Triacilglicerol sintasas termoestables y usos de las mismas.

Polinucleótido aislado que presenta al menos un 75% de homología con la secuencia SEQ ID NO 1. Polipéptido codificado por el polinucleótido anterior

, que presenta actividad triacilglicerol sintasa. Vector que comprende el polinucleótido anterior. Célula hospedadora transformada con dicho vector. Método para la obtención de TAGs basado en la expresión del polipéptido codificado por el polinucleótido anterior mediante el cultivo de la célula hospedadora transformada anterior en un medio que comprende residuos o desechos industriales como fuente de carbono. Empleo de los TAGs obtenidos en dicho método como biocombustible o como material de partida para la obtención de biocombustible.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201200967.

Solicitante: UNIVERSIDAD DE CANTABRIA.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: MONCALIÁN MONTES,Gabriel, DE LA CRUZ CALAHORRA,Fernando, VILLA TORRECILLA,Juan Antonio, LÁZARO PINTO,Beatriz, CABEZAS ISIDRO,Matilde Andrea.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/10 (Transferasas (2.) (ribonucleasas C12N 9/22))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/21 (modificados por la introducción de material genético extraño)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de compuestos orgánicos que contienen... > C12P7/64 (Grasas; Aceites; Ceras de tipo éster; Acidos grasos superiores, es decir, con una cadena lineal de al menos siete átomos de carbono unida a un grupo carboxilo; Aceites o grasas oxidadas)

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Fragmento de la descripción:

TRIACILGLICEROL SINTASAS TERMOESTABLES y USOS DE LAS MISMAS

Campo de la invención La presente invención se refiere de forma general a polinucleótidos recientemente identificados, aislados y optimizados, a las proteínas codificadas por dichos polinucleótidos, así como a los métodos para la producción de dichas proteínas y a los usos de dichos polinucleótidos y proteínas. De forma particular, la presente invención contempla un polinucleótido aislado del microorganismo Thermomonospora curvata, que codifica para una enzima triacilglicerol sintasa termoestable, el método para la expresión de dicha enzima y el empleo de la misma para la obtención de triglicéridos a partir de diferentes substratos.

Antecedentes de la invención Hoy en día, salvo cierta producción a partir de aceites unicelulares, el aceite rico en ácidos grasos Omega-3 se obtiene principalmente de aceite de pescado produciéndose a nivel mundial alrededor de 1 millón de toneladas al año. De esta producción, aproximadamente un 80% se dedica a la acuicultura. Un análisis reciente del mercado europeo para los aceites Omega-3 estimaba que el mercado estaba todavía en su etapa del crecimiento con un valor actual de unos 300 millones de USD y un volumen estimado de 15.000 toneladas. El precio medio es de 15 USD/kg, con precios que fluctuan entre 2 USD/kg y 300 USD/kg. Hay por lo menos 50 proveedores de aceite de pescado, pero los diez principales mueven más del 70 por ciento del mercado.

Así todo, la gran demanda mundial de aceite se debe a su uso como materia prima para la obtención de biodiesel, la principal alternativa renovable al diesel de petróleo. Anualmente se consumen a nivel mundial más de 7, 000 millones de litros de biodiesel. Este biodiesel está compuesto de esteres metílicos y etílicos de ácidos grasos (F AMEs y F AEEs, respectivamente) producidos por la transesterificación química de triglicéridos animales y vegetales (Hill, J., Nelson, E., TUman, D., Polasky, S, and Tiffany, D. (2006) . Environmental, economic, and energetic costs and benefits of biodiesel and ethanol biofuels. Proc. Natl. Acad. Sci. US.A. 103, 11206-11210) . De hecho, su producción utiliza principalmente como materia prima aceites vegetales comestibles (palma, soja, o colza) . Así, la explotación de estas materias compite con el suministro de alimentos en el mundo siendo por tanto, un proceso problemático tanto económica como éticamente (Rude, M.A., and Schirmer, A. (2009) . New microbialfuels: a biotech perspective. Curro Opino Microbiol. 12, 274-281) .

Debido a la baja productividad de las cosechas de semillas oleaginosas, el abastecimiento de la demanda actual de biodiese1 no puede lograrse sin un aumento de las áreas del cultivo. La conversión de hábitats naturales en monocultivos (como las plantaciones de palma en la selva tropical) disminuyen la biodiversidad y reducen la capacidad natural de captar e02 (Fortman, JL., Chhabra, s., Mukhopadhyay, A., Chou, H., Lee, T.s., Steen, E., and Keasling, JD. (2008) . Biofuel alternatives to ethanol: pumping the microbial well. Trends Biotechnol. 26,

375-381) .

Por todo ello, a pesar de que el biodiese1 tiene evidentes beneficios socioeconómicos como la seguridad en el equilibrio, la reducción de emisiones netas de e02 o el desarrollo de áreas rurales, actualmente el biodiese1 llamado de primera generación no cumple muchas de estas premisas. Por ello hace falta el desarrollo de los llamados biocarburantes de segunda generación cuya principal característica es que en su producción no compiten con cultivos vegetales para consumo humano. La producción de trig1icéridos por microorganismos oleogénicos (cuyo mayor exponente hasta la fecha son las bacterias rhodococcus) para su transformación a biodiese1 entraría por tanto en esta categoría de biodiese1 de segunda generación.

Una solución a la obtención de aceite o trig1icéridos (T AGs) genéricos para la producción de biodiese1 o enriquecidos en ácidos grasos omega-3 para su uso en acuicultura es su producción en organismos unicelulares (SeO de las siglas en ingles single cell oils o aceite unicelular) . Se ha logrado con éxito la producción de aceites ricos en ácidos grasos omega-3 DHA en algas unicelulares y su comercialización como aditivo para leches infantiles por parte de la empresa americana Martek. Sin embargo estas algas son difici1es de modificar genéticamente para producir otros aceites y crecen relativamente lento con sustratos específicos. Por ello hace tiempo que se intenta producir aceites unicelulares en bacterias. En el caso de la bacteria oleogénica mas estudiada (Rhodococcus opacus) , tiene un tiempo de generación algo más corto que las algas unicelulares (2 horas) , pero es dificil de modificar y solo produce el acúmulo de aceÍte en medios de cultivo específicos. Por todo ello se ha intentado en el último lustro producir aceite en Escherichia eolio Escherichia coli es el organismo procariota mas estudiado en el laboratorio y con mayores posibilidades de transformación y modificación, con un tiempo de generación muy corto (unos 20 minutos) y un amplio rango de substratos que puede utilizar como medio de cultivo.

La aproximación para producir T AGs en E. coli ha sido la expresión de diversos genes que codifican para los enzimas WS/DGAT (sintasa de ceras/diacilglicerol aciltransferasa) , responsables de la acumulación de lípidos neutros en diferentes microorganismos.

La expresión de los enzimas WS/DGAT de Acinetobacter sp (Stoveken, T., Kalscheuer, R., Malkus, u., Reichelt, R., and Steinbüchel, A. (2005) . The wax ester synthase/acyl coenzyme A:diacylglycerol acyltransferase from Acinetobacter sp. strain ADP1: characterization of a novel type of acyltransferase. J. Bacterio!. 187, 1369-1376) , Marinobacter aquaolei (Holtzapple, E., and Schmidt-Dannert, C. (2007) . Biosynthesis of isoprenoid wax ester in Marinobacter hydrocarbonoclasticus DSM 8798: identification and characterization of isoprenoid coenzyme A synthetase and wax ester synthases. J. Bacterio!. 189, 3804-3812) o Alcanivorax borkumensis (Kalscheuer, R., Stoveken, T., Malkus, u., Reichelt, R., Golyshin, P.N, Sabirova, J.s., Ferrer, M, Timmis, K.N, and Steinbüchel, A. (2007) . Analysis ofstorage lipid accumulation in Alcanivorax borkumensis: Evidence for alternative triacylglycerol biosynthesis routes in bacteria. J. Bacteriol. 189, 918-928) no ha mostrado una acumulación destacable de aceite en E. coli. De todos modos, la enzima WS/DGAT de Acinetobacter calcoacéticus aparece recogida en el documento WO 03/074676 A2, por su capacidad de producir ceras y la WS/DGAT de M. aquaolei en el documento (US2009/0117629 Al) por su capacidad de producir ceras isoprenoides. Además se ha descrito un método para producir esteres etílicos de ácidos grasos directamente en E. coli que podrían utilizarse como biodiesel. Sin embargo ni este método (Kalscheuer, R., Stolting, T., and Steinbüchel, A. (2006) .

Microdiesel: Escherichia coli engineered for fuel production. Microbiology (Reading, Engl.) 152, 2529-2536) ni modificaciones del mismo (Steen, EJ., Kang, Y., Bokinsky, G., Hu, z., Schirmer, A., McClure, A., Del Cardayre, SB., and Keasling, JD. (2010) . Microbial production offatty-acid-derived fuels and chemicals from plant biomass. Nature 463, 559562) ha producido cantidades de biodiesel significativas utilizando el enzima WS/DGAT de Acinetobacter calcoaceticus. En ambos se observa una producción significativa de ceras (wax esters) pero no de triglicéridos (T AGs) .

En vista de la escasa actividad de producción de TAGs en E coli observada con los enzimas WS/DGA T utilizados hasta la fecha, los autores de la presente invención, tras una importante labor de investigación, han empleado un enzima de la familia WS/DGAT... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Polinucleótido aislado que presenta al menos un 75 % de homología con la secuencia SEQ ID NO 1.

2. Polinucleótido aislado, según la reivindicación 1, procedente de Thermomonospora curvata, que codifica para una enzima con actividad triacilglicerol sintasa.

3. Polipéptido aislado, que presenta al menos un 75 % de homología con la secuencia SEQ ID NO 2, con actividad triacilglicerol sintasa, codificado por el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2.

4. Vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2.

5. Vector, según la reivindicación 4, donde dicho vector se selecciona de entre pET29c y pBAD33.

6. Célula hospedadora transformada con el vector de la reivindicación 4.

7. Célula hospedadora, según la reivindicación 6, donde dicha célula es una bacteria.

8. Célula, según la reivindicación 7, donde la bacteria es Escherichia coli.

9. Cepa de Escherichia coli transformada con el vector pET29 que comprende el polinucleótido de secuencia SEQ ID NO l.

10. Método para la obtención de TAGs que comprende los siguientes pasos:

a. Obtención de la célula hospedadora transformada de la reivindicación 6,

b. Cultivo de la célula hospedadora transformada obtenida en a) en un medio de cultivo que comprende residuos o desechos industriales como fuente de

carbono, y

c. Recuperación de los T AGs acumulados en la célula hospedadora o en el medio de cultivo de b) .

11. Método, según la reivindicación 10 , para la obtención de T AGs que comprende los siguientes pasos:

a. Obtención de una cepa de Escherichia coli transformada con el vector pET29c que comprende el polinuc1eótido aislado de secuencia SEQ ID NO 1,

b. Cultivo de la cepa de Escherichia coli transformada obtenida en a) , en un medio de cultivo que comprende residuos o desechos industriales como fuente de carbono, y

c. Recuperación de los TAGs acumulados en Escherichia coli o en el medio de cultivo.

12. Método, según la reivindicación 11, donde se emplea IPTG como agente inductor en el paso b) .

13. Empleo de los TAGs obtenidos en el método de la reivindicación 10, o una fracción de los mismos, como biocombustible o como material de partida para la obtención de biocombustible.

14. Empleo de una célula hospedadora, según cualquiera de las reivindicaciones 6-9 para la obtención de TAGs.

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2 3 4 5 6 7

FIGURA 1

A B

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Ac TAG C41 C41 C41 C41 Grasos pET29c TDGAT TDGAT TDGAT

3h 6h 24h

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FIGURA 2

A B

Rojo

Verde

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FIGURA 3

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FIGURA 6

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<210>

<211>

<212>

<213>

UNIVERSIDAD DE CANTABRIA

Tri aci 1gl i cero1 sintasas termoestables y usos de las mismas 108/12

PatentIn version 3.3

DNA

Thermomonospora curvata

<220> Secuencia de ADN que codifica hara la proteína tDGAT con los codones optimizados para su expresión en Esc erichia coli.

<223>

<400> 1 atgcgtcagt taacagcagt tgatgcaaat tttctgaatg ttgaaaccgg caccacccat 60 gcacatattg caggtctggg tattctggat ccggttgcat gtccgggtgg tcgtctgacc 120 gcagaagatc tgattgaagt tattcgtgaa cgtgcacatc tggcaccgcg tccgctgcgc 180 atgcgtctgg ctgcagttcc gctgggtatt gatcgtccgt attgggaaga tgatccggat 240 tttgatccgg cacgtcatgt ttttgaagtt ggtctgcctg caccgggtaa tgcagctcag 300 ctggcagatg ttgttgcaat gctgcatgaa cgtcctctgg atcgtgcacg tccgctgtgg 360 gaagcagttg ttattcaggg tctggaaggt ggtcgtaccg cagtttatat taaagttcat 420 catgcagccg ttgatggtgt tctggcaacc gaaaccctgg cagcactgct ggatctgagt 480 ccgcagcctc gtgaactgcc tccggacgat accgttccgc agcaggcacc ggcactggca 540 gaacgtgttc gtaccggtct gctgcgtgca ctggcacatc cggttcgtgg tgcacgtatg 600 ctggcacgta ccgcaccgta tctggatgaa attccgggtc tggcacagct gcctggtgtt 660 cagcctctgg cacgcgcaat tcagggtgca ctgggtcgtg atggtgttgt tccgctgcct 720 cgtaccgttg cacctccgac cccgtttaat ggcaccatta gcgcacgtcg tgcagttgca 780 tttggcgaac tgccgctggc agaaattcgt cgtattcgtc gcgaactggg tggtagcgtt 840 aatgatgttg ttatggcact ggttgcaacc gcactgcatc gttggctgga taaacgtggt 900 gaactgccgg atcgtccgct ggttgcagcc gttccggtta gcctgcgtcg tggccgtgat 960 ggtgatgcag ccggtggtaa tcgtatgagc gcaatggtta cacctctggc aacccatctg 1020 gcagatccgg cagaacgttt tgcagcaatt cgtggtgatc tggcagcagc aaaacgtcgc 1080 tttgcacgta gcagcggtgc atggctggaa ggtctgagcg aactggttcc ggcacctctg 1140 gcaggtccgc tgctgcgtct ggcactgcag gcacgtccgg gtgaatatct gcgtccggtt 1200 aatctgctgg ttagcaatgt tccgggtccg gattttccgc tgtatctgcg tggtgcccgt 1260 gttctgggtt attttccgat tagcgttgtt agcgatctga ccggtggtct gaatattacc 1320 gttctgagct atgatggcaa actggatgtt ggtattgtta cctgtcgtca gatgattccg 1380

gatccgtggg aaattatgga tcatctggat gatgcactgg gtgaactgcg tggtctgatt gatggt 1440 1446

<210> <211> <212> <213> 2 482 PRT Thermomonospora curvata <220> Proteína aciltransferasa WS/DGAT/MGAT43183 <223> <400> 2 Met Arg Gln Leu Thr Ala val ASp Ala Asn Phe 1 5 10 (VP_003301387.1) de T. Leu Asn val Glu Thr 15 curvata DSM

Gly Thr Thr His Ala His 20 Ile Ala Gly Leu Gly Ile Leu ASp25 30 Pro Val

Ala cys Pro Gly Gly Arg 35 Leu Thr Ala Glu ASp40 Leu Ile Glu val 45 Ile

Arg Glu Arg Ala His 50 Leu Ala 55 pro Arg Pro Leu Arg60 Met Arg Leu Ala

Ala val 65 Pro Leu Gly rl e 70 ASp Arg Pro Tyr Trp Glu ASp ASp 75 Pro ASp80

Phe ASp pro Ala Arg 85 His Val phe Glu val 90 Gly Leu pro Ala Pro Gly 95

Asn Ala Ala Gln 100 Leu Ala ASp val val 105 Ala Met Leu His Glu Arg110 pro

Leu ASp Arg Ala Arg 115 Pro Leu Trp Glu Ala val 120 val rle Gln Gly 125 Leu

Glu Gly Gly Arg Thr Ala val 130 135 Tyr rle Lys val His 140 His Ala Ala Val

ASp Gly val 145 Leu Ala Thr Glu Thr 150 Leu Ala Ala 155 Leu Leu ASp Leu Ser 160

pro Gln Pro Arg Glu 165 Leu pro pro ASp ASp Thr val 170 Pro Gln Gln Ala 175

Pro Ala Leu Ala Glu Arg val 180 Arg Thr Gly Leu 185 Leu Arg Ala Leu Ala 190

His Pro val 195 Arg Gly Ala Arg Met 200 Leu Ala Arg Thr Ala Pro Tyr 205 Leu

ASp Glu Ile Pro Gly Leu Ala Gln Leu pro Gly val Gln Pro Leu Ala 210 215 220

Arg Ala Ile Gln Gly Ala Leu Gly Arg ASp Gly val val Pro Leu Pro 225 230 235 240

Arg Thr val Ala pro pro Thr pro phe Asn Gly Thr Ile Ser Ala Arg 245 250 255

Arg Ala val Ala phe Gly Glu Leu Pro Leu Ala Glu Ile Arg Arg Ile 260 265 270

Arg Arg Glu Leu Gly Gly Ser val Asn ASp val val Met Ala Leu val 275 280 285

Ala Thr Ala Leu H;S Arg Trp Leu ASp Lys Arg Gly Glu Leu Pro ASp290 295 300

Arg pro Leu val Ala Ala Val Pro val Ser Leu Arg Arg Gly Arg ASp305 310 315 320

Gly ASp Ala Ala Gly Gly Asn Arg Met Ser Ala Met val Thr pro Leu 325 330 335

Ala Thr H;S Leu Ala ASp pro Ala Glu Arg phe Ala Ala Ile Arg Gly 340 345 350

ASp Leu Ala Ala Ala Lys Arg Arg Phe Ala Arg Ser Ser Gly Ala Trp 355 360 365

Leu Glu Gly Leu Ser Glu Leu val pro Ala pro Leu Ala Gly pro Leu 370 375 380

Leu Arg Leu Ala Leu Gln Ala Arg pro Gly Glu Tyr Leu Arg pro val 385 390 395 400

Asn Leu Leu val Ser Asn val Pro Gly Pro ASp phe Pro Leu Tyr Leu 405 410 415

Arg Gly Ala Arg val Leu Gly Tyr Phe Pro Ile Ser val val Ser ASp420 425 430

Leu Thr Gly Gly Leu Asn Ile Thr val Leu Ser Tyr ASp Gly Lys Leu 435 440 445

ASp Val Gly Ile val Thr cys Arg Gln Met Ile Pro ASp Pro Trp Glu 450 455 460

Ile Met ASp H;s Leu ASp ASp Ala Leu Gly Glu Leu Arg Gly Leu Ile 465 470 475 480

ASp Gly