Una proteína de transporte de cationes humana aislada y purificada denominada Canal Iónico Sensible a Ácido 3 humano (o hASIC3) representada por la SEC ID Nº 8,

que tiene una cinética de desensibilización bifásica con tanto un componente selectivo de Na+ que se inactiva rápidamente como un componente sostenido

Canal catiónico neuronal humano sensible a ácido, su clonación y aplicaciones.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevas familias de canales iónicos sensibles a ácido de mamíferos, particularmente seres humanos y ratas. Más particularmente, la invención se refiere a la identificación y caracterización molecular en seres humanos y ratas de una nueva familia de canales catiónicos activados por protones, denominados en su conjunto a continuación polipéptidos ASIC, por Canal Iónico Sensible a Ácido.

Los canales ASIC constituyen los primeros miembros de un grupo de canales catiónicos que pertenecen a la familia de canales de sodio de las degenerinas sensibles a amilorida [6, 11-14], que se activan temporalmente por acidificación extracelular.

La sensibilidad a ácido está asociada tanto con la nocicepción [1] como con la transducción gustativa [2]. La estimulación de neuronas sensitivas por ácidos es de gran importancia ya que la acidez acompaña a numerosas situaciones isquémicas e inflamatorias dolorosas. Se piensa que el dolor causado por ácidos está mediado por los canales catiónicos presentes a nivel de las neuronas sensitivas que se activan por protones [3-5]. Las propiedades biofísicas y farmacológicas de los canales ASIC de la invención son similares a las de los canales catiónicos activados por protones descritos en las neuronas sensitivas [3, 15, 16]. Sin embargo, como se observará en la descripción a continuación, hasta la fecha no se ha informado de canales iónicos activados por ligando más simples que los canales ASIC.

Sumario de la invención

La invención también se refiere a canales catiónicos híbridos constituidos por la combinación de una primera proteína que comprende un canal iónico activado por protones de acuerdo con la invención con un segundo canal iónico activado por protones.

La presente invención tiene como objeto una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que constituye canales catiónicos neuronales que son sensibles a amilorida y que se activan por protones.

La invención también se refiere a un vector que comprende al menos una de las moléculas de ácido nucleico anteriores, ventajosamente combinada con secuencias de control adecuadas, así como a un procedimiento para la producción o expresión en una célula hospedadora de una proteína que constituye un canal iónico de acuerdo con la invención.

La invención también se refiere a las células transformadas que expresan canales catiónicos ASIC y/o sus derivados obtenidas de acuerdo con los métodos anteriores.

La presente invención también se refiere a la aplicación del canal ASIC para el estudio de modificaciones patológicas que pueden conducir a degeneraciones neuronales. La invención también se refiere a las preparaciones farmacéuticas que comprenden como ingrediente activo al menos una de estas proteínas de la invención.

Se observarán otras características y ventajas de la invención en la descripción a continuación relacionada con actividades de investigación que condujeron a la demostración y a la caracterización del canal ASIC.

La invención puede entenderse adicionalmente con referencia a las Figuras, que se analizan a continuación y en los Ejemplos.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa el alineamiento de las secuencias de las proteínas ASIC de rata (en la parte superior) y las proteínas ASIC humanas (en la parte inferior) de las secuencias SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 2.

La Figura 2 representa una comparación de la secuencia proteica del canal rASIC1A con la secuencia de otros canales iónicos.

La Figura 3 representa el árbol filogenético de las proteínas de las subunidades aNaCh, ßNaCh, ?NaCh, dNaCh del canal de sodio sensible a amilorida y de las degenerinas MEC-4, MEC-10 y DEG-1 de C. elegans.

La Figura 4 representa la topología propuesta para esta última familia de canales iónicos [30].

La Figura 5 muestra las propiedades biofísicas del canal rASIC1A activado por protones.

La Figura 6 muestra el efecto de Ca²⁺ y de amilorida sobre la corriente de rASIC1A.

La Figura 7 muestra la distribución tisular del ARNm del canal ASIC1A.

La Figura 8 muestra la hibridación in situ.

La Figura 9 muestra el alineamiento de las secuencias proteicas deducidas de hASIC3 y rASIC3.

La Figura 10 muestra la dependencia de pH y la farmacología de hASIC3.

La Figura 11 muestra la selectividad y las propiedades de canales individuales de hASIC3.

La Figura 12 muestra la localización cromosómica humana del gen de hASIC3.

Identificación de las secuencias de aminoácidos y ADN

La SEC ID Nº: 1 representa la secuencia de 526 aminoácidos de la proteína del canal rASIC1A deducida a partir de la secuencia de ADNc de la rata.

La SEC ID Nº: 2 representa la secuencia parcial de 514 aminoácidos de la proteína del canal hASIC1A deducida a partir de la secuencia parcial de ADNc humano.

La SEC ID Nº: 3 representa la secuencia de 512 aminoácidos de la proteína del canal hASIC2A deducida a partir de la secuencia de ADNc humano.

La SEC ID Nº: 4 representa la secuencia de 559 aminoácidos de la proteína del canal rASIC1B así como la secuencia de una molécula de ADN que comprende la secuencia codificante de esa proteína.

La SEC ID Nº: 5 representa la secuencia de 533 aminoácidos de la proteína del canal rASIC3 y la secuencia de ADN codificante de esa proteína.

La SEC ID Nº: 6 representa la secuencia de 563 aminoácidos de la proteína del canal rASIC2B, así como la secuencia de una molécula de ADN que comprende la secuencia codificante de esa proteína.

La SEC ID Nº: 7 representa la secuencia de 533 aminoácidos de la proteína del canal hASIC3, así como la secuencia de una molécula de ADN que comprende la secuencia codificante de esa proteína.

Descripción detallada de la invención

La presente invención tiene como objeto proteínas de rata que constituyen canales catiónicos neuronales que son sensibles a amilorida y que se activan por protones. La invención se refiere a proteínas que constituyen la familia ASIC de canales catiónicos o derivados funcionalmente equivalentes de estas proteínas.

Dichos derivados son los polipéptidos cuyas secuencias incluyen una modificación y/o una supresión y/o una adición de uno o más restos aminoacídicos, siempre que esta modificación, supresión y/o adición no altere las propiedades funcionales y estructurales del canal ASIC, principalmente su activación por protones. De hecho, se describen en la presente memoria tres polipéptidos ASIC diferentes, ASIC1, ASIC2 y ASIC3, tanto en rata como en seres humanos. Además, los transcritos que codifican ASIC1 y ASIC2 experimentan un corte y empalme alternativo que genera derivados funcionales adicionales de las proteínas ASIC1 y ASIC2 (ASIC1A y 1B, ASIC2A y ASIC2B, respectivamente). Se considera que otros derivados funcionales de las proteínas ASIC y/u otras formas de los polipéptidos ASIC generadas por corte y empalme alternativo de los transcritos de ARNm de ASIC están dentro del alcance de la presente invención. Dichas proteínas y sus derivados funcionales pueden analizarse por un experto en la materia usando las técnicas descritas en los Ejemplos que se incluyen en la presente memoria, que hacen posible demostrar las propiedades biofísicas y farmacológicas de los canales ASIC.

Son ejemplos adicionales de derivados funcionales de los canales ASIC los siguientes: Se considera que las proteínas ASIC1A humanas y de rata (hASIC1A y rASIC1A, SEC ID Nº 1 y 2, respectivamente) son funcionalmente equivalentes. Las secuencias de aminoácidos de estas dos proteínas son altamente homólogas, pero no son idénticas. Por lo tanto, pueden introducirse fácilmente sustituciones dentro de la secuencia primaria de proteínas ASIC sin influir en sus características funcionales básicas.

Otro ejemplo de derivado funcionalmente equivalente de este tipo es la proteína que constituye un canal catiónico anteriormente denominado MDEG [14] o BNaCl [20], denominado en la presente memoria rASIC2A. La secuencia de aminoácidos de rASIC2A está representada en la lista de secuencias adjunta con el número de SEC ID Nº: 3. El rASIC2A se ha descrito como un canal...

1. Una proteína de transporte de cationes humana aislada y purificada denominada Canal Iónico Sensible a Ácido 3 humano (o hASIC3) representada por la SEC ID Nº 8, que tiene una cinética de desensibilización bifásica con tanto un componente selectivo de Na⁺ que se inactiva rápidamente como un componente sostenido.

2. Una molécula de ácido nucleico aislada y purificada que codifica la proteína de transporte de cationes humana hASIC3 de la reivindicación 1.

3. La secuencia de la reivindicación 2, que mapea en el cromosoma 7q35.

4. La proteína de la reivindicación 1, que forma un canal catiónico dependiente de protones.

5. La proteína de la reivindicación 4, en la que la actividad del canal de transporte depende del pH en reposo.

6. La proteína de la reivindicación 4, que también presenta una cinética de desensibilización bifásica.

7. La proteína de la reivindicación 1, que es sensible a amilorida.

8. Un canal de transporte de cationes humano que comprende al menos una molécula de Canal Iónico Sensible a Ácido 3 humano (o hASIC3) como se define en la reivindicación 1 y al menos una molécula de un segundo canal catiónico dependiente de protones humano.

9. El canal de transporte de cationes de la reivindicación 8, en el que la segunda proteína de transporte de cationes se selecciona del grupo que consiste en hASIC2A, hASIC2B, hASIC1A y hASIC1B.

10. Un vehículo de clonación que comprende una secuencia de la reivindicación 2.

11. El vehículo de clonación de la reivindicación 10, que comprende además una secuencia que codifica una segunda proteína de transporte de cationes seleccionada del grupo que consiste en hASIC2A, hASIC2B, hASIC1A y hASIC1B.

12. Una célula transformada que contiene el vehículo de clonación de la reivindicación 10.

13. La célula transformada de la reivindicación 12, que expresa el Canal Iónico Sensible a Ácido 3 humano.

14. Una célula transformada que contiene el vehículo de clonación de la reivindicación 11.

15. La célula transformada de la reivindicación 14, que expresa un canal de transporte de cationes humano que comprende al menos una molécula de Canal Iónico Sensible a Ácido 3 humano y al menos una molécula de una segunda proteína de transporte de cationes seleccionada del grupo que consiste en hASIC2A, hASIC2B, hASIC1A y hASIC1B.

16. Un método de exploración de sustancias capaces de modular la actividad de canales de trasporte de cationes compuestos por el Canal Iónico Sensible a Ácido 3 humano como se define en la reivindicación 1, que comprende poner en contacto cantidades preseleccionadas de la sustancia a ensayar con células que expresen dicho canal de transporte de cationes, medir los efectos de la sustancia sobre las funciones de transporte del canal de transporte de cationes e identificar la sustancia que tiene un efecto positivo o negativo sobre la actividad del canal de potasio.