Sistema para la determinación de una neurotoxina tipo A no procesada y parcialmente procesada.

Un método para la determinación de la cantidad de polipéptido de la neurotoxina A parcialmente procesado y/o no procesado (BoNT/A) en una solución que comprende BoNT/A procesado y / o parcialmente procesado que comprende las etapas de:

i) poner en contacto una muestra de dicha solución con un anticuerpo de captura que se enlaza específicamente con el BoNT/A no procesado y/o parcialmente procesado bajo condiciones que permiten el enlazamiento de dicho anticuerpo con dicho BoNT/A parcialmente procesado y no procesado, por medio del cual se forma un complejo, y

ii) determinar la cantidad del complejo formado en la etapa i), por lo cual la cantidad del complejo es indicativa de la cantidad de BoNT/A parcialmente procesado y / o no procesado en dicha solución,

en donde el anticuerpo de captura se puede obtener por un método que comprende:

a) poner en contacto un antisuero policlonal de un animal que ha sido inmunizado por medio de un inmunógeno peptídico que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 1 con los siguientes péptidos de captura SLD, LDK, e YNK bajo condiciones que permiten la formación de los complejos de captura que contienen anticuerpos no específicos comprendidos por el antisuero policlonal y los péptidos de captura;

b) remover los complejos de captura del antisuero policlonal;

c) poner en contacto el antisuero policlonal con un péptido que comprende o que consiste esencialmente de la SEQ ID NO: 1 bajo condiciones que permitan la formación de un complejo que comprende el péptido mencionado anteriormente y un anticuerpo se enlaza específicamente con el polipéptido de la neurotoxina no procesado o parcialmente procesado. d) remover el complejo formado en la etapa c) del antisuero; y

e) liberar el anticuerpo que se enlaza específicamente con el polipéptido de la neurotoxina no procesado o parcialmente procesado de dicho complejo.

Sistema para la determinación de una neurotoxina tipo A no procesada y parcialmente procesada La presente invención se relaciona con herramientas para el control de calidad y de seguridad durante la producción de neurotoxinas. En particular, se relaciona con un método para la determinación de la cantidad de polipéptido de la neurotoxina A (BoNT/A) parcialmente procesado y/o no procesado en una solución que comprende BoNT/A procesado y parcialmente procesado y/o no procesado que comprende las etapas de poner en contacto una muestra de dicha solución con un anticuerpo de captura que se enlaza específicamente con BoNT/A parcialmente procesado y sin procesar bajo condiciones que permiten el enlazamiento de dicho anticuerpo con dicho BoNT/A parcialmente procesado y sin procesar, por medio de lo cual se forma un complejo, y determinar la cantidad del complejo formado, por medio de lo cual la cantidad del complejo es indicativa de la cantidad de BoNT/A parcialmente procesado y/o sin procesar en dicha solución. Además, la presente invención contempla un dispositivo y un kit para llevar a cabo dicho método.

Clostridium botulinum y Clostridium tetani producen neurotoxinas muy potentes, es decir, toxinas botulínicas (BoNT) y toxinas tetánicas (TeNT) , respetivamente. Estas neurotoxinas Clostridiales se enlazan específicamente con las células neuronales e interrumpen la liberación del neurotransmisor. Cada toxina se sintetiza como una proteína de cadena simple inactiva sin procesar de 150 kDa aproximadamente. El procesamiento postraduccional involucra la formación de puentes de disulfuro, y proteólisis limitada (de corte) por la (s) proteasa (s) bacteriana (s) . Las neurotoxinas activas consisten de dos cadenas, una cadena liviana con terminal N de aproximadamente 50 kDa y una cadena pesada con terminal C de aproximadamente 100 kDa, que se unen a través de un enlace de disulfuro. Las neurotoxinas estructural y funcionalmente consisten de tres dominios, es decir, la cadena liviana catalítica, la mitad del terminal N de la cadena pesada que abarca el dominio de translocación y la mitad del terminal C de la cadena pesada que contiene el (los) sitio (s) de enlazamiento del receptor, véase Krieglstein 1990, Eur J Biochem 188, 39; Krieglstein 1991, Eur J Biochem 202, 41; Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49. Las neurotoxinas botulínicas se sintetizan como complejos moleculares que comprenden la proteína de la neurotoxina de 150 kDa y proteínas complejantes no tóxicas asociadas. Los tamaños de los complejos difieren con base en la cadena Clostridial y los distintos serotipos de la neurotoxina con intervalos desde 300 kDa, por arriba de 500 kDa, hasta 900 kDa. Las proteínas complejantes no tóxicas en estos complejos estabilizan la neurotoxina y la protegen contra la degradación, véase Silberstein 2004, Pain Practice 4, S19 -S26.

La Clostridium botulinum secreta siete serotipos antigénicamente diferentes de neurotoxinas designadas desde A hasta G. Todos los serotipos junto con la TeNT relacionada secretada por Clostridium tetani, son endoproteasas con Zn+2 que bloquean la exocitosis sináptica por escisión de las proteínas SNARE, véase Couesnon, 2006, Microbiology, 152, 759. Las CNT provocan parálisis muscular flácida observada en botulismo y tétanos, véase Fischer 2007, PNAS 104, 10447.

A pesar de sus efectos tóxicos, el complejo de la toxina botulínica ha sido usado como un agente terapéutico en un gran número de enfermedades. El serotipo A de la toxina botulínica (BoNT/A) se aprobó para uso en humanos en los Estados Unidos de América en 1989 para el tratamiento del estrabismo, blefaroespasmo y otros trastornos y, por lo tanto, es de particular importancia. Se encuentra comercialmente disponible como la preparación de la proteína de BoNT/A, por ejemplo, bajo la marca registrada de BOTOX (Allergan Inc.) o bajo la marca registrada DYSPORT (Ipsen Ltd.) . Una preparación de BoNT/A mejorada que está libre de proteínas complejantes se encuentra comercialmente disponible bajo la marca registrada XEOMIN (Merz Pharmaceuticals GmbH) . Para aplicaciones terapéuticas, la preparación se inyecta directamente dentro del músculo que va a ser tratado. A pH fisiológico, la toxina se libera del complejo de la proteína y tiene lugar el efecto farmacológico deseado. El efecto de la toxina botulínica solo es temporal, por lo cual puede requerirse la administración repetida de la toxina botulínica para mantener el efecto terapéutico.

Las neurotoxinas Clostridiales debilitan la contracción del músculo y son una terapia efectiva para el estrabismo, la distonía focal, incluida la distonía cervical, y el blefaroespasmo esencial benigno. También han mostrado alivio en espasmos hemifaciales, y espasticidad focal, y además, de ser efectivas en una gran variedad de otras indicaciones, tales como trastornos gastrointestinales, hiperhidrosis, y corrección cosmética de arrugas, véase Jost 2007, Drugs 67, 669.

Durante el proceso de producción de las neurotoxinas Clostridiales, es de particular importancia la determinación cualitativa y cuantitativa así como el control de calidad del polipéptido de la neurotoxina activa. Actualmente las preparaciones de neurotoxina disponibles contienen diferentes cantidades de precursores proteolíticamente no procesados y/o de polipéptidos de la neurotoxina parcialmente procesados además de las neurotoxinas activas (procesadas o maduras) deseadas. El precursor proteolíticamente no procesado o los polipéptidos de la neurotoxina parcialmente procesados difieren de los polipéptidos maduros de la neurotoxina (activos, procesados) solo en unos pocos aminoácidos. Por lo tanto, estos pueden diferenciarse cuantitativamente difícilmente con base en sus propiedades químicas y físicas. Por otra parte, la porción del precursor proteolíticamente no procesado y/o de los polipéptidos de la neurotoxina parcialmente procesados del contenido total de la proteína aún puede ser significativa en tales preparaciones, es decir, es relevante para la actividad especifica de la preparación.

Se conocen bien en la técnica los ensayos para la determinación del contenido total de la neurotoxina en una preparación. Estos ensayos se basan en Inmuno-PCR o ELISA tipo Sándwich (Lindstrom 2006, Clin Microbiol. Rev. 19 (2) : 298 -314; Volland 2008, J. Immunol Methods 330 (1-2) : 120 - 129) . Sin embargo, como se expuso anteriormente, el contenido de neurotoxinas indeseadas parcialmente procesadas o sin procesar no puede determinarse por medio de la aplicación de estas técnicas para analizar el contenido total de la neurotoxina.

Por consiguiente, los medios y los métodos para determinar el contenido de las moléculas de neurotoxina no procesadas o parcialmente procesadas y, en particular, las moléculas de BoNT/A, en una preparación aún no se encuentran disponibles pero sin embargo son altamente deseables.

La presente invención, por lo tanto, se relaciona con un método para la determinación de la cantidad de polipéptido de la neurotoxina A (BoNT/A) no procesado y/o parcialmente procesado en una solución que contiene BoNT/A procesado y parcialmente procesado y / o no procesado que comprende las etapas de:

i) poner en contacto una muestra de dicha solución con un anticuerpo de captura que se enlaza específicamente con el BoNT/A no procesado y/o parcialmente procesado bajo condiciones que permiten el enlazamiento de dicho anticuerpo con dicho BoNT/A parcialmente procesado y no procesado, por medio del cual se forma un complejo, y

ii) determinar la cantidad del complejo formado en la etapa i) , por lo cual la cantidad del complejo es indicativa de la cantidad de BoNT/A parcialmente procesado y / o no procesado en dicha solución,

en donde el anticuerpo de captura se puede obtener por un método que comprende:

a) poner en contacto un antisuero policlonal de un animal que ha sido inmunizado por medio de un inmunógeno peptídico que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 1 (TKSLDKGYNKA) con los siguientes péptidos de captura SLD, LDK, y YNK bajo condiciones que permiten la formación de los complejos de captura que contienen anticuerpos no específicos comprendidos por el antisuero policlonal y los péptidos de captura;

b) remover los complejos de captura del antisuero policlonal;

c) poner en contacto el antisuero policlonal con un péptido que comprende o que consiste esencialmente de la SEQ ID NO: 1 bajo condiciones que permitan la formación de un complejo que comprende el péptido mencionado anteriormente y un anticuerpo se enlaza específicamente con el polipéptido de la neurotoxina no procesado o parcialmente procesado.

d) remover el complejo formado en la etapa c) del antisuero; y

e) liberar el... [Seguir leyendo]

1. Un método para la determinación de la cantidad de polipéptido de la neurotoxina A parcialmente procesado y/o no procesado (BoNT/A) en una solución que comprende BoNT/A procesado y / o parcialmente procesado que comprende las etapas de:

i) poner en contacto una muestra de dicha solución con un anticuerpo de captura que se enlaza específicamente con el BoNT/A no procesado y/o parcialmente procesado bajo condiciones que permiten el enlazamiento de dicho anticuerpo con dicho BoNT/A parcialmente procesado y no procesado, por medio del cual se forma un complejo, y

ii) determinar la cantidad del complejo formado en la etapa i) , por lo cual la cantidad del complejo es indicativa de la cantidad de BoNT/A parcialmente procesado y / o no procesado en dicha solución,

en donde el anticuerpo de captura se puede obtener por un método que comprende:

a) poner en contacto un antisuero policlonal de un animal que ha sido inmunizado por medio de un inmunógeno peptídico que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 1 con los siguientes péptidos de captura SLD, LDK, e YNK bajo condiciones que permiten la formación de los complejos de captura que contienen anticuerpos no específicos comprendidos por el antisuero policlonal y los péptidos de captura;

b) remover los complejos de captura del antisuero policlonal;

c) poner en contacto el antisuero policlonal con un péptido que comprende o que consiste esencialmente de la SEQ ID NO: 1 bajo condiciones que permitan la formación de un complejo que comprende el péptido mencionado anteriormente y un anticuerpo se enlaza específicamente con el polipéptido de la neurotoxina no procesado o parcialmente procesado.

d) remover el complejo formado en la etapa c) del antisuero; y

e) liberar el anticuerpo que se enlaza específicamente con el polipéptido de la neurotoxina no procesado o parcialmente procesado de dicho complejo.

2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho inmunógeno comprende además KLH.

3. El método de la reivindicación 2, en donde dicho KLH se enlaza con el péptido que tiene la SEQ ID NO: 1 a través del enlazador de éster de N-[gama-maleimidobutiriloxi]succinamida (GMBS) .

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dichas condiciones en la etapa i) incluyen la presencia de un detergente.

5. El método de la reivindicación 4, en donde dicho detergente es Tween 20.

6. El método de la reivindicación 4 o 5, en donde dicho detergente está presente en una concentración en el intervalo de 0, 01% (v/v) a 10% (v/v) .

7. El método de la reivindicación 6, en donde dicha concentración está en el intervalo de 0, 2% (v/v) a 0, 8% (v/v) o en el intervalo de 0, 3% (v/v) a 0, 6% (v/v) .

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dichas condiciones en la etapa i) incluyen la presencia de una solución salina amortiguada con fosfato o amortiguada con tris.

9. El método de la reivindicación 8, en donde dicha solución comprende NaCl con una concentración en el intervalo de 150 a 350 mM.

10. El método de la reivindicación 9, en donde dicha concentración está en el intervalo de 200 a 300 nM.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha etapa ii) comprende comparar la cantidad del complejo con una referencia por medio de lo cual se pueden asignar las cantidades determinadas de complejo a cantidades predefinidas del polipéptido de BoNT/A sin procesar.

12. Un dispositivo para la determinación de la cantidad del polipéptido de la neurotoxina A (BoNT/A) parcialmente procesado y/o no procesado en una solución que comprende polipéptidos de BoNT/A parcialmente procesados y/o no procesados, que comprende:

i) una unidad de análisis que comprende un anticuerpo de captura como se especificó en una cualquiera de las 5 reivindicaciones 1 a 3 en donde la unidad de análisis permite poner en contacto una muestra de dicha solución con dicho anticuerpo de captura, y

ii) una unidad de evaluación que comprende un sistema lector para determinar la cantidad de complejo formada en la unidad de análisis y un sistema para el procesamiento de los datos que permite el cálculo de la cantidad de los polipéptidos de BoNT/A parcialmente procesados y/o no procesados en dicha solución con base en la cantidad

determinada del complejo.

13. Un kit para la determinación de la cantidad de polipéptido de la neurotoxina A (BoNT/A) parcialmente procesado y/o no procesado en una solución que comprende polipéptidos de BoNT/A parcialmente procesados y/o no procesados, que comprende un anticuerpo de captura como se especifica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

14. El kit de la reivindicación 13, en donde dicho kit comprende además al menos un agente de detección para determinar la cantidad de un complejo que comprende el anticuerpo de captura y polipéptidos de BoNT/A parcialmente procesados y/o no procesados.