Complejo de enzima, proteína y portador, que comprende:

(1) un portador,

(2) un enzima, encontrándose conjugadas covalentemente dos o más moléculas del enzima con el portador en (1), y

(3) una proteína con una potencia de unión específica para una o más sustancias adicionales, encontrándose conjugada la proteína sola con por lo menos una molécula de entre las dos o más moléculas del enzima en (2)

Complejo de enzima y proteína.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a un complejo de enzima, proteína y portador preparado mediante la conjugación de una proteína con una potencia de unión específica para otra sustancia o sustancias a un enzima conjugado covalentemente con un portador, y el complejo se utiliza para el inmunoensayo, tal como inmunohistoquímica e inmunoensayo enzimático.

Debido a los recientes avances en la inmunoquímica, se ha utilizado ampliamente un inmunoensayo capaz de detectar una cantidad traza de una sustancia a una sensibilidad elevada mediante la utilización de una reacción de antígeno-anticuerpo. En la actualidad, dos campos de tipos generales de inmunoensayo son la inmunohistotinción y el inmunoensayo enzimático.

La inmunohistotinción es un medio para detectar un antígeno específico sobre un tejido con un anticuerpo que reconoce específicamente el antígeno. Generalmente se somete un anticuerpo que reconoce un antígeno específico a una reacción sobre una sección delgada obtenida de un bloque preparado mediante fijación de un tejido y la posterior inclusión del tejido en parafina; mediante el examen de la presencia o ausencia del anticuerpo reaccionado puede determinarse la presencia del antígeno. El anticuerpo que se deja reaccionar en primer lugar con el antígeno generalmente se denomina anticuerpo primario. Al conjugar una sustancia que emite una señal detectable visualmente o con un aparato, con el anticuerpo primario, la intensidad de la señal indica la cantidad del anticuerpo primario, que corresponde, a su vez, a la cantidad del antígeno en la sección. A modo de sustancia que emite la señal para alcanzar el fin, puede mencionarse una sustancia fluorescente y un enzima. En una etapa temprana del desarrollo de la inmunohistotinción, se utilizaba una sustancia fluorescente como sustancia que emitía dicha señal. En este caso, resultaba necesario un microscopio de fluorescencia para detectar la fluorescencia.

Posteriormente, un método de anticuerpo marcado enzimáticamente fue desarrollado por Nakane et al., que permitió el análisis de la imagen teñida con un microscopio óptico. En la actualidad generalmente se utiliza un enzima como sustancia emisora de señal. Para llevar a cabo la inmunohistotinción, puede llevarse a cabo una reacción de color correspondiente a la actividad de un enzima en caso de encontrarse conjugado con un anticuerpo primario, mediante la adición de una sustancia cromogénica al enzima, y la reacción de color corresponde a la cantidad del anticuerpo, es decir la cantidad de antígeno presente en el tejido. Sin embargo, generalmente, en ningún caso puede recuperarse una sensibilidad suficiente mediante la utilización de dicho método.

El método utilizado más comúnmente en la actualidad se denomina método de estreptavidina-biotina (método SAB), es decir un medio para amplificar la señal de un anticuerpo primario unido a un antígeno, detectando de esta manera la señal. El método comprende en primer lugar someter un anticuerpo primario que reconoce una sustancia específica en una sección de tejido a reacción con el mismo. A continuación, un anticuerpo secundario que se une al anticuerpo primario se somete a reacción con el mismo. Generalmente, el anticuerpo secundario es un anticuerpo policlonal que reconoce y se une al anticuerpo primario. DE acuerdo con lo anterior, se une una pluralidad de moléculas del anticuerpo secundario al anticuerpo primario. Preliminarmente se conjuga una pluralidad de moléculas de biotina a cada molécula de anticuerpo secundario. Se permite que reaccione estreptavidina conjugada con enzima (reactivo enzimático) con el complejo de anticuerpo primario-anticuerpo secundario conjugado con biotina. Es conocido que la estreptavidina puede unirse fuertemente a la biotina. Por lo tanto, se forma un complejo de anticuerpo primario-anticuerpo secundario conjugado con biotina-estreptavidina conjugada con enzima. Debido a que la pluralidad de moléculas del conjugado de anticuerpo secundario con biotina se han unido a cada molécula de anticuerpo primario y una pluralidad de moléculas del conjugado de estreptavidina con enzima se han unido a cada molécula del conjugado de anticuerpo secundario con biotina según el método, en consecuencia la cantidad de enzima unida indirectamente al anticuerpo primario puede incrementarse marcadamente. Como resultado, el antígeno en la sección de tejido puede detectarse con una sensibilidad elevada.

Tal como se ha indicado anteriormente, el método SAB es un método excelente capaz de producir una señal más intensa debido a que un número muy elevado de moléculas de un enzima se unen finalmente al anticuerpo primario unido al antígeno. Sin embargo, desde otro punto de vista de los procedimientos, resulta necesario llevar a cabo tres etapas de procedimiento: la reacción del anticuerpo primario, la reacción del anticuerpo secundario y la reacción del reactivo enzimático. Tal como se ha indicado anteriormente, el método SAB incluye muchas etapas y no puede evaluarse si resulta satisfactorio en los aspectos de la práctica clínica y similares, que exigen rapidez y simplicidad conjuntamente con exactitud. De esta manera, se espera que se mejore el método SAB.

Como otro medio de inmunoensayo general, es conocido el inmunoensayo enzimático (EIA). El principio y procedimiento típicos del EIA son los siguientes. En primer lugar, un anticuerpo que reconoce una sustancia que se desea someter a ensayo se inmoviliza en un portador, tal como una perla de poliestireno o una microplaca. Tras bloquear seguidamente el portador con proteína, tal como albúmina, a continuación se añade una solución (muestra) que contiene una sustancia (antígeno) como el objeto de ensayo pretendido. A continuación, se añade un anticuerpo que reconoce un antígeno, conjugado con un enzima (anticuerpo marcado con enzima). En otras palabras, el antígeno queda interpuesto entre dos anticuerpos. Seguidamente, se lava el exceso de anticuerpo marcado con enzima; se añade un sustrato cromogénico del enzima para el desarrollo de color. Debido a que la cantidad del antígeno depende de la actividad del enzima, puede determinarse la concentración del antígeno en la muestra mediante comparación con el desarrollo de color de una muestra que contiene antígeno a una concentración preliminarmente conocida. Varios factores son responsables de la sensibilidad del inmunoensayo enzimático, y la calidad del anticuerpo marcado con enzima es uno de los factores significativos. Más específicamente, se cree que puede obtenerse una señal más intensa en el caso de que el anticuerpo marcado con enzima presente muchas moléculas del enzima, de manera que el antígeno puede someterse a ensayo a una sensibilidad elevada.

Tal como se ha indicado anteriormente, la calidad del anticuerpo marcado con enzima resulta muy importante para el inmunoensayo e influye marcadamente sobre la sensibilidad del sistema de ensayo o sobre el número de etapas incluidas en el procedimiento. Tal como se ilustra posteriormente, se han realizado muchos intentos para obtener un anticuerpo marcado con enzima que consiga una elevada sensibilidad. Muchos de ellos comprenden conjugar muchas moléculas de un enzima y un anticuerpo con un portador.

En la solicitud de patente japonesa publicada nº JP-A 63-503138 (1988), se conjuga un anticuerpo con un portador conjugado con un derivado de un marcaje detectable, tal como un fármaco, toxina, quelante o compuesto de boro. A modo de portador se utiliza aminodextrano; en primer lugar se conjuga un fármaco, tal como metotrexato, con el aminodextrano. A continuación, el grupo aldehído generado a partir de la oxidación de la cadena sacárida del anticuerpo con peryodato sódico se deja reaccionar con el grupo amino del aminodextrano, seguido de la reducción con cianoborohidruro sódico para conseguir un enlace covalente, con el fin de preparar un complejo de fármaco, anticuerpo y aminodextrano.

En la solicitud de patente japonesa publicada nº JP-A 3-158758 (1991), se oxida dextrano con peryodato sódico; el grupo aldehído resultante se deja reaccionar con el grupo amino de la fosfatasa alcalina y anticuerpo, seguido de la reducción con borohidruro sódico, con el fin de preparar un complejo de enzima, anticuerpo y dextrano.

En la solicitud de patente japonesa publicada nº 6-509167 (1994), se hace reaccionar divinilsulfona con un polímero, tal como dextrano para introducir el grupo vinilo en el mismo, seguido de la reacción con...

1. Complejo de enzima, proteína y portador, que comprende:

2. Complejo de enzima, proteína y portador, que comprende:

3. Complejo de enzima, proteína y portador según la reivindicación 1 ó 2, en el que el portador presenta un peso molecular medio de entre 5.000 y 500.000 Da, determinado mediante cromatografía de filtración en gel.

4. Complejo de enzima, proteína y portador según la reivindicación 3, en el que el portador presenta un peso molecular medio de entre 10.000 y 300.000 Da, determinado mediante cromatografía de filtración en gel.

5. Complejo de enzima, proteína y portador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el portador presenta dos o más grupos amino.

6. Complejo de enzima, proteína y portador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el portador se selecciona de entre el grupo que consiste de: (a) un polímero peptídico que presenta dos o más grupos amino básicos, y (b) un polisacárido en el que se han introducido grupos activos, siendo el tipo de grupos activos por lo menos un tipo seleccionado de entre el grupo que consiste de grupo amino, grupo aldehído y grupo vinilo.

7. Complejo de enzima, proteína y portador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el portador es polilisina.

8. Complejo de enzima, proteína y portador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el enzima se selecciona de entre el grupo que consiste de peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa y glucosa oxidasa.

9. Complejo de enzima, proteína y portador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la proteína con una potencia de unión específica para una o más sustancias adicionales es por lo menos una seleccionada de entre el grupo que consiste de un anticuerpo y uno o más fragmentos del mismo.

10. Complejo de enzima, proteína y portador según la reivindicación 9, en el que el anticuerpo es un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal.

11. Complejo de enzima, proteína y portador según la reivindicación 9, en el que el fragmento o fragmentos se refieren a por lo menos uno seleccionado de entre el grupo que consiste de F(ab')₂, Fab' y Fabc'.

12. Complejo de enzima, proteína y portador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la proteína con una potencia de unión específica para una o más sustancias adicionales es avidina o estreptavidina.

13. Kit de inmunoensayo que comprende el complejo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

14. Kit de inmunoensayo según la reivindicación 13, en el que el inmunoensayo es una inmunohistotinción o un inmunoensayo enzimático.