PROCEDIMIENTO DE DOSIFICACION DE LA FIBRINA SOLUBLE.

Procedimiento de dosificación de la fibrina soluble en una muestra,

en el que se coloca dicha muestra en presencia de un activador del plasminógeno de fuerte especificidad con la fibrina soluble (PA-Fb sp) específico de la fibrina en las condiciones de utilización del activador seleccionadas para evitar la degradación del fibrinógeno plasmático circulante y se mide el contenido de la muestra en fibrina soluble, midiendo la diferencia entre la proporción de productos de degradación específicos de la fibrina obtenidos después de la degradación de la fibrina soluble por incubación con el PA-Fb sp y la proporción de base de los productos de degradación de la fibrina, determinada sobre dicha muestra antes de su puesta en presencia con el PA-Fb sp

Procedimiento de dosificación de la fibrina soluble.

La presente invención se refiere a un procedimiento de dosificación de la fibrina soluble mediante la generación de productos de degradación específicos en una muestra sanguínea.

Durante la activación de la coagulación, se genera trombina que provoca la formación de depósitos de fibrina y la formación de fibrina soluble.

En efecto, la trombina desprenderá de la molécula de fibrinógeno el fibrinopéptido A que provoca la generación de monómeros de fibrina sobre los cuales los sitios de polimerización "A" que estaban enmascarados en el fibrinógeno son desenmascarados, provocando con ello una interacción entre los sitios "A" de una molécula de monómero de fibrina con los sitios "a" accesibles tanto en el fibrinógeno como en la fibrina. En 2º tiempo, se produce la liberación del fibrinopéptido B, que provoca un desenmascaramiento de los sitios de polimerización "B" que provoca la interacción entre los sitios "B" de una molécula de fibrina con los sitios "b" accesibles tanto en el fibrinógeno como en los monómeros de fibrina.

Cuando la cantidad de trombina es muy importante (ensayo in vitro), todo el fibrinógeno se transforma en monómeros de fibrina que se polimerizan a consecuencia de la interacción de los sitios "A" y "a" por un lado, y "B" y "b" por otro lado, para dar el coágulo de fibrina. Por el contrario, in vivo, la generación de trombina es mucho menos importante. La generación de monómeros de fibrina resulta así mucho menos explosiva y por ello una parte de los monómeros de fibrina polimerizarán para dar fibrina (trombo) y otra parte reaccionará con fibrinógeno en el que los sitios a y b son accesibles o con unos productos de degradación del fibrinógeno, para dar fibrina soluble en la que unos monómeros de fibrina son asociados con fibrinógeno.

La determinación de la fibrina soluble tiene como objetivo estudiar si existe una activación de la coagulación en un paciente, siendo testigo de esta activación la presencia de fibrina soluble en la sangre, en particular en el plasma.

Esta determinación es un complemento necesario para la dosificación de D-dímeros formados por la fibrinolisis de la fibrina que constituye el trombo, que constituye asimismo un marcador del proceso de activación de la coagulación. En efecto, se aumenta el contenido plasmático en D-dímeros mientras el coágulo se degrada in vivo. Por ello, si el trombo está presente y se está degradando, el porcentaje de D-dímeros aumentará, tanto si persiste la coagulación como si ésta está interrumpida: por el contrario el de fibrina soluble no aumentará si la coagulación es interrumpida y por el contrario aumentará si la coagulación persiste.

La medición específica del contenido plasmático en fibrina soluble con respecto al contenido en D-dímeros permite por lo tanto:

Entre los procedimientos de dosificación de la fibrina soluble más antiguos, se pueden citar el ensayo con etanol (1, 2, 9) o el ensayo con sulfato de protamina (3, 4, 5, 7). Sin embargo, estos ensayos son poco específicos (9, 10) y poco sensibles (10). Además, unas proporciones elevadas de fibrinógeno (> 5 g/l) perturban los resultados obtenidos con los ensayos con etanol y con sulfato de protamina. Por último, los resultados de los ensayos con sulfato de protamina pueden ser difíciles de interpretar (6, 8).

Otro tipo de detección de la fibrina soluble se basa en una técnica de hemaglutinación de glóbulos rojos sensibilizados con unos monómeros de fibrina según el procedimiento de Largo (11, 12). Este tipo de ensayo es, por ejemplo, comercializado por la compañía Diagnostica Stago bajo la denominación de FS Test.

Sin embargo esta técnica de realización, aunque fácil, puede carecer a veces de sensibilidad y se presta sobre todo al diagnóstico de coagulaciones intravasculares diseminadas. No permite, por el contrario, detectar contenidos más bajos de fibrina soluble (trombosis localizadas, exploración de la eficacia de una terapia anticoagulante).

En la actualidad, las otras técnicas de dosificación de la fibrina soluble se basan en la utilización de anticuerpos monoclonales que detectan unos epítopos desenmascarados en la fibrina y enmascarados en el fibrinógeno o los productos de degradación de la fibrina o del fibrinógeno (13-14). Sin embargo, las dosificaciones directas utilizando anticuerpos monoclonales dan unas proporciones en fibrina soluble que varían según el anticuerpo comercial utilizado.

Los autores de la presente invención proponen un enfoque diferente a los preconizados en el estado de la técnica, particularmente sencillo y rápido, para apreciar el balance coagulo-lítico de un paciente. Este enfoque posee una mejor sensibilidad que el procedimiento por hemaglutinación descrito anteriormente. Presenta la ventaja, con respecto a los tests que utilizan anticuerpos monoclonales, de detectar de la misma forma la fibrina circulante (soluble) y la que ya se ha degradado IN VIVO, lo que permite de esta forma obtener una evaluación muy exacta del balance coagulo-lítico.

Según el procedimiento de la presente invención, se mide la fibrina soluble presente en una muestra después de la generación de productos de degradación de la fibrina soluble, durante la incubación de la muestra con un activador del plasminógeno que tiene una fuerte especificidad con respecto a la fibrina (PA-Fb sp). Así, la diferencia entre la proporción de productos de degradación obtenida después de la degradación de la fibrina soluble por el PA-Fb sp y la de los productos de degradación de la fibrina de base, medida antes de la puesta en contacto de la muestra con el PA-Fbsp, permite medir el contenido plasmático en fibrina soluble en la muestra.

Por lo tanto, la invención tiene por objeto un procedimiento de dosificación de la fibrina soluble en una muestra biológica en la que se pone dicha muestra en presencia de un activador del plasminógeno de fuerte afinidad con la fibrina (PA-Fb sp) y se mide el contenido de la muestra en fibrina soluble midiendo la diferencia entre la proporción de los productos de degradación obtenidos después de la degradación de la fibrina soluble por el PA-Fb sp y la proporción de base de los productos de la degradación de la fibrina determinada antes de la puesta en contacto de la muestra con el PA-Fb sp.

El procedimiento de dosificación de la fibrina soluble según la invención en una muestra biológica, comprende las etapas siguientes:

El reactivo utilizado para dosificar los productos de degradación se selecciona para medir un grupo determinado de productos de degradación. Por ejemplo, se utilizan unos anticuerpos de especificidad determinada con respecto a un tipo particular de productos de degradación.

Preferentemente, la muestra biológica es un líquido biológico, por ejemplo una muestra de sangre o de plasma, o incluso un líquido de punción.

Se describe asimismo en la presente memoria la utilización de un...

1. Procedimiento de dosificación de la fibrina soluble en una muestra, en el que se coloca dicha muestra en presencia de un activador del plasminógeno de fuerte especificidad con la fibrina soluble (PA-Fb sp) específico de la fibrina en las condiciones de utilización del activador seleccionadas para evitar la degradación del fibrinógeno plasmático circulante y se mide el contenido de la muestra en fibrina soluble, midiendo la diferencia entre la proporción de productos de degradación específicos de la fibrina obtenidos después de la degradación de la fibrina soluble por incubación con el PA-Fb sp y la proporción de base de los productos de degradación de la fibrina, determinada sobre dicha muestra antes de su puesta en presencia con el PA-Fb sp.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque los productos de degradación de la fibrina medidos son los D-dímeros.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el PA-Fb sp se selecciona de entre el grupo constituido por: el tPA o sus derivados, el VPA o sus derivados, la estafiloquinasa o uno de sus mutantes.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el PA-Fb sp es el tPA o la estafiloquinasa.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra sanguínea es plasma.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque los productos de degradación de la fibrina se dosifican según un procedimiento de tipo ELISA, o LIATEST.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la muestra a ensayar se incuba durante 15 minutos a 37ºC en presencia de PA-Fb sp.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el PA-Fb sp es el t-PA utilizado en un intervalo de concentraciones finales comprendido entre 1 y 2,5 µg/ml.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el PA-Fb sp es el tPA a una concentración final de 2 µg/ml de muestra.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el PA-Fb sp se selecciona de entre la Estafiloquinasa, la bat-tPA, VPA, la DSPA, la FEKP, el EKP y la KP.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el PA-Fb sp es la estafiloquinasa a una concentración final de 10 µg/ml de muestra.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque las proporciones de productos de la degradación de la fibrina soluble que resultan de la activación del PA-Fb sp se aprecian con respecto a un testigo positivo preparado a partir de un plasma normal tratado mediante un activador de la coagulación y a continuación por un inhibidor de dicho activador para evitar la formación de un coágulo.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el testigo positivo se prepara a partir de un plasma normal tratado con trombina de manera que se induce una activación de la coagulación in vitro y a continuación con hirudina o heparina, para evitar la formación de un coágulo.

14. Utilización del procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para seguir la evolución de un proceso de activación de la coagulación y evaluar la eficacia de una terapia anticoagulante.