ESPECTROMETRO CENTRIFUGO Y PROCEDIMIENTO DE SEPARACION DE OBJETOS.

Procedimiento de separación de objetos que comprende:

(a) colocar los objetos en un canal de separación (60);

(b) girar el canal (60) alrededor de un eje de rotación (34) para generar una fuerza centrífuga sobre los objetos;

(c) aplicar, por medio de unos electrodos de conformación de campo (64) situados a lo largo del canal (60), un campo eléctrico que varía según la distancia radial r desde el eje de rotación, con una potencia de r que es superior o igual a 1; y

(d) permitir a los objetos que se desplacen y se separen a lo largo del canal (60) bajo las influencias combinadas de la fuerza centrífuga y el campo eléctrico, desplazándose los objetos hasta unos respectivos puntos de equilibrio en los cuales la fuerza centrífuga es igual a una fuerza opuesta debida al campo eléctrico

Espectrómetro centrífugo y procedimiento de separación de objetos.

La presente invención se refiere a un espectrómetro centrífugo y, de forma particular aunque no exclusiva, a un espectrómetro para separar células biológicas, macromoléculas u otros objetos. La presente invención se refiere además a los campos generales de la secuenciación y la separación de biomoléculas y la separación de células.

Convencionalmente, la secuenciación y la separación de biomoléculas y la separación de células se realizan mediante electroforesis. La metodología posible es diversa, pero en su mayor parte la ejecución de esta lleva una cantidad de tiempo considerable. Además, es necesario encontrar el equilibrio entre una presentación de resultados relativamente rápida (cuando las bandas sean estrechas pero se hallen muy cerca unas de otras) y una presentación de resultados retrasada (en cuyo caso, aunque las bandas estén más separadas unas de otras, estas se habrán ensanchado y serán más difusas).

En el documento US-A-4.432.849, se da a conocer una técnica de separación, en la que los objetos que se van a separar se suspenden en un fluido que presenta un gradiente de densidad. El aparato se somete a una fuerza centrífuga, y se aplica un voltaje entre los electrodos de cada extremo, creándose de ese modo un campo eléctrico que se modifica mediante la variación de la densidad del fluido para obtener un gradiente de campo. La fuerza centrífuga y la fuerza eléctrica opuestas se utilizan para realizar la separación de los objetos.

Uno de los objetivos de la presente invención es por lo menos mitigar las dificultades indicadas de la técnica anterior.

Otro de los objetivos de la presente invención es proporcionar un espectrómetro y un procedimiento para separar objetos que sean fáciles, cómodos y rápidos de utilizar.

Según el primer aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento de separación de objetos según la reivindicación 1.

El primer aspecto de la presente invención proporciona además un rotor de espectrómetro según la reivindicación 11, que presenta un eje de rotación y comprende:

por medio de los cuales, cuando se hace girar el rotor alrededor del eje de rotación, los objetos situados dentro de la cavidad se desplazan y se separan bajo la influencia combinada de la fuerza centrífuga y el campo eléctrico.

Según un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento de separación de objetos, según la reivindicación 2.

El segundo aspecto de la presente invención proporciona además un rotor de espectrómetro según la reivindicación 12.

La presente invención se refiere también a un espectrómetro que comprende un rotor de espectrómetro como el definido anteriormente. El espectrómetro puede comprender un controlador para controlar simultáneamente la velocidad angular del rotor o el campo eléctrico o ambas cosas. Preferentemente, los controles pueden relacionarse para permitir al usuario variar el rango dinámico del espectrómetro.

La presente invención es superior con respecto a los procedimientos convencionales de electroforesis, en la medida en que enfoca las bandas separadas (dentro de pozos de potencial), de tal forma que éstas no se ensanchan a lo largo del tiempo. Esto aporta la ventaja de una resolución adicional. El procedimiento y el aparato de la presente invención también ofrecen un rendimiento y un rango dinámico superiores, además de disponer de la capacidad, en ciertas formas de realización, de un rango dinámico variable.

Cuando el rotor está provisto de más de una paleta, es posible separar muestras de proteínas nativas y muestras tratadas mediante electroforesis SDS-PAGE en paralelo, ofreciendo entonces esta posibilidad una alternativa al mapa bidimensional de proteínas convencional. Además, se obtiene una ventaja sustancial en lo que respecta a la velocidad.

La presente invención se puede utilizar para realizar la secuenciación del ADN y el análisis de polimorfismos de un solo nucleótido, mediante algunas preparaciones de muestras relativamente simples. El procedimiento y el aparato de la presente invención pueden ser capaces de determinar cadenas de ADN más largas que las de los secuenciadores convencionales.

Está previsto también que la presente invención sea sumamente eficaz en la separación de células, puesto que funciona con mucha rapidez en comparación con los separadores celulares convencionales.

En ciertas formas de realización, la presente invención también aporta la posibilidad de extraer bandas identificadas interesantes (de células, proteínas, ADN u otros objetos que se deseen separar) para un posterior análisis.

En la mayoría de formas de realización, los objetos que se separan se desplazan a través de un tampón líquido (por ejemplo, una solución salina) bajo la influencia combinada de la fuerza centrífuga y el campo eléctrico. Sin embargo, están previstas otras formas de realización en las que las moléculas u otro tipo de objetos que se van a separar se desplazan a través de un tampón gaseoso o dentro de una cavidad al vacío.

Además de utilizarse para la selección, la separación y, en su caso, la secuenciación de biomoléculas tales como el ADN, el ARN, las proteínas, etc., la presente invención puede aplicarse también a la separación de células biológicas, moléculas de gas o vapor y una diversidad de tipos de objetos pequeños diferentes, tales como partículas. La presente invención puede utilizarse para separar cualquier tipo de objeto con valores de q/m bien definidos.

La presente invención puede ponerse en práctica de diversas maneras. A continuación, se describen varias formas de realización particulares a título de ejemplo, haciendo referencia a los dibujos adjuntos, en los cuales:

la figura 1 representa el rotor de un espectrómetro según una primera forma de realización de la presente invención;

la figura 2 representa un rotor alternativo de una segunda forma de realización;

la figura 3 representa la cavidad para un rotor según una tercera forma de realización;

la figura 4 representa una configuración de rotor alternativa, similar a la de la figura 1;

la figura 5 representa con mayor detalle la forma de una de las paletas del rotor de la figura 4;

la figura 6 representa los pozos de potencial en función del radio, para la configuración de la figura 4;

la figura 7 representa la distribución de los puntos de equilibrio de un rango de valores de q/m determinado, para la configuración de la figura 4;

la figura 8 representa la dependencia con los valores de q/m del ancho de banda para una diversidad de temperaturas diferentes;

la figura 9 ilustra la idoneidad de la resolución de los valores de q/m adyacentes en función de q/m;

la figura 10 representa cuántas bandas por centímetro pueden resolverse en función de q/m a 25ºC; y

la figura 11 representa esquemáticamente un ejemplo de sistema de control de espectrómetro.

La figura 1 ilustra esquemáticamente el rotor de un espectrómetro según una primera forma de realización de la presente invención. El rotor comprende un disco o una plataforma redonda y plana de un material rígido (tal como el acero), dentro del cual se recorta un grupo de cavidades circunferenciales de lados verticales o paletas 12. En la figura 1, se representan cuatro paletas, aunque el número de éstas puede ser superior o inferior.

Cada paleta se extiende radialmente desde un borde interno plano 14 hasta el extremo de la paleta 16 situado en la proximidad de la periferia externa del disco 10. Un lado de la paleta está delimitado por un borde recto 18, mientras el otro está delimitado por un borde conformado 20. Dentro de la cavidad 12, existe una pared vertical, paralela al borde recto 18, que separa la cavidad en dos partes: un canal de separación estrecho 24 y una zona de tampón (por ejemplo, de solución salina) 26. En algún punto situado a lo...

1. Procedimiento de separación de objetos que comprende:

2. Procedimiento de separación de objetos, que comprende:

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que los objetos son biomoléculas.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que los objetos son proteínas.

5. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que los objetos son fragmentos de ADN o ARN.

6. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que los objetos son células biológicas.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los objetos son moléculas de gas o vapor.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende el control del desplazamiento de los objetos variando la velocidad angular a la cual se hace girar el canal.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende el control del desplazamiento de los objetos controlando el primer y el segundo voltajes aplicados respectivamente en un primer extremo del canal y en un segundo extremo.

10. Procedimiento según la reivindicación 8 ó 9, en el que el desplazamiento de los objetos está controlado para trasladar un objeto de interés hasta un punto de recogida desde el cual podrá recuperarse para realizar un posterior estudio.

11. Rotor de espectrómetro (10) para su utilización en un espectrómetro adaptado para la separación de objetos, presentando el rotor (10) un eje de rotación (34) y comprendiendo:

de tal manera que, cuando se hace girar el rotor alrededor del eje de rotación, los objetos situados dentro de la cavidad (60) se desplazan y se separan bajo la influencia combinada de la fuerza centrífuga y el campo eléctrico, hacia unos respectivos puntos de equilibrio en los cuales la fuerza centrífuga es igual a una fuerza opuesta debida al campo eléctrico.

12. Rotor de espectrómetro (10), para su utilización en un espectrómetro adaptado para la separación de objetos, presentando el rotor (10) un eje de rotación (34) y comprendiendo:

de tal manera que, cuando se hace girar el rotor alrededor del eje de rotación (34), los objetos situados en el interior de la cavidad (12) se desplazan y se separan bajo la influencia combinada de la fuerza centrífuga y del campo eléctrico, hacia unos respectivos puntos de equilibrio en los cuales la fuerza centrífuga es igual a una fuerza opuesta debida al campo eléctrico.

13. Rotor de espectrómetro según la reivindicación 12, en el que la cavidad comprende un canal de separación de lados paralelos y una zona de tampón de anchura variable, estando dispuesto el canal de separación, en funcionamiento, para recibir los objetos que se van a separar.

14. Rotor de espectrómetro según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que la cavidad está definida en el interior de un cuerpo de rotor en forma de disco.

15. Rotor de espectrómetro según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, que comprende un punto de recogida en la cavidad, desde el cual se pueden recoger los objetos separados seleccionados.

16. Rotor de espectrómetro según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 14 ó 15 cuando están subordinadas a la reivindicación 11, en el que la cavidad está dispuesta para recibir los objetos que se van a separar en el interior de un tampón líquido o gaseoso.

17. Rotor de espectrómetro según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 14 a 16 cuando están subordinadas a la reivindicación 11, en el que la cavidad delimita una cavidad de vacío.

18. Espectrómetro que comprende un rotor de espectrómetro (10) según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17 en combinación con un motor (118) y un dispositivo de control del motor (116) para controlar la velocidad angular del rotor.

19. Espectrómetro según la reivindicación 18, que comprende unos medios (112, 114) para generar y controlar el campo eléctrico.

20. Espectrómetro según la reivindicación 19, que comprende un controlador (110) para controlar simultáneamente tanto la velocidad angular del rotor como el campo eléctrico.

21. Espectrómetro según la reivindicación 19, cuando está subordinada a la reivindicación 12, que comprende unos medios para aplicar unos voltajes definidos por el usuario tanto al primer como al segundo electrodos.

22. Espectrómetro según la reivindicación 21, que comprende un controlador para controlar de manera simultánea el primer y el segundo voltajes y la velocidad angular del rotor.