Un método para realizar la electroporación de una célula biológica de una manera controlada,

que comprende:

(a) colocar una célula biológica en un medio eléctricamente conductor y aplicar un voltaje a través del medio;

(b) detectar continuamente la proporción de la corriente eléctrica a través del medio frente al voltaje a través del medio; y

(c) ajustar la magnitud del voltaje aplicado de acuerdo con cambios en la proporción de corriente frente a voltaje detectados para conseguir un grado de electroporación controlado de la célula biológica;

en el que un aumento en la proporción de corriente frente a voltaje a través de una célula biológica se produce cuando la membrana celular se hace permeable debido a la formación de poros, daño celular u otros modos de formación de poros en la membrana

Electroporación controlada.

Campo de la invención

Esta invención se refiere al campo de la electroporación y transferencia de masa a través de las membranas celulares en general y al transporte de iones a través de una membrana celular en particular.

Antecedentes de la invención

La electroporación es una técnica que se usa para introducir especies químicas en células biológicas y se realiza exponiendo las células a un potencial eléctrico que atraviesa la membrana celular. Aunque su mecanismo no se comprende por completo, se piensa que la electroporación implica la degradación de la bicapa lipídica de la membrana celular conduciendo a la formación de poros transitorios o permanentes en la membrana que permite que las especies químicas entren en la célula por difusión. El potencial eléctrico se aplica típicamente en impulsos y tanto si la formación de poros es reversible como irreversible depende de parámetros tales como la amplitud, longitud, forma y velocidad de repetición de los impulsos, además del tipo y etapa de desarrollo de la célula. Como un método de introducción de especies químicas en las células, la electroporación ofrece numerosas ventajas: es simple de usar; puede usarse para tratar poblaciones enteras de células simultáneamente; puede usarse para introducir esencialmente cualquier macromolécula en una célula; puede usarse con una amplia diversidad de líneas celulares primarias o establecidas y es particularmente eficaz con determinadas líneas celulares; y puede usarse tanto en células procariotas como eucariotas sin modificaciones o adaptaciones importantes para el tipo de célula y origen. La electroporación se usa actualmente en células en suspensión o en cultivo, así como en tejidos y órganos.

La electroporación se realiza actualmente colocando una o más células, en suspensión o en tejidos, entre dos electrodos conectados a un generador que emite impulsos de un campo eléctrico de alto voltaje. La formación de poros o permeabilización de la membrana se produce en los polos de la célula que son los sitios en las membranas celulares que orientan directamente los electrodos y por tanto los sitios en los que el potencial de transmembrana es mayor. Desgraciadamente, el grado de permeabilización que se produce en la electroporación varía con el tipo de célula y también varía entre células de una población determinada. Además, como el procedimiento se realiza en grandes poblaciones de células cuyas propiedades varían entre las células individuales en la población, las condiciones de electroporación únicamente pueden seleccionarse para tratar las cualidades promedio de la población celular; el procedimiento practicado actualmente no puede adaptarse a las características específicas de células individuales. Un asunto particular es que en determinadas condiciones, el potencial eléctrico es demasiado bajo para que una membrana celular se haga permeable, mientras que en otras condiciones la electroporación puede inducir la formación irreversible de poros y la muerte celular. Un campo eléctrico elevado, por ejemplo, puede producir así un aumento de la eficacia de transfección en una parte de una población celular causando al mismo tiempo la muerte celular en otra. Un problema adicional con los métodos de electroporación conocidos es que la eficacia de la transfección por electroporación a veces puede ser baja. En el caso del ADN, por ejemplo, para conseguir la transformación eficaz de la célula se necesita una gran cantidad de ADN en el medio circundante.

Muchos de los problemas identificados anteriormente son una consecuencia del hecho de que el proceso de electroporación tanto en células individuales como en tejidos no puede controlarse en tiempo real. Actualmente no existen medios para determinar en tiempo real cuándo una célula entra en un estado de electroporación. Como resultado, la consecuencia de un protocolo de electroporación únicamente puede determinarse mediante las consecuencias eventuales de los procesos de transferencia de masa y su efecto en la célula. Esto sucede mucho tiempo después de haberse producido la transferencia de masa bajo electroporación. La presente invención considera estos y otros defectos de los métodos actuales de electroporación.

También relevante para la presente invención son las técnicas actuales para el estudio y control de transferencia de masa a través de las membranas celulares. El conocimiento de la transferencia de masa a través de las membranas celulares en la naturaleza, tanto en células que funcionan normalmente como en células enfermas, es valioso en el estudio de determinadas enfermedades. Además, la capacidad para modificar y controlar la transferencia de masa a través de las membranas celulares es una herramienta útil para realizar investigación y terapia en la biotecnología y la medicina moderna. La introducción o eliminación de especies químicas tales como ADN o proteínas de la célula para controlar la función, fisiología o comportamiento de la célula proporcionan información valiosa con respecto a los procesos fisiológicos normales y anómalos de la célula.

El método más común para efectuar y estudiar la transferencia de masa a través de una membrana celular es poner la célula en contacto con una solución que contiene el compuesto que va a transportarse a través de la membrana, con o sin electroporación. Este método de transferencia masivo no permite controlar o medir con precisión la transferencia de masa a través de la membrana. La composición de la disolución en sitios específicos no se conoce y es variable. Además, cuando un campo eléctrico está presente, la intensidad local del campo variará de un punto al otro. Adicionalmente, la superficie de la célula que se expone a la solución no está bien definida. Las áreas superficiales celulares varían entre células en una determinada población y esto conduce a diferencias significativas entre las células en la cantidad de transferencia de masa. Debido a estas razones, la cantidad de transferencia de masa conseguida por procesos de transferencia en masa no es uniforme entre las células y la cantidad real transferida para cualquier célula particular no puede determinarse.

Hasta ahora los intentos realizados para superar las limitaciones de las técnicas de transferencia en masa incluyen técnicas para tratar células individuales que incluyen la inyección mecánica (microinyección) de los compuestos químicos a través de la membrana celular o la electroporación con microelectrodos. En las técnicas de inyección, una aguja penetra en la membrana para suministrar un agente químico, localizando la aplicación del agente químico en una región pequeña cercana al punto de inyección. Esto requiere manipular la célula con la mano humana, una técnica que es difícil de realizar, laboriosa y no reproducible fácilmente. La electroporación con microelectrodos experimenta estos problemas así como la carencia de cualquier medio para detectar el inicio de electroporación en una célula individual. La presente invención también considera estos problemas.

El documento US-A-4 946 793 describe un dispositivo para modificar membranas vesiculares y que puede usarse para modificar las mismas membranas usando el ajuste de impedancia. Vesículas tales como células se someten a múltiples impulsos cuando las células están presentes en una suspensión para modificar las membranas celulares de una manera que hace que las células sean más susceptibles a la fusión de materiales exógenos.

El documento US-A-5 134 070 describe un dispositivo y un método para cultivar células en un electrodo. Un cultivo monocapa de células se somete a un campo eléctrico y las células pueden estar presentes en un disco de cultivo que puede ser eléctricamente conductor. Se usa un electrodo metálico para someter a las células a un campo eléctrico intermitente o continuo que ayuda transfectando las células con materiales exógenos.

Sumario de la invención

De acuerdo con la presente invención se proporciona un método para realizar la electroporación en una célula biológica de una manera controlada, que comprende:

1. Un método para realizar la electroporación de una célula biológica de una manera controlada, que comprende:

(a) colocar una célula biológica en un medio eléctricamente conductor y aplicar un voltaje a través del medio;

(b) detectar continuamente la proporción de la corriente eléctrica a través del medio frente al voltaje a través del medio; y

(c) ajustar la magnitud del voltaje aplicado de acuerdo con cambios en la proporción de corriente frente a voltaje detectados para conseguir un grado de electroporación controlado de la célula biológica;

en el que un aumento en la proporción de corriente frente a voltaje a través de una célula biológica se produce cuando la membrana celular se hace permeable debido a la formación de poros, daño celular u otros modos de formación de poros en la membrana.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la etapa (b) comprende detectar continuamente la proporción de corriente frente a voltaje como una indicación de la electroporación de la célula biológica y la etapa (c) comprende ajustar la duración del voltaje aplicado de acuerdo con la proporción de corriente frente a voltaje para conseguir una cantidad específica deseada de electroporación.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que se coloca una pluralidad de células biológicas en el medio eléctricamente conductor y se establece el promedio de la proporción de corriente frente a voltaje sobre la pluralidad de las células biológicas, consiguiendo por lo tanto un grado promediado controlado de electroporación en la pluralidad de células biológicas.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que se aplica voltaje entre dos microelectrodos y la célula biológica se coloca entre los microelectrodos.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que:

el voltaje se aplica entre dos electrodos en un canal a través de flujo, los electrodos se colocan para aplicar el voltaje en una dirección transversal para fluir a través del canal;

la etapa (a) comprende suspender la célula biológica en el medio y hacer pasar continuamente el medio a través del canal;

la etapa (b) comprende adicionalmente correlacionar la proporción de corriente frente a voltaje con la presencia de la célula biológica entre los electrodos; y

la etapa (c) comprende ajustar la magnitud del voltaje mientras la célula biológica está entre los electrodos.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5 que comprende suspender una pluralidad de células biológicas en el medio eléctricamente conductor y hacer pasar continuamente el medio a través del canal de tal manera que a través de los electrodos pasa aproximadamente una célula a la vez.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la detección continuada en (b) proporciona una indicación del grado de electroporación en el tejido biológico y en el que adicionalmente el ajuste en (c) proporciona un grado de electroporación controlado en el tejido biológico.