Procedimiento para el desanclaje/desprotección de compuestos sintetizados por fase sólida.

Se preparan compuestos orgánicos por el método de la fase sólida mediante el desanclaje/desprotección de un compuesto directamente unido sin espaciadores bifuncionales ("linkers") a resinas funcionalizadas que comprenden poliestireno, por tratamiento de dicho compuesto unido a la resina con una mezcla reactiva acidolítica que comprende ácido trifluoroacético y al menos un silano de fórmula HnSiRmXy (I), donde R es un radical que se selecciona del grupo que consiste en (C{sub,1}-C{sub,4})-alquilo y fenilo; X es independientemente seleccionado entre CI, Br, I y trifluorometansulfonato; n, m, e y son números enteros que se seleccionan independientemente entre 0 y 4 con la condición de que n + m + y = 4; en ausencia de bases de Lewis. Este procedimiento es especialmente útil para el desanclaje/desprotección de péptidos de resina funcionalizadas, en particular péptidos amida o péptidos ácido preparados por la estrategia Fmoc / tBu

Procedimiento para el desanclaje/desprotección de compuestos sintetizados por fase sólida.

La presente invención está relacionada con un procedimiento mejorado para la preparación de compuestos orgánicos por un método en fase sólida sin usar espaciadores bifuncionales ("linkers", i.e. espaciadores que están anclados a una resina). Más particularmente, la invención está relacionada con el desanclaje/desprotección de un péptido de un soporte que es una resina funcionalizada.

Estado de la técnica anterior

Los fármacos peptídicos representan un mercado de aproximadamente 1000 millones de dólares estadounidenses y alrededor del 1% del total de ventas de principios activos farmacéuticos, con un crecimiento anual del 10-15%. En la actualidad, hay más de cuarenta péptidos sintéticos en el mercado y más de 500 moléculas peptídicas nuevas se encuentran en desarrollo, con más de 250 en fase clínica.

Los péptidos pueden sintetizarse tanto por métodos químicos como por métodos recombinantes. La síntesis química por fase sólida ha demostrado ser una metodología efectiva para la preparación de péptidos, tanto a escala de miligramos para propósitos de investigación como a escala de toneladas para la producción de fármacos. Los péptidos de tamaño medio (10-40 aminoácidos) se preparan satisfactoriamente por técnicas de fase sólida. La síntesis en fase sólida también se puede utilizar como un método efectivo para la preparación de otras muchas moléculas orgánicas, incluyendo la preparación de bibliotecas combinatorias.

Existen dos estrategias de protección principales para la síntesis en fase sólida de péptidos, a saber, Boc/Bn y Fmoc/^tBu. Dado que la metodologia Boc/Bn requiere el uso de condiciones acidolíticas enérgicas para desanclar el péptido final del soporte sólido (habitualmente HF anhidro), la estrategia Fmoc/^tBu es la más usada con diferencia tanto a escala de laboratorio como a escala de producción. La síntesis Fmoc/^tBu implica condiciones acidolíticas suaves y un tratamiento sencillo con ácido trifluoroacético (TFA, "trifluoroacetic acid"), que es suficiente para eliminar los grupos protectores de las cadenas laterales de los aminoácidos y obtener el péptido libre en solución. Para alcanzar buenos resultados durante el proceso de desanclaje/desprotección con dichas condiciones acidolíticas, la función carboxilo del primer aminoácido del péptido no se ancla directamente al polímero funcionalizado sino a unas moléculas intermedias especiales denominadas espaciadores bifuncionales ("linkers").

Los espaciadores bifuncionales son compuestos bifuncionales que se unen a la resina por medio de un enlace estable con uno de los grupos funcionales mientras que el grupo funcional restante sirve para anclar el primer aminoácido del péptido a sintetizar por medio de un enlace (generalmente un enlace éster o un enlace amida) que es lábil a las condiciones de desanclaje/desprotección deseadas. Dependiendo de la reactividad de dicho enlace se pueden emplear distintas condiciones de reacción para desanclar/desproteger el péptido de la resina tales como la acidolisis suave, la eliminación por bases o el desplazamiento nucleófilo.

Los espaciadores bifuncionales más comunes son alcoholes bencílicos y aminas bencílicas o bencidrílicas, que permiten obtener los péptidos en forma de ácidos o amidas normalmente con elevado rendimiento y pureza. La estrategia de protección Fmoc/^tBu es generalmente la de elección, como se ha dicho anteriormente. Sin embargo, el hecho de que los espaciadores bifuncionales sean caros incrementa considerablemente los costes de producción de los péptidos.

Se conocen varios reactivos de acidólisis basados en el ácido trifluoroacético para escindir péptidos de resinas. Yajima et al. describieron un proceso para la desprotección de grupos protectores de tipo bencilo usando una combinación de ácido trifluoroacético, trifluorometanosulfonato de trimetilsililo, que actúa como un superácido fuerte en la desprotección, y tioanisol, que actúa como base blanda en la reacción de desprotección (cf. "New strategy for the chemical synthesis of proteins", Tetrahedron 1988, vol. 44, pp. 805-819). El tioanisol también actúa como capturador para reducir las reacciones secundarias y como acelerador de la desprotección. Según el mecanismo de reacción descrito en el artículo de Yahima, aparentemente la desprotección tiene lugar por medio de un mecanismo de tipo empujar y salir ("push and pull"). Generalmente, se forma una sal de sulfonio como subproducto principal.

Posteriormente, otros autores han aplicado el método de Yahima para la preparación de péptidos por el método de fase sólida. De acuerdo con las enseñanzas de Yahima, el tioanisol se mantiene en las mezclas acidolíticas usadas para el desanclaje/desprotección del péptido de un soporte sólido. Así, Hughes et al. describieron el desanclaje/desprotección de péptidos de una resina metilbencidrilamina (MBHA) usando una combinación de bromotrimetilsilano, tioanisol y ácido trifluoroacético (cf. "Cleavage deprotection of peptides from MBHA-resin with bromotrimethylsilane", Tetrahedron letters 1993, vol. 34, pp. 7713-7716). Patteux et al. también usaron la mezcla acidolítica de Yahima compuesta por ácido trifluoroacético, trifluorometanosulfonato de trimetilsililo y tioanisol para desanclar/desproteger un péptido quinolina anclado a una resina Merrifield por medio de un enlace éter (cf. "Solid phase synthesis of a redox delivery system with the aim of targeting peptides into the brain", Org. Biomol. Chem. 2006, vol. 4, pp. 8177-825).

Desafortunadamente, el uso de bases blandas en los reactivos da lugar a mezclas complejas y conlleva problemas de aislamiento ("work-up") y dificultades en el proceso de purificación posterior. En particular, el tioanisol posee un alto punto de ebullición y presenta un olor muy malo que es difícil de eliminar completamente, especialmente en instalaciones industriales. Además, la sal de sulfonio del tioanisol es de difícil eliminación cuando se genera (especialmente en péptidos protegidos con bencilos).

A pesar de las enseñanzas de todos estos documentos del estado de la técnica, la investigación de nuevos procesos para la preparación de péptidos y otros compuestos orgánicos a escala comercial por el método de fase sólida es aún un campo activo, puesto que la explotación industrial de los procedimientos conocidos es difícil a escala industrial o presenta costes elevados. Así, es deseable proporcionar nuevos procedimientos de preparación de péptidos u otros compuestos orgánicos en fase sólida.

Explicación de la invención

Los inventores han encontrado que las resinas de poliestireno tradicionales en la síntesis en fase sólida, tales como la 4-metilbencidrilamina o el hidroximetilpoliestireno, son inesperadamente lábiles a los alquilsilanos en presencia de un ácido prótico. Este hecho permite la síntesis en fase sólida de compuestos sin la necesidad de utilizar espaciadores bifuncionales, ya que los compuestos se pueden desanclar/desproteger de manera sencilla de las resinas utilizando alquilsilanos en presencia de un ácido prótico, sin ser necesaria la presencia de bases blandas como el tioanisol, reduciendose así la complejidad de los procesos de desanclaje/desprotección, así como de purificación. En particular, la ausencia de tioanisol no sólo facilita el procedimiento para aislar el péptido ("work-up") sino que también proporciona un péptido con pureza elevada y rendimiento alto.

Así, un aspecto de la presente invención es el proporcionar un procedimiento para la preparación de un compuesto orgánico por el método de síntesis en fase sólida, que comprende el desanclaje/desprotección del compuesto directamente unido sin espaciadores bifuncionales a una resina funcionalizada que comprende poliestireno, por tratamiento del compuesto unido a la resina con una mezcla reactiva acidolítica que comprende al menos un ácido prótico y un ácido de Lewis, donde dicha mezcla se usa en ausencia de una base de Lewis. Una base de Lewis es un compuesto con un par de electrones disponible, sea no compartido o en un orbital p. Ésta actúa como donadora de electrones. Ejemplos de bases de Lewis incluyen sulfuros tal como el tioanisol o el sulfuro de dimetilo; éteres tal como el anisol; fenoles tal como el cresol; aminas, agua o tioles.

Por "resina funcionalizada que comprende poliestireno" se entiende un soporte polimérico adecuado para síntesis en fase sólida que tiene...

1. Procedimiento para la preparación de un compuesto orgánico por el método de fase sólida, que comprende el desanclaje/desprotección del compuesto directamente unido sin espaciadores bifuncionales a una resina funcionalizada que comprende poliestireno, por tratamiento del compuesto unido a la resina con una mezcla reactiva acidolítica que comprende al menos un ácido prótico y un ácido de Lewis, caracterizado en que dicha mezcla reactiva se usa en ausencia de una base de Lewis.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, donde la mezcla reactiva acidolítica comprende ácido trifluoroacético y al menos un compuesto de fórmula (I):

(I)H_nSiR_mX_y

donde:

R es un radical seleccionado del grupo que consiste en (C₁-C₄)-alquilo y fenilo;

X es independientemente seleccionado del grupo que consiste en Cl, Br, I y un sulfonato de fórmula -OSO₂R₁ donde R₁ se selecciona del grupo que consiste en CF₃, (C₁-C₄)-alquilo, fenilo, y fenilo que está mono- o disustituido por un sustituyente seleccionado entre (C₁-C₄)-alquilo, Cl, Br y I; y

n, m, e y son números enteros independientemente seleccionados entre 0 y 4, con la condición de que n + m + y = 4.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, donde la mezcla reactiva acidolítica comprende ácido trifluoroacético, haluro de hidrógeno y al menos un compuesto de fórmula (I), donde, opcionalmente, el haluro de hidrógeno y el compuesto de fórmula (I) son generados in situ por reacción de un halógeno con un compuesto de fórmula (II):

(II)H_(n+z)SiR_mX_(y-z)

donde:

R es un radical seleccionado entre el grupo que consiste en (C₁-C₄)-alquilo y fenilo;

X es independientemente seleccionado del grupo que consiste en Cl, Br, I y un sulfonato de fórmula -OSO₂R₁ donde R₁ se selecciona del grupo que consiste en CF₃, (C₁-C₄)-alquilo, fenilo y fenilo que está mono- o disustituido por un radical seleccionado entre (C₁-C₄)-alquilo, Cl, Br y I;

n, m e y son números enteros seleccionados independientemente de 0 a 4; y

z es un entero seleccionado entre 1-4;

con la condición de que n + m + y = 4 y z =q y.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el compuesto orgánico es un compuesto de tipo peptídico.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, donde el compuesto de tipo peptídico es un péptido amida o un péptido ácido.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4-5, donde el compuesto de tipo peptídico se obtiene por el método de fase sólida usando una estrategia de protección Fmoc/^tBu.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde la resina funcionalizada que comprende poliestireno se selecciona entre el grupo que consiste en el hidroximetilpoliestireno, la metilbencidrilamina y la resina Merrifield.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, donde la resina es metilbencidrilamina.

9. Procedimiento según la reivindicación 2, donde se usa una mezcla reactiva acidolítica que consiste en ácido trifluoroacético y de uno a cuatro compuestos de fórmula (I).

10. Procedimiento según la reivindicación 9, donde la mezcla reactiva acidolítica contiene bromuro de hidrógeno.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde en la fórmula (I) R es isopropilo o etilo.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde en la fórmula (I) X se selecciona del grupo que consiste en Cl, Br y I.

13. El procedimiento según la reivindicación 11, donde la mezcla reactiva acidolítica es una mezcla que consiste en:

(a) ácido trifluoroacético; y

(b) un compuesto de fórmula (I) con n = 1, m = 3 e y = 0, donde R se selecciona del grupo que consiste en etilo e isopropilo.

14. Procedimiento según la reivindicación 11, donde la mezcla reactiva acidolítica es una mezcla que consiste en:

(a) ácido trifluoroacético;

(b) un compuesto de fórmula (I) con n = 1, m = 3 e y = 0, donde R se selecciona entre etilo o isopropilo; y

(c) un compuesto de fórmula (I) con n = 0, m = 3, y = 1 y X = C1, donde R es metilo.

15. Procedimiento según la reivindicación 11, donde la mezcla reactiva acidolítica es una mezcla que consiste en:

(a) ácido trifluoroacético;

(b) bromuro de hidrógeno;

(c) trietilsilano; y

(d) clorotrimetilsilano.

16. Procedimiento según la reivindicación 11, donde la mezcla reactiva acidolítica es una mezcla que consiste en:

(a) ácido trifluoroacético;

(b) bromuro de hidrógeno;

(c) trietilsilano; y

(d) bromotrietilsilano;

donde el bromuro de hidrógeno y el bromo trietilsilano son generados in situ por reacción de bromo con trietilsilano.