ENSAYO PARA DETERMINAR LA ACTIVIDAD DE TOXINA CLOSTRIDIAL COMBINANDO FRET Y POLARIZACION DE FLUORESCENCIA.
Un procedimiento para determinar la presencia o actividad de una toxina clostridial,
que comprende las etapas de:
(a)tratamiento con una muestra, en condiciones adecuadas para la actividad proteasa de la toxina clostridial, un sustrato de toxina clostridial, comprendiendo dicho sustrato de toxina clostridial
(i)un fluoróforo donante;
(ii)un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que solapa con el espectro de emisión de dicho fluoróforo donante; y
(iii)un péptido o peptidomimético que comprende una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que comprende un sitio de escisión, en el que dicho sitio de escisión se interpone entre dicho fluoróforo donante y dicho aceptor y en el que, en las condiciones apropiadas, se muestra transferencia resonante de energía entre dicho fluoróforo donante y dicho aceptor;
en el que la escisión de dicho sustrato de toxina clostridial da como resultado un cambio en polarización de fluorescencia de al menos 3 unidades de milipolarización (mP);
(b)excitación de dicho fluoróforo donante con luz polarizada plana; y
(c)determinación de la polarización de fluorescencia de dicho sustrato tratado con relación a un sustrato control,
en la que un cambio en la polarización de fluorescencia de al menos 3 mP de dicho sustrato tratado en comparación con dicho sustrato control es indicativo de la presencia o actividad de dicha toxina clostridial en dicha muestra
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2005/032328.
Solicitante: ALLERGAN, INC..
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 2525 DUPONT DRIVE,IRVINE CA 92612.
Inventor/es: AOKI, KEI, ROGER, STEWARD,LANCE,E, GILMORE,MARCELLA,A, WILLIAMS,DUDLEY,J, VERHAGEN,MARC.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 23 de Junio de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N9/52 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › que provienen de bacterias.
- C12Q1/37 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › peptidasa o proteinasa.
- G01N33/542 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › con inhibición estérica o modificación de la señal, p. ej. extinción de fluorescencia.
Clasificación PCT:
- G01N33/536 G01N 33/00 […] › con formación de un complejo inmunológico en fase líquida.
- G01N33/542 G01N 33/00 […] › con inhibición estérica o modificación de la señal, p. ej. extinción de fluorescencia.
Fragmento de la descripción:
Ensayo para determinar la actividad de toxina clostridial combinando FRET y polarización de fluorescencia.
La presente invención se refiere de forma general a ensayos de proteasa, y más específicamente, a procedimientos para determinar la presencia o actividad de toxinas clostridiales tales como toxinas botulínicas y toxinas del tétanos usando polarización de fluorescencia.
Neurotoxinas producidas por bacterias del género Clostridium causan el síndrome neuroparalítico del tétanos y la enfermedad rara pero potencialmente fatal, botulismo. Estas neurotoxinas clostridiales son venenos altamente potentes y específicos de células neurales, con la dosis letal para humanos de las toxinas botulínicas en el orden de los nanogramos. Así pues, la presencia de incluso niveles mínimos de toxinas botulínicas en alimentos representa un peligro para la salud pública que debe evitarse mediante ensayos rigurosos.
Sin embargo, a pesar de sus potenciales efectos deletéreos, se han usado bajas dosis controladas de neurotoxinas botulínicas de manera exitosa como terapias y para algunas aplicaciones cosméticas. En particular, las toxinas botulínicas se han usado en el tratamiento terapéutico de una diversidad de distonías focales y segmentales, estrabismo y otras condiciones en las que se desea una depresión reversible de la actividad terminal del nervio colinérgico. Los usos terapéuticos establecidos de las neurotoxinas botulínicas en humanos incluyen, sin limitación, tratamiento de blefaroespasmo, espasmo hemifacial, distonía laringea, hiperhidrosis focal, hipersalivación, distonía oromandibular, distonía cervical, tortícolis, estrabismo, distonía de las extremidades, calambres ocupacionales y mioquimia (Rossetto y col., Toxicon 39:27-41 (2001)). Por ejemplo, la inyección intramuscular de tejido espástico con pequeñas cantidades de neurotoxina botulínica A se ha usado eficazmente para tratar la espasticidad debida a lesión cerebral, lesión de la médula espinal, apoplejía, esclerosis múltiple y parálisis cerebral. Otros posibles usos clínicos de las neurotoxinas clostridiales están siendo investigados actualmente.
Dado el peligro potencial asociado con pequeñas cantidades de toxinas botulínicas en alimentos y la necesidad de preparar formulaciones farmacéuticas precisas, se emplean actualmente ensayos para neurotoxinas botulínicas en las industrias alimentaria y farmacéutica. La industria alimentaria requiere ensayos para las neurotoxinas botulínicas para validar nuevos procedimientos de empaquetamiento de alimentos y para asegurar la seguridad de la comida. El creciente uso clínico de las toxinas botulínicas necesita de ensayos precisos para la actividad de la neurotoxina botulínica para la formulación de productos así como el control de calidad. En ambas industrias, un ensayo de letalidad en ratones es actualmente el único ensayo aceptable para la potencia de la neurotoxina botulínica.
Desafortunadamente, el ensayo de letalidad en ratones sufre de diversos inconvenientes: coste debido al gran número de animales de laboratorio requerido; falta de especificidad; imprecisión potencial a no ser que se usen grandes grupos de animales; y sacrificio de vida animal. Así pues, existe una necesidad para nuevos procedimientos basados en sustratos sintéticos convenientes que puedan complementar y reducir la necesidad del ensayo de letalidad en ratón. La presente invención satisface esta necesidad proporcionando nuevos ensayos para determinar la presencia o actividad de una toxina clostridial y proporciona además ventajas relacionadas.
Se desvela un procedimiento para determinar la presencia o actividad de una toxina clostridial mediante (a) el tratamiento con una muestra, en condiciones adecuadas para la actividad proteasa de la toxina clostridial, un sustrato de la toxina clostridial que incluye un fluoróforo; un grupo formador de volumen y una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que contiene un sitio de escisión que se interpone entre el fluoróforo y el grupo formador de volumen; (b) la excitación del fluoróforo con luz polarizada plana; y (c) la determinación de polarización de fluorescencia del sustrato tratado con relación a un sustrato control en el que un cambio de la polarización de fluorescencia del sustrato tratado se compara con la polarización de fluorescencia del sustrato control es indicativa de la presencia o actividad de la toxina clostridial.
La presente invención proporciona un procedimiento para determinar la presencia o actividad de una toxina clostridial mediante (a) el tratamiento con una muestra, en condiciones adecuadas para la actividad proteasa de la toxina clostridial, de un sustrato de toxina clostridial que contiene (i) un fluoróforo donante; (ii) un aceptor que tiene un espectro de absorción que solapa con el espectro de emisión del fluoróforo donante; y (iii) una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que contiene un sitio de escisión, en la que el sitio de escisión se interpone entre el fluoróforo donante y el aceptor y en la que, en las condiciones apropiadas se muestra transferencia resonante de energía entre el fluoróforo donante y el aceptor; (b) la excitación del fluoróforo donante con luz polarizada plana; y (c) la determinación de polarización de fluorescencia de al menos 3 mP de dicho sustrato tratado con relación a un sustrato control, en el que un cambio en la polarización de fluorescencia de la sustancia tratada al compararse con la polarización de fluorescencia del sustrato control es indicativo de la presencia o actividad de la toxina clostridial.
El documento WO 03/020948 desvela un procedimiento para determinar la presencia o actividad de una toxina clostridial usando un sustrato que comprende un fluoróforo donante, un aceptor y una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial.
El documento WO 02/25284 desvela ensayos de alto rendimiento para las actividades proteolíticas de las neurotoxinas clostridiales usando sustratos FRET.
El documento US 2001/046668 desvela un procedimiento para la determinación de la actividad de proteasas usando ensayos de polarización de fluorescencia para proteasas virales.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra un diagrama de las cuatro etapas requeridas para la actividad de toxina del tétanos y botulínica en las neuronas centrales y periféricas.
La figura 2 muestra la localización subcelular y los sitios de escisión de SNAP-25, VAMP y sintaxina. VAMP se une a la membrana de la vesícula sináptica, mientras que SNAP-25 y sintaxina se unen a la membrana plasmática diana. BoNT/A y /E escinden SNAP-25 cerca del extremo carboxiterminal, liberando nueve o 26 restos, respectivamente. BoNT/B, /D, /F, /G y TeNT actúan en la porción central conservada de VAMP (punteada) y liberan la porción aminoterminal de VAMP al citosol. BoNT/C1 escinde SNAP-25 cerca del extremo carboxi-terminal así como corta la sintaxina en un sitio único cerca de la superficie de la membrana citosólica. La acción de BoNT/B, /C1, /D, /F, /G y TeNT da como resultado la liberación de una porción grande del dominio citosólico de VAMP o sintaxina, mientras que sólo una pequeña porción de SNAP-25 se libera por proteólisis selectiva de BoNT/A, /C1 o /E.
La figura 3 muestra un alineamiento de varias proteínas SNAP-25. SNAF-25 Humana (SEC ID Nº 1; acceso GenBank g4507099; véase, también, secuencia SNAP-25 humana relacionada g2135800); SNAP-25 de ratón (SEC ID Nº 2; acceso GenBank G6755588); SNAP-25 de Drosophila (SEC ID Nº 3; acceso GenBank G548941); SNAP-25 de carpa dorada (SEC ID Nº 4; acceso GenBank g2133923); SNAP-25 de erizo de mar (SEC ID Nº 5; acceso GenBank g2707818) y SNAP-25 de pollo (SEC ID Nº 6; acceso GenBank g481202) se representan.
La figura 4 muestra un alineamiento de varias proteínas VAMP. Se representan la VAMP-1 humana (SEC ID Nº 7; acceso GenBank g135093); VAMP-2 humana (SEC ID Nº 8; acceso GenBank g135094); VAMP-2 de ratón (SEC ID Nº 9; acceso GenBank g2501081); VAMP bovina (SEC ID Nº 10; acceso GenBank g89782); VAMP de rana (SEC ID Nº 11; acceso GenBank g6094391); y VAMP de erizo de mar (SEC ID Nº 12; acceso GenBank g5031415).
La figura 5 muestra un alineamiento de varias proteínas de sintaxina. Se representan la sintaxina 1A humana (SEC ID Nº 13; acceso GenBank g15079184), sintaxina 1B2 humana (SEC ID Nº 14; acceso GenBank g15072437), sintaxina 1A de ratón (SEC ID Nº 15; acceso GenBank g15011853), sintaxina 1A de Drosophila (SEC ID Nº 16; acceso GenBank g2501095); sintaxina A de C. elegans (SEC ID Nº 17; acceso GenBank g7511662)...
Reivindicaciones:
1. Un procedimiento para determinar la presencia o actividad de una toxina clostridial, que comprende las etapas de:
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho cambio en la polarización de fluorescencia es un aumento en la polarización de fluorescencia.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho fluoróforo donante tiene un tiempo de vida de fluorescencia de al menos 0,5 nanosegundos, al menos 5 nanosegundos, o al menos 10 nanosegundos.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho fluoróforo donante se selecciona del grupo de proteína verde fluorescente, proteína azul fluorescente, proteína cian fluorescente, proteína amarilla fluorescente y proteína roja fluorescente, una fluoresceína o un derivado de fluoresceína, una rodamina o un derivado de rodamina, y una cianina o un derivado de cianina.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho aceptor se selecciona del grupo de Alexa Fluor® 546; Alexa Fluor® 568; Alexa Fluor® 610; Alexa Fluor® 660; Alexa Fluor® 750; QSY®7; tetrametilrodamina, octadecilrodamina; flavodoxina, citocromo c peroxidasa; y rubredoxina.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de reconocimiento es una secuencia de reconocimiento BoNT/A, una secuencia de reconocimiento BoNT/B, una secuencia de reconocimiento BoNT/C1, una secuencia de reconocimiento BoNT/D, una secuencia de reconocimiento BoNT/E, una secuencia de reconocimiento BoNT/F, o una secuencia de reconocimiento BoNT/G.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de reconocimiento es una secuencia de reconocimiento TeNT.
8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho sustrato de toxina clostridial comprende un péptido o peptidomimético que tiene al menos 100 restos, al menos 200 restos, al menos 300 restos, al menos 400 restos, al menos 500 restos, al menos 600 restos, al menos 700 restos, al menos 800 restos, o al menos 900 restos.
9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho sustrato de toxina clostridial comprende un péptido o peptidomimético que tiene como máximo 20 restos, como máximo 40 restos, como máximo 50 restos, como máximo 100 restos, como máximo 150 restos, como máximo 200 restos, como máximo 300 restos, o como máximo 400 restos.
10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha muestra es un lisado celular en bruto, una toxina clostridial aislada, una cadena ligera de toxina clostridial aislada, o un producto de toxina clostridial formulado.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicho producto de toxina clostridial formulado es un producto de BoNT/A formulado, un producto de BoNT/B formulado, un producto de BoNT/C1 formulado, un producto de BoNT/D formulado, un producto de BoNT/E formulado, un producto de BoNT/F formulado, un producto de BoNT/G formulado o un producto de TeNT formulado.
12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho cambio de polarización de fluorescencia de dicho sustrato tratado en la etapa (c) es de al menos 5 mP en comparación con dicho sustrato control, siendo dicho cambio de polarización de fluorescencia indicativo de la presencia o actividad de dicha toxina clostridial en dicha muestra, o al menos de 15 mP en comparación con dicho sustrato control, siendo dicho cambio de polarización de fluorescencia indicativo de la presencia o actividad de dicha toxina clostridial en dicha muestra.
13. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho cambio de polarización de fluorescencia de dicho sustrato tratado en la etapa (c) comprende la determinación del cambio de polarización de fluorescencia de dicho sustrato tratado a lo largo del tiempo, siendo dicho cambio de polarización a lo largo del tiempo indicativo de la presencia o actividad de dicha toxina clostridial en dicha muestra.
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