BIOENSAYO DE TOXICIDAD AMBIENTAL BASADO EN HELECHOS.
Bioensayo de toxicidad ambiental basado en helechos.
La presente invención se refiere a un método para evaluar la toxicidad de una muestra basado en a) la obtención de una suspensión de esporas o gametófitos de helecho;
b) la incubación de la suspensión obtenida en a) con la muestra cuya toxicidad se quiere evaluar, c) la incubación del cultivo obtenido en b) en presencia de una sal de tetrazolio; d) la extracción de la sal de tetrazolio que haya sido reducida en el paso c) en función de la actividad mitocondrial de las esporas o gametófitos; y e) la determinación de la cantidad de sal de tetrazolio reducida extraída en d). Asimismo, se contempla un kit para el desarrollo del método descrito
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200702680.
Solicitante: UNIVERSIDAD REY JUAN CARLOS.
Nacionalidad solicitante: España.
Provincia: MADRID.
Inventor/es: CATALA RODRIGUEZ,MYRIAM, ESTEBAN LOPEZ,MARTA, GARCIA QUINTANILLA,LUIS.
Fecha de Solicitud: 11 de Octubre de 2007.
Fecha de Publicación: .
Fecha de Concesión: 5 de Marzo de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/26 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que interviene una oxidorreductasa.
Clasificación PCT:
- C12Q1/26 C12Q 1/00 […] › en los que interviene una oxidorreductasa.
Fragmento de la descripción:
Bioensayo de toxicidad ambiental basado en helechos.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a materiales y métodos para evaluar la toxicidad ambiental de aguas, efluentes, suelos, lixiviados e incluso emisiones gaseosas, estando la invención dentro del sector de la biotecnología, bioquímica, fisiología celular, medio ambiente y ecotoxicología. Concretamente se refiere a bioensayos de toxicidad ambiental realizados en helechos.
Antecedentes de la invención
La toxicología ambiental estudia el impacto de los contaminantes sobre la estructura y función de los sistemas biológicos. Se trata de una relativamente reciente disciplina que se apoya en los conocimientos que proporcionan diferentes ramas del conocimiento como la Ecología, Química Orgánica, Biología Molecular o Microbiología.
Una herramienta extremadamente útil que emplea la toxicología ambiental son los bioensayos. Un bioensayo puede definirse como un experimento en el que se determina la actividad biológica de una sustancia mediante la observación de su efecto sobre organismos intactos, órganos, o diferentes preparaciones biológicas. Este tipo de ensayos proporcionan la posibilidad de evaluar la toxicidad de una muestra sin conocer la completa composición química de la misma. Las muestras contaminadas que encontramos en el medio ambiente pueden presentar una toxicidad debida, no tanto a un único compuesto puro, como a una compleja matriz. Esto va a dar lugar a una serie de interacciones entre estas sustancias, lo que puede provocar diferentes efectos (C.D. Klaassen, J. B. Watkins, Fundamentos de toxicología, McGraw Hill, 2005):
- - Efecto aditivo: el efecto combinado de dos sustancias es igual al efecto provocado por cada una de ellas por separado.
- - Efecto sinérgico: el efecto de la combinación de las dos sustancias es mucho mayor que el causado por cada una de ellas por separado.
- - Potenciación: se da cuando una sustancia no tóxica, en presencia de otra que sí lo es, hace que el efecto tóxico de la última sea mayor que cuando actúa separadamente.
- - Antagonismo: ocurre cuando dos sustancias se contrarrestan o cuando una de ellas interfiere en la acción de la otra.
Debido a estas posibles interacciones, el análisis de la cantidad y composición de los contaminantes de una muestra no es suficiente para dar una completa información sobre los efectos biológicos que puede provocar. Sin embargo, los bioensayos sí pueden proporcionarnos esa información.
Existe una amplia variedad de bioensayos de toxicidad que utilizan diferentes especies, que van desde las bacterias hasta las aves. La especie elegida para la realización de un bioensayo debe cumplir una serie de criterios (W. Landis, M.H Yu, Introduction to environmental toxicology, Lewis Publishers, 1999) como por ejemplo la posibilidad de estar disponible en cantidad suficiente, ya sea gracias a cultivo en laboratorio, en criadero o por recolección en el campo. También es importante que soporte bien las condiciones de laboratorio y que permita obtener una población homogénea.
La mayoría de los bioensayos están basados en la evaluación de la mortalidad que provoca la muestra tóxica en el organismo elegido para el bioensayo. Algunos ejemplos de organismos usados en bioensayos son:
- - Dafnias: Daphnia magna, D. pulex, D. pulicaria.
- - Bacterias: Vibrio fisheri.
- - Lumbrícidos: Eisenia foetida.
- - Algas: Chlamydomonas reinhardi, Selenastrum capricornutum.
- - Peces: Oncorhynchus mykiss (trucha arco iris), Salvenilus fontinalis (trucha de arroyo), Carassius auratus (carpa dorada).
La muerte de los individuos como criterio de valoración de la toxicidad es por tanto de gran interés y muy utilizado en los bioensayos. Sin embargo, en ocasiones es difícil registrar los fallecimientos y deben realizarse recuentos de un elevado número de muestras, lo que hace que sea un trabajo arduo y lento. Además puede ocurrir que los contaminantes estén en cantidades no letales o en formas poco biodisponibles haciendo improbable el fallecimiento inmediato (C.D. Klaassen, J. B. Watkins, Fundamentos de toxicología, McGraw Hill, 2005). Otro problema es el volumen de muestra ambiental, que en ocasiones, como en bioensayos con peces, es del orden de litros, lo que dificulta su almacenamiento, mantenimiento y manipulación.
Existe una manera de evaluar precozmente estos efectos tóxicos no letales, los biomarcadores. Los biomarcadores pueden definirse como cualquier parámetro biológico mesurable y cuantificable que sirve como índice para la evaluación del estado fisiológico o de la salud. Podemos afirmar que los biomarcadores son indicadores a corto plazo de efectos biológicos a largo plazo (M.P. Cajaraville, Science of the total environment, 2000, 247:295-311).
Por lo tanto, gracias a los biomarcadores es posible anticipar cambios en niveles de organización más complejos como poblaciones, comunidades y ecosistemas y se pueden utilizar de manera predictiva, permitiendo la aplicación de medidas correctoras antes de que ocurra un daño ambiental irreversible.
Uno de los biomarcadores empleados es la actividad mitocondrial, concretamente la actividad reductora del complejo NADH-reductasa (E.C.1.6.5.3). Este complejo forma parte de la cadena de transporte de electrones o cadena respiratoria.
La cadena de transporte de electrones se localiza en la membrana interna de la mitocondria. Esta cadena está compuesta por multitud de proteínas, agrupadas en tres grandes complejos enzimáticos que se insertan en la membrana mitocondrial interna mediante proteínas transmembrana. El transporte de electrones comienza con los electrones cedidos por el NADH al complejo NADH-reductasa. Los electrones son transportados a lo largo de la cadena, de complejo a complejo mediante proteínas móviles, hasta llegar al aceptor final. Este transporte de electrones a lo largo de la cadena respiratoria genera un gradiente de protones a través de la membrana que impulsa la síntesis de ATP. Esta molécula, denominada como "moneda energética", es imprescindible para el funcionamiento de la célula. Este transporte de electrones a lo largo de la cadena respiratoria produce la mayor parte del ATP de la célula, por lo tanto, si se ve afectada la cadena respiratoria, se verá alterada la producción de ATP y la viabilidad de la célula se verá comprometida.
La actividad mitocondrial puede verse alterada por numerosas sustancias que actúan directa o indirectamente sobre la cadena de transporte de electrones. Esta alteración afectará a la síntesis de ATP en la mitocondria de diferente manera y en distintos puntos (C.D. Klaassen, J. B. Watkins, Fundamentos de toxicología, McGraw Hill, 2005):
- A. Inhibidores del aporte de hidrógeno a la cadena de transporte de electrones que actúan sobre/como:
Reivindicaciones:
1. Método para evaluar la toxicidad de una muestra que comprende las siguientes etapas:
- a. obtención de una suspensión de esporas o gametófitos de helecho en un medio de cultivo adecuado;
- b. incubación de la suspensión obtenida en a) con la muestra cuya toxicidad se quiere evaluar,
- c. incubación del cultivo obtenido en b) en presencia de una sal de tetrazolio;
- d. extracción de la sal de tetrazolio que haya sido reducida en c) en función de la actividad mitocondrial de las esporas o gametófitos; y
- e. determinación de la cantidad de sal de tetrazolio reducida extraída en d).
2. Método, según la reivindicación 1, donde la muestra a evaluar puede ser acuosa, sólida, semisólida y/o gaseosa.
3. Método, según la reivindicación 1 ó 2, donde la suspensión obtenida en la etapa a) se lleva a cabo en un medio de cultivo para gametófitos.
4. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el medio de cultivo está complementado con un agente humectante.
5. Método, según la reivindicación 4, donde el agente humectante empleado es un detergente sin toxicidad biológica a una concentración comprendida entre 0,001 y 0,005%.
6. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde, previamente a la incubación de la etapa b), las esporas o gametófitos de la suspensión obtenida en a) son sometidos a una etapa de esterilización.
7. Método, según la reivindicación 6, donde la etapa de esterilización se lleva a cabo con hipoclorito sódico.
8. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde, previamente a la incubación de la etapa b), las esporas son sometidas a un recuento.
9. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la extracción de la etapa d) se lleva a cabo con un disolvente orgánico apolar.
10. Método, según la reivindicación 9, donde el disolvente es n-hexano.
11. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde, previamente a la etapa d) de extracción, se lleva a cabo una etapa de homogenización de la muestra por métodos químicos, térmicos y/o mecánicos.
12. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la etapa e) se lleva a cabo por técnicas espectrofotométricas.
13. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la especie de helecho empleada se selecciona entre Dryopteris guanchica, Polystichum setiferum, y Osmunda regalis.
14. Método, según la reivindicación 13, donde la sal de tetrazolio empleada en la etapa d) es cloruro de 2, 3, 5-trifeniltetrazolio (TCC).
15. Método, según la reivindicación 14, donde el TCC se emplea a una concentración comprendida entre 0,05 y 1,5%.
16. Método, según la reivindicación 15, donde el TCC se emplea a una concentración de 0,3%.
17. Método, según la reivindicación 15 ó 16, donde la etapa c) se lleva a cabo a un pH menor de 12, durante un periodo de tiempo comprendido entre 1 y 24 horas, a una temperatura entre 10 y 25ºC, en ausencia de luz y sin agitación.
18. Método, según la reivindicación 17, donde la etapa c) se lleva a cabo a un pH 8, durante 4 horas y a 20ºC.
19. Empleo de la actividad mitocondrial en esporas o gametófitos de helecho como biomarcador en métodos para evaluar la toxicidad en una muestra.
20. Kit para evaluar la toxicidad de una muestra, según el método de las reivindicaciones 1-18, que comprende una población de esporas de helecho, un medio de cultivo adecuado para la obtención de suspensiones de esporas o la germinación de gametófitos y una sal de tetrazolio.
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