Un polipéptido I-2 aislado, asociado con una enfermedad intestinal inflamatoria (EII),

que tiene una secuencia de aminoácidos que es más del 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1A, en donde el polipéptido retiene sustancialmente la inmunoreactividad o actividad tolerogénica de un polipéptido I-2 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1A, en donde la inmunoreactividad se define por la capacidad del polipéptido para formar un complejo con una muestra positiva para el anticuerpo anti-I-2, y en donde la actividad tolerogénica se define por la capacidad del polipéptido ya sea sola, o en combinación con otra molécula, para producir una menor respuesta inmunológica

Antígenos microbianos asociados con EII y los métodos de uso de los mismos.

Antecedentes de la invención

La invención por lo general se relaciona con los campos de inmunología, de microbiología y de una enfermedad intestinal inflamatoria y más específicamente con el diagnóstico y tratamiento de una enfermedad intestinal inflamatoria utilizando antígenos microbianos.

Enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es el término colectivo utilizado para describir dos trastornos gastrointestinales de etiología desconocida: enfermedad de Crohn (EC) y colitis ulcerosa (CU). El curso y pronóstico de una EII, que se produce en todo el mundo y se ha reportado que afecta a cerca de dos millones de personas, es muy variable. El inicio de EII es predominantemente en edad adulta con diarrea, dolor abdominal, y fiebre los tres síntomas que se presentan más comunes. La diarrea puede variar de leve a grave, y la anemia y pérdida de peso son signos comunes adicionales de EII. Del diez por ciento al quince por ciento de todos los pacientes con EII, necesitaran de cirugía en un periodo de diez años. Además, los pacientes con EII tienen un mayor riesgo para el desarrollo de cáncer intestinal. Informes de una mayor incidencia de problemas psicológicos, incluyendo ansiedad y depresión, son tal vez síntomas no sorprendentes de lo que es a menudo una enfermedad debilitante que afecta a las personas en la plenitud de la vida.

Desafortunadamente, las terapias disponibles para la enfermedad intestinal inflamatoria son pocas, y tanto el diagnóstico como el tratamiento se han visto obstaculizados por una falta de conocimiento relativo a la etiología de la enfermedad. Lo que está claro, sin embargo, es que una combinación de factores genéticos, desencadenantes exógenos y la microflora endógena puede contribuir al daño autoinmune en la mucosa intestinal visto en la enfermedad intestinal inflamatoria. En la enfermedad de Crohn, las bacterias se han implicado en el inicio y la progresión de la enfermedad: la inflamación intestinal en la enfermedad de Crohn es notoria por su frecuente grado de reacción a los antibióticos y susceptibilidad al flujo fecal bacteriano. Los colonos intestinales comunes y patógenos novedosos se han implicado en la enfermedad de Crohn por detección directa o por enfermedad asociada a respuestas inmunes anti-microbianas. Adicionalmente, en muchos modelos animales susceptibles genéticamente de colitis crónica, los micro-organismos del lumen son un cofactor necesario para la enfermedad; animales hospedados en un ambiente libre de gérmenes no desarrollan colitis. Sin embargo, a pesar de la evidencia más directa e indirecta de un papel de los microorganismos entéricos en la enfermedad de Crohn, los organismos patogénicos y antígenos que contribuyen a la desregulación inmune vistos en esta enfermedad no han sido identificados.

Las actuales pruebas de diagnóstico para la enfermedad de Crohn son incapaces de detectar todos los pacientes con la enfermedad. De esta manera, la identificación de antígenos microbianos novedosos asociados con la enfermedad de Crohn debería proporcionar los reactivos que pueden aumentar la sensibilidad de pruebas de diagnóstico actuales. Además, tales antígenos microbianos pueden soportar un epítope de la célula T relacionado con la enfermedad y, como inductores originales o que contribuyen a la respuesta inmune relacionada con la enfermedad, pueden ser efectivos antígenos tolerogénicos para el tratamiento de la enfermedad intestinal inflamatoria. La identificación de antígenos microbianos asociados con EII, también debería facilitar el aislamiento de la especie microbiana involucrada, allanando el camino para el descubrimiento de nuevos antibióticos o fármacos para el tratamiento de la enfermedad intestinal inflamatoria, tales fármacos aminoran la enfermedad, eliminando los inductores microbianos de la enfermedad.

De esta manera, existe una necesidad para la identificación y el aislamiento de antígenos asociados con EII microbiana para el diagnóstico y tratamiento de los numerosos individuos que sufren de la enfermedad intestinal inflamatoria. La presente invención satisface esta necesidad al proporcionar los antígenos microbianos I-1 y I-2 asociados con EII. Adicionalmente se proporcionan las ventajas relacionadas.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un polipéptido I-2 aislado asociado con la enfermedad inflamatoria intestinal, que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 1A. La invención también proporciona un fragmento inmunoreactivo aislado de un polipéptido I-2 que tiene al menos 10 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 1A, en donde dicho fragmento tiene inmunoreactividad, según se define por la capacidad del fragmento para formar un complejo con una muestra positiva para el anticuerpo anti-I-2.

También se proporciona por la presente invención el material de anticuerpo sustancialmente purificado que se une selectivamente a un polipéptido I-2, que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1A. Dicho material de anticuerpo sustancialmente purificado puede ser, por ejemplo, material de anticuerpo policlonal o monoclonal sustancialmente purificado.

La invención además proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que tiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido I-2 de la invención. Una molécula aislada de ácido nucleico de la invención puede tener, por ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la Figura 1A.

También se proporciona por la invención un método de diagnóstico de una enfermedad intestinal inflamatoria (EII) en un sujeto. El método incluye las etapas de una muestra a partir de un sujeto con un polipéptido I-2, o fragmento inmunoreactivo de este, bajo condiciones apropiadas para formar un complejo del polipéptido I-2, o el fragmento inmunoreactivo de este, y un anticuerpo para el polipéptido I-2; y la detección de la presencia o ausencia del complejo, donde la presencia del complejo indica que el sujeto tiene EII. Un método de la invención para el diagnóstico de la enfermedad intestinal inflamatoria puede ser útil, por ejemplo, para el diagnóstico de la enfermedad de Crohn. En un método de la invención para el diagnóstico de una enfermedad intestinal inflamatoria, la presencia o ausencia del complejo se puede detectar, por ejemplo, con un anticuerpo secundario detectable que tiene especificidad para una porción determinante de la clase del anticuerpo para el polipéptido I-2.

Además se proporciona por la invención el uso de un polipéptido I-2, o fragmento tolerogénico de este, para preparar una composición farmacéutica para inducir la tolerancia en un paciente con enfermedad intestinal inflamatoria. Este aspecto de la invención, puede ser particularmente útil para el tratamiento de un paciente que tiene la enfermedad de Crohn. En el uso de la invención para inducir tolerancia, el polipéptido I-2 puede tener, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1A.

La invención también proporciona una composición incluyendo un polipéptido I-2 de la invención, o fragmento tolerogénico de este, combinada con una molécula de tolerogenización. En una composición de la invención, el polipéptido I-2 puede tener, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1A. Un fragmento tolerogénico útil en una composición de la invención puede tener, por ejemplo, al menos diez aminoácidos contiguos de la citada secuencia.

La presente invención también proporciona un método para identificar un agente útil en el tratamiento de la enfermedad intestinal inflamatoria. El método incluye las etapas de obtención de una muestra de un microbio entérico a partir de un paciente con enfermedad intestinal inflamatoria; aislamiento de la muestra de una especie microbiana que incluye una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido I-2; el contacto de la especie microbiana con un agente; y análisis para reducir el crecimiento o viabilidad de la especie microbiana en comparación con el crecimiento o viabilidad en la ausencia del agente, donde la reducción del crecimiento o viabilidad de la especie microbiana indica que el agente es un agente útil en el tratamiento de una enfermedad intestinal inflamatoria. Un método de la invención puede ser útil, por ejemplo, para identificar un agente para el tratamiento...

1. Un polipéptido I-2 aislado, asociado con una enfermedad intestinal inflamatoria (EII), que tiene una secuencia de aminoácidos que es más del 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1A, en donde el polipéptido retiene sustancialmente la inmunoreactividad o actividad tolerogénica de un polipéptido I-2 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1A, en donde la inmunoreactividad se define por la capacidad del polipéptido para formar un complejo con una muestra positiva para el anticuerpo anti-I-2, y en donde la actividad tolerogénica se define por la capacidad del polipéptido ya sea sola, o en combinación con otra molécula, para producir una menor respuesta inmunológica.

2. El polipéptido I-2 aislado de la reivindicación 1, en donde el polipéptido I-2 tiene una secuencia de aminoácidos que es más del 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1A.

3. El polipéptido I-2 aislado de la reivindicación 1 o 2, que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1A.

4. Un fragmento inmunoreactivo aislado de un polipéptido I-2, dicho fragmento que tiene al menos 10 aminoácidos contiguos de un polipéptido I-2 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho fragmento tiene una inmunoreactividad como se define por la capacidad del fragmento para formar un complejo con una muestra positivo para el anticuerpo anti-I-2.

5. El fragmento inmunoreactivo aislado de la reivindicación 4, en donde el fragmento tiene al menos 15 aminoácidos de longitud.

6. El fragmento inmunoreactivo aislado de la reivindicación 4, en donde el fragmento tiene de 10 a 50 aminoácidos de longitud.

7. Un fragmento tolerogénico aislado de un polipéptido I-2, dicho fragmento que tiene al menos 8 aminoácidos contiguos de un polipéptido I-2 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; en donde dicho fragmento tiene actividad tolerogénica como se define por la capacidad del fragmento ya sea solo, o en combinación con otra molécula, para producir una menor respuesta inmunológica.

8. El fragmento tolerogénico aislado de la reivindicación 7, en donde el fragmento tiene al menos 15 aminoácidos de longitud.

9. El fragmento tolerogénico aislado de la reivindicación 7, en donde el fragmento tiene de 10 a 50 aminoácidos de longitud.

10. Material de anticuerpo sustancialmente purificado que se une selectivamente a un polipéptido I-2 de la reivindicación 3.

11. El material de anticuerpo sustancialmente purificado de la reivindicación 10, que es material de anticuerpo monoclonal.

12. Una molécula aislada de ácido nucleico, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido I-2 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

13. La molécula aislada del ácido nucleico de la reivindicación 12, que comprende la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la Figura 1A.

14. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido I-2 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un fragmento tolerogénico de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, combinada con una molécula de tolerogenización.

15. Un método de diagnóstico de una enfermedad intestinal inflamatoria (EII) en un sujeto, que comprende:

(a) el contacto de una muestra del sujeto con un polipéptido I-2 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un fragmento inmunoreactivo de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, bajo condiciones apropiadas para formar un complejo de dicho polipéptido I-2, o dicho fragmento inmunoreactivo de este, y un anticuerpo para dicho polipéptido I-2; y

(b) detección de la presencia o ausencia de dicho complejo,

en donde la presencia de dicho complejo indica que dicho sujeto tiene EII.

16. El método de la reivindicación 15, en donde la presencia o ausencia de dicho complejo se detecta con un anticuerpo secundario detectable que tiene especificidad para una porción determinante de la clase de dicho anticuerpo para dicho polipéptido I-2.

17. El método de la reivindicación 15, en donde la citada EII es la enfermedad de Crohn.

18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en donde dicho polipéptido I-2 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1A.

19. Uso de un polipéptido I-2 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un fragmento tolerogénico de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, para preparar una composición farmacéutica para inducir tolerancia en un paciente con EII.

20. El uso de la reivindicación 19, en donde la citada EII es la enfermedad de Crohn.

21. El uso de la reivindicación 19 o 20, en donde dicho polipéptido I-2 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1A.

22. Un método para identificar un agente útil en el tratamiento de una enfermedad intestinal inflamatoria (EII), que comprende:

(a) aislamiento de una bacteria entérica, a partir de una muestra de un paciente con EII, una especie microbiana que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido I-2 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3;

(b) el contacto del dicha especie microbiana con el agente; y

(c) análisis para la reducción del crecimiento o viabilidad de dicha especie microbiana en comparación con el crecimiento o viabilidad en la ausencia de dicho agente,

en donde dicha reducción del crecimiento o viabilidad de dicha especie microbiana, indica que el citado agente es un agente útil en el tratamiento de EII.

23. El método de la reivindicación 22, en donde dicha EII, es la enfermedad de Crohn.

24. El método de la reivindicación 23, en donde el citado agente es un antibiótico.

25. Un método para identificar un agente útil en el tratamiento de una enfermedad intestinal inflamatoria (EII), que comprende:

(a) la administración de un polipéptido I-2, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 a un animal no-humano, en el cual uno o más de los síntomas de EII se presentan;

(b) la administración de un agente a dicho animal no-humano; y

(c) análisis del nivel de uno o más de los síntomas característicos de EII,

en donde una reducción en el nivel de uno o más de los síntomas en comparación con un nivel control indica que el citado agente es un agente útil en el tratamiento de EII.

26. El método de la reivindicación 25, en donde la citada EII, es la enfermedad de Crohn.

27. El método de la reivindicación 25 o 26, en donde dicho polipéptido I-2 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2.

28. El método de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, en donde dicho animal no-humano es un ratón seleccionado del grupo que consiste de un ratón Gai2 -/-; un ratón TCRa-/- y un ratón IL-10 -/-.

29. Uso de un fragmento inmunoreactivo de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 en un método de diagnóstico in vitro de EII.

30. Uso de un microbio aislado del colon que contiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido I-2, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la identificación de agentes útiles para el tratamiento de EII, en donde el agente se pone en contacto con el microbio y el agente reduce la viabilidad o el crecimiento del microbio.