Proteínas utilizadas para el diagnóstico de una borreliosis de Lyme.

Proteína quimérica de fusión DbpA-OspC de Borrelia, seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una proteína cuya secuencia en aminoácidos comprende en su extremo N-terminal, la secuencia SEC ID nº 1 y en su extremo C-terminal, la secuencia SEC ID nº 2 o una variante de dicha proteína cuya secuencia en aminoácidos comprende una secuencia que presenta al menos el 40% de identidad con la SEC ID nº 1 y una secuencia que presenta al menos el 50% de identidad con la SEC ID nº 2, con la condición de que dicha variante sea capaz de formar un complejo inmunológico con unos anticuerpos producidos tras una infección por Borrelia o que dicha variante sea capaz de inducir a la producción de anticuerpos anti-Borrelia;

(b) una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende en su extremo N-terminal la secuencia SEC ID nº 3 y en su extremo C-terminal la secuencia SEC ID nº 4 o una variante de dicha proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende una secuencia que presenta al menos el 40% de identidad con la SEC ID nº 3 y una secuencia que presenta al menos el 50% de identidad con la SEC ID nº 4, con la condición de que dicha variante sea capaz de formar un complejo inmunológico con unos anticuerpos producidos tras una infección por Borrelia o que dicha variante sea capaz de inducir a la producción de anticuerpos anti-Borrelia;

(c) una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende en su extremo N-terminal la secuencia SEC ID nº 5 y en su extremo C-terminal la secuencia SEC ID nº 7 o una variante de dicha proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende una secuencia que presenta al menos el 40% de identidad con la SEC ID nº 5 y una secuencia que presenta al menos el 50% de identidad con la SEC ID nº 7, con la condición de que dicha variante sea capaz de formar un complejo inmunológico con unos anticuerpos producidos tras una infección por Borrelia o que dicha variante sea capaz de inducir a la producción de anticuerpos anti-Borrelia;

(d) una proteína que comprende en su extremo N-terminal la secuencia SEC ID nº 6 y en su extremo C-terminal la secuencia SEC ID nº 7 o una variante de dicha proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende una secuencia que presenta al menos el 40% de identidad con la SEC ID nº 6 y una secuencia que presenta al menos el 50% de identidad con la SEC ID nº 7, con la condición de que dicha variante sea capaz de formar un complejo inmunológico con unos anticuerpos producidos tras una infección por Borrelia o que dicha variante sea capaz de inducir a la producción de anticuerpos anti-borrelia;

(e) una proteína que comprende en su extremo N-terminal la secuencia SEC ID nº 5, la secuencia SEC ID nº 6 y en su extremo C-terminal la secuencia SEC ID nº 7 o una variante de dicha proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende una secuencia que presenta al menos el 40% de identidad con la SEC ID nº 5, una secuencia que presenta al menos el 40% de identidad con la SEC ID nº 6 y una secuencia que presenta al menos el 50% de identidad con la SEC ID nº 7, con la condición de que dicha variante sea capaz de formar un complejo inmunológico con unos anticuerpos producidos tras una infección por Borrelia o que dicha variante sea capaz de inducir a la producción de anticuerpos anti-Borrelia;

(f) una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende una secuencia seleccionada entre las SEC ID nºs 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14.

Proteínas utilizadas para el diagnóstico de una borreliosis de Lyme

La borreliosis de Lyme (LB) es una enfermedad infecciosa no contagiosa, debida a una espiroqueta denominada Borrelia burgdoferi, transmitida al hombre por una picadura de garrapata del género Ixodes. La LB, sin tratamiento, conlleva unos trastornos patológicos diversos (dermatológicos, artríticos, cardiacos, neurológicos y a veces oculares). Es la enfermedad por vector más frecuente en los EE.UU. y en algunos países templados del hemisferio norte.

Varias especies de borrelias, actualmente denominadas bajo el término de grupo burgdorferi o Borrelia burgdorferi sensu lato (que incluye Borrelia burgdorferi sensu stricto, B. garinii y B. afzelii) están implicadas en esta infección. Estas especies son patógenas para el hombre.

En los Estados Unidos, la especie infecciosa implicada es Borrelia burgdorferi sensu stricto. En Europa, a esta especie, se añaden B. garinii y B. afzelii. En Asia, las especies Implicadas son B. garinii y B. afzelii.

En los Estados Unidos, hay declarados aproximadamente 1. casos anuales. En Europa, las tasas de incidencia varían en menos de 5 por 1..

La borreliosis de Lyme evoluciona pasando por tres fases distintas, desde la infección precoz hasta la fase tardía. La fase precoz (fase I), puede ser asintomática o traducirse en un cuadro pseudogripal. En el 5-8% de los casos, se observa la aparición de una erupción cutánea inflamatoria varios días después de la picadura de la garrapata, de aspecto muy particular, denominada eritema migratorio (EM). En ausencia de tratamiento, la diseminación de la Borrelia por vía sanguínea se traduce algunas semanas más tarde en la aparición de artritis inflamatorias, de afecciones neurológicas (neuroborreliosis) y meníngeas, de manifestaciones cutáneas y cardiacas (fase II). Después de vahos meses o años, la enfermedad evoluciona hacia una forma crónica atrofiante, encefalopatía, encefalomielitis y artritis crónica (Fase III).

Existe un tropismo orgánico particular de cada una de las especies de Borrelia burgdorferi. Si la primera fase de eritema migratorio está relacionada indistintamente a las tres especies, la evolución hacia una forma neurológica está asociada preferiblemente a la especie B. garinii, las artritis lo está más a B-burgdorferi sensu stricto, y la acrodermatitis crónica atrofiante es específica de B-afzelii.

El parecido de los síntomas clínicos entre la borreliosis de Lyme y otras enfermedades no relacionadas, así como la variabilidad de las manifestaciones, hacen difícil el diagnóstico clínico. El diagnóstico de la borreliosis puede ser particularmente difícil en base a observaciones clínicas, si las pruebas de anamnesis están ausentes (picadura de garrapata o EM). La fase precoz de la enfermedad puede no ser aparente hasta el momento en el que alcanza fases

clínicas muy avanzadas.

Es por ello que el diagnóstico de LB se basa en signos clínicos, pero también en la detección de los anticuerpos específicos de patógenos de Borrelia burgdorferi en el suero, generalmente por ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) o también EIA, IFA. Los anticuerpos IgM anti-borrelia burgdorferi aparecen en general algunos días o semanas después del comienzo de la infección y pueden persistir durante la evolución de la enfermedad. La respuesta IgG es más tardía. La mayoría de los pacientes tienen las IgG aproximadamente un mes después del comienzo de la infección activa y estas IgG pueden también persistir durante años después de la exposición inicial y de la resolución de los síntomas.

En Europa, la evaluación de la respuesta serológica es complicada debido a la existencia de tres especies patógenas y de la variabilidad Ínter-especies para los antígenos inmunodominantes principales. Los antígenos actualmente utilizados de forma rutinaria para la detección de las IgG e IgM de LB son unas muestras celulares tratadas con ultrasonidos de Borrelia burgdorferi sensu lato. Los rendimientos de los ensayos serológicos con estos antígenos en términos de especificidad y de sensibilidad son muy variables. Así, debido a una especificidad insuficiente, que implica unas reactividades cruzadas con unos anticuerpos asociados a diferentes bacterias patógenas, en particular Treponema pallidium (agente etiológico de la sífilis), unas espiroquetas, rickettisies, erchiiia o Helicobacter pylori, el diagnóstico de las muestras ensayadas positivas en ELISA debe ser confirmado por ¡nmunotransferencia. La sensibilidad es también un factor importante. En efecto, Borrelia burgdorferi sensu lato expresa diferentes proteínas de superficie por adaptación a diversos microentornos, de manera que la diversidad genética y la expresión diferencial de los genes de Borrelia burgdorferi en los pacientes tienen unas implicaciones importantes para el desarrollo de ensayos serológicos de LB. La lipoproteína OspC (Outer-surface protein C) y la proteína DbpA (Decorin-binding protein A) pertenecen a estas proteínas. La DbpA aparece principalmente expresada en el mamífero después de la infección. Estas proteínas presentan una gran variabilidad de secuencias según las especies de Borrelia burgdorferi e Inter-especies. Las proteínas DbpA son particularmente variables y se reparten en cuatro grupos: un grupo que corresponde a la genoespecie Borrelia afzelii, otro grupo que corresponde a la genoespecie Borrelia sensu stricto y dos grupos que corresponden a la genoespecie Borrelia burgdorferi garinii.

La identidad de las secuencias de aminoácidos inter-especie entre las proteínas DbpA es sólo del 4-44%. Es del 54-72% para las proteínas OspC. El documento WO /788 describe una combinación de proteínas que comprenden DbpA y OspC, y su utilización en un procedimiento de diagnóstico de una Borreliosis de Lyme.

Por lo tanto, es necesario desarrollar un kit que responda a los criterios de especificidad y de sensibilidad esperados y en particular que mejora la detección de las IgM, en términos de sensibilidad, en el caso de infección reciente.

La presente invención se propone resolver el conjunto de los inconvenientes del estado de la técnica, mediante nuevas proteínas recombinantes quiméricas, fácilmente sintetizables y purificables, y que presentan una fuerte inmunorreactividad frente a sueros de pacientes susceptibles de ser infectados por una o varias especies patógenas de Borrelia burgdorferi. Estas proteínas de fusión quiméricas permiten paliar los problemas de sensibilidad y de especificidad relacionados: con la presencia de varias especies patógenas de Borrelia burgdorferi, con la gran variabilidad de las secuencias de los antígenos de superficie de Borrelia burgdorferi y con la necesidad de utilizar varios antígenos representativos de las especies B. garinii, B. burgdorferi sensu stricto y B, afzeiii para elaborar un ensayo de diagnóstico de la borreliosis de Lyme basado al menos en la detección de los anticuerpos anti-OspC y anti-DbpA.

Las proteínas de fusión quiméricas de la invención permiten por otra parte resolver las dificultades encontradas para expresar ciertos antígenos en forma recombinante a un nivel elevado. En efecto, a pesar de un trabajo importante sobre la construcción de los genes para obtener una expresión optimizada de estos en E. coli, los inventores han mostrado por primera vez que las proteínas OspC están poco expresadas en forma recombinante en E. coli, mientras que de manera muy imprevisible, han encontrado que las proteínas DbpA podían ser expresadas en las mismas condiciones en forma soluble en condiciones no desnaturalizantes y con unos rendimientos más elevados. La facilidad de expresión de las proteínas DbpA se ha explotado para crear unas proteínas quiméricas compuestas de DbpA y de OspC y los inventores han podido demostrar que las proteínas quiméricas estaban mejor expresadas que las proteínas OspC aisladas, lo que era completamente inesperado ya que no se ha descrito jamás, ni se ha sugerido, que las proteínas DbpA podían tener las propiedades de proteínas de fusión. Asimismo, a fin de mejorar los niveles de expresión, los inventores han concebido unas proteínas quiméricas DbpA-OspC utilizando las propiedades de fusión inesperadas de las proteínas DbpA para mejorar la expresión y la solubilidad de las proteínas quiméricas. En la construcción molecular para la expresión de una proteína quimérica de la invención, el gen que codifica para la proteína DbpA está integrado secuencia arriba del o de los que codifican para una o más proteínas OspC. En función de esta construcción molecular, la proteína quimérica de la invención presenta en su extremo N- terminal una secuencia que pertenece a una secuencia proteica DbpA, y en su extremo C-terminal... [Seguir leyendo]

1. Proteína quimérica de fusión DbpA-OspC de Borrelia, seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una proteína cuya secuencia en aminoácidos comprende en su extremo N-terminal, la secuencia SEC ID n° 1 y en su extremo C-terminal, la secuencia SEC ID n° 2 o una variante de dicha proteína cuya secuencia en aminoácidos comprende una secuencia que presenta al menos el 4% de identidad con la SEC ID n° 1 y una secuencia que presenta al menos el 5% de identidad con la SEC ID n° 2, con la condición de que dicha variante sea capaz de formar un complejo inmunológico con unos anticuerpos producidos tras una infección por Borrelia o que dicha variante sea capaz de inducir a la producción de anticuerpos anti-Borrelia;

(b) una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende en su extremo N-terminal la secuencia SEC ID n° 3 y en su extremo C-terminal la secuencia SEC ID n° 4 o una variante de dicha proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende una secuencia que presenta al menos el 4% de identidad con la SEC ID n° 3 y una secuencia que presenta al menos el 5% de identidad con la SEC ID n° 4, con la condición de que dicha variante sea capaz de formar un complejo inmunológico con unos anticuerpos producidos tras una infección por Borrelia o que dicha variante sea capaz de inducirá la producción de anticuerpos anti-Borrelia;

(c) una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende en su extremo N-terminal la secuencia SEC ID n° 5 y en su extremo C-terminal la secuencia SEC ID n° 7 o una variante de dicha proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende una secuencia que presenta al menos el 4% de identidad con la SEC ID n° 5 y una secuencia que presenta al menos el 5% de identidad con la SEC ID n° 7, con la condición de que dicha variante sea capaz de formar un complejo inmunológico con unos anticuerpos producidos tras una infección por Borrelia o que dicha variante sea capaz de inducir a la producción de anticuerpos anti-Borrelia;

(d) una proteína que comprende en su extremo N-terminal la secuencia SEC ID n° 6 y en su extremo C-terminal la secuencia SEC ID n° 7 o una variante de dicha proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende una secuencia que presenta al menos el 4% de identidad con la SEC ID n° 6 y una secuencia que presenta al menos el 5% de identidad con la SEC ID n° 7, con la condición de que dicha variante sea capaz de formar un complejo inmunológico con unos anticuerpos producidos tras una infección por Borrelia o que dicha variante sea capaz de inducir a la producción de anticuerpos anti-borrelia;

(e) una proteína que comprende en su extremo N-terminal la secuencia SEC ID n° 5, la secuencia SEC ID n° 6 y en su extremo C-terminal la secuencia SEC ID n° 7 o una variante de dicha proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende una secuencia que presenta al menos el 4% de identidad con la SEC ID n° 5, una secuencia que presenta al menos el 4% de identidad con la SEC ID n° 6 y una secuencia que presenta al menos el 5% de identidad con la SEC ID n° 7, con la condición de que dicha variante sea capaz de formar un complejo Inmunológico con unos anticuerpos producidos tras una infección por Borrelia o que dicha variante sea capaz de inducir a la producción de anticuerpos anti-Borrelia;

(f) una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende una secuencia seleccionada entre las SEC ID n°s 8, 9, 1, 11, 12, 13 y 14.

2. Ácido nucleico que codifica para una proteína tal como se ha definido en la reivindicación 1.

3. Casete de expresión que es funcional en una célula derivada de un organismo procariota o eucarlota, que permite la expresión de un ácido nucleico tal como se ha definido en la reivindicación 2, colocada bajo el control de los elementos necesarios para su expresión.

4. Vector que comprende un casete de expresión, tal como se define en la reivindicación 3.

5. Procedimiento para el diagnóstico in vitro de una Borreliosis de Lyme en una muestra biológica, según el cual se pone en contacto la muestra biológica con al menos una proteína tal como se define en la reivindicación 1, y se determina si hay formación de un complejo inmunológico entre dicha proteína y unos anticuerpos de la muestra biológica.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que los anticuerpos de la muestra biológica son unas IgG y/o unas IgM.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la formación del complejo inmunológico se determina por adición de al menos una anti-inmunoglobullna humana marcada por cualquier marcador apropiado.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que la proteína está Inmovilizada sobre un soporte sólido.

9. Equipo para el diagnóstico in vitro de una Borreliosis de Lyme que comprende al menos una proteína tal como se define en la reivindicación 1.

1. Equipo según la reivindicación 9, que comprende al menos una anti-inmunoglobullna humana marcada por

cualquier marcador apropiado.

11. Composición vaccínea que comprende al menos una proteína tal como se ha definido en la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.