raman. La combinación de la DVS con la XRD permite investigar la formación de los hidratos.

Se ha descubierto que tres modificaciones cristalinas anhidras diferentes (anhidratos de riboflavina I, II y III) están en equilibrio con diferentes hidratos de riboflavina (monohidrato, dihidrato y tetrahidrato de riboflavina).

Dependiendo de la temperatura, las siguientes formas cristalinas están en equilibrio entre sí o se transforman de manera irreversible unas en otras en condiciones establecidas (de por ejemplo temperatura, humedad, etc.):

anhidrato de riboflavina I con dihidrato de riboflavina y tetrahidrato de riboflavina; anhidrato de riboflavina II con monohidrato de riboflavina y dihidrato de riboflavina; anhidrato de riboflavina III con tetrahidrato de riboflavina.

A los 23ºC, el estado del anhidrato de riboflavina I y del dihidrato de riboflavina se puede representar de la siguiente manera:

 

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Reivindicaciones:

1. Procedimiento para la producción de cristales de riboflavina con un contenido de ADN inferior a 0.2 ppb, que se puede medir por PCR, comprendiendo los pasos de:

(a) precipitar una primera forma cristalina de riboflavina en el caldo de fermentación,

(b) aislar la primera forma cristalina de riboflavina,

(c) transformar la primera forma cristalina de riboflavina en una segunda forma cristalina de riboflavina en condiciones que descompongan el ADN diluido, y

(d) aislar la segunda forma cristalina de riboflavina

en el que la primera forma cristalina es el dihidrato de riboflavina, que es termodinámicamente menos estable a temperatura ambiente que la segunda forma cristalina de riboflavina, y en el que la precipitación de la primera forma cristalina se controla mediante la adición de cristales iniciadores al caldo de fermentación.

2. Procedimiento para la reducción del contenido de ADN por debajo de 0.2 ppb, que se puede medir por PCR, en relación con los cristales de riboflavina que se producen por fermentación, que comprende los pasos de:

(a) precipitar una primera forma cristalina de riboflavina en el caldo de fermentación,

(b) aislar la primera forma cristalina de riboflavina,

(c) transformar la primera forma cristalina de riboflavina en una segunda forma cristalina de riboflavina en condiciones que descompongan el ADN diluido, y

(d) aislar la segunda forma de riboflavina que posee dicho contenido de ADN,

en el que la primera forma cristalina es el dihidrato de riboflavina, que es termodinámicamente menos estable a temperatura ambiente que la segunda forma cristalina de riboflavina, y en el que la precipitación de la primera forma cristalina se controla mediante la adición de cristales iniciadores al caldo de fermentación.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la segunda forma cristalina de riboflavina es el anhidrato de riboflavina I.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se seleccionan los cristales iniciadores entre el monohidrato de riboflavina o el dihidrato de riboflavina.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el paso (c) se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 60ºC y 75ºC empleando un disolvente que se selecciona del grupo conformado por un ácido mineral, una base y un ácido orgánico.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la primera forma cristalina de riboflavina del paso (b) se pasteriza antes de su transformación en el paso (c).

7. Uso de la transformación cristalina para la eliminación de ADN asociado de los cristales de riboflavina, en el que el dihidrato de riboflavina que precipitó en el caldo de fermentación se aísla y se transforma en condiciones que descompongan ADN diluido en una segunda forma cristalina, que es termodinámicamente más estable a temperatura ambiente que el dihidrato de riboflavina, y en el que el contenido de ADN por debajo de 0.2 ppb de los cristales de riboflavina según la segunda forma cristalina se puede medir por PCR, y en el que la precipitación del dihidrato de riboflavina se controla mediante la adición de cristales iniciadores al caldo de fermentación.

 

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