Producción de bioplásticos.

Producción de bioplásticos.

Se ha aislado e identificado microorganismo de la especie Pseudomonas putida que resulta ser súper-productor y que

, de manera natural, es capaz: a) de metabolizar diferentes fuentes de carbono incluyendo derivados aromáticos, b) crecer a elevadas concentraciones celulares, y c) producir una gran cantidad de polihidroxialcanoatos o 3-hidroxiácidos.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201231305.

Solicitante: NEOL BIOSOLUTIONS, S.A.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: VELASCO ALVAREZ,JAVIER, LARA CAMBIL,ARMANDO, ADRIO FONDEVILA,JOSE LUIS, SUÁREZ GONZÁLEZ,Beatriz, MARTÍNEZ GARCÍA,Lorena, GIBERT AMAT,Jordi, RONCHEL BARRENO,Carmen.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/20 (Bacterias; Sus medios de cultivo)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/09 (Tecnología del ADN recombinante)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de compuestos orgánicos que contienen... > C12P7/42 (Acidos hidroxicarboxílicos)

PDF original: ES-2448823_A1.pdf

 

google+ twitter facebook

Fragmento de la descripción:

Producción de bioplásticos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la producción de polímeros plásticos y sus monómeros a partir de cultivos de un microrganismo en presencia de diferentes fuentes de carbono.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En los últimos años se ha producido un gran desarrollo de los plásticos obtenidos a partir de fuentes renovables. La Comisión Europea en su “Lead Markets Iniciative” (Final Evaluation of the Lead Market Iniciative, 2011) ha identificado a los plásticos obtenidos a partir de fuentes renovables como uno de los mercados de mayor importancia. El elevado precio del petróleo y los problemas de polución que generan los plásticos tradicionales ha provocado que se desarrollen nuevas tecnologías para producir materiales con características similares a los productos petroquímicos, que ofrezcan otras vías de recuperación y reciclado para ayudar a reducir el impacto sobre el medio ambiente. Entre estos materiales se incluyen los polihidroxialcanoatos (PHAs) , las polilactonas, ciertos poliésteres alifáticos, algunos polisacáridos y copolímeros derivados del petróleo (Shen et al. 2010. Biofuels Bioprod. Bioref., 4, 25-40; Gavrilescu et al. 2005. Biotechnol. Adv., 23, 471-499) . Los PHAs constituyen una familia de poliésteres de 3, 4, 5 y 6 hidroxiácidos sintetizados por diferentes grupos de microorganismos que se acumulan en el interior celular en forma de gránulos cuyo número y tamaño varía entre diferentes especies y sirven como compuestos de reserva de carbono y energía (Chen GQ. 2010. Plastics from Bacteria: Natural Functions and applications, GQ Chen Ed., Springer, 17-37) .El 30% de las bacterias del suelo tienen la capacidad de sintetizar PHA (Wu et al., 2000. Acta Polym. Sin. 6, 751-756) . Dependiendo del número de átomos de carbono de la unidad monomérica los PHAs se clasifican en PHAs de cadena corta (contienen de 3-5 átomos de carbono) y PHAs de cadena media (contienen 6-14 átomos de carbono) .

La biosíntesis de polihidroxialcanoatos depende principalmente del microorganismo y de la fuente de carbono utilizada, diferentes rutas metabólicas están relacionadas con la formación de moléculas de hidroxiacil-CoA, principal precursor de los PHA. Por otra parte, sus propiedades físico-químicas varían considerablemente dependiendo de su composición monomérica y su estructura química. Hasta el momento se han descrito más de 150 monómeros diferentes producidos por bacterias a partir de diferentes fuentes de carbono (Steinbüchel y Valentin. 1995. FEMS Microbiol. Lett. 128, 219-228) , lo que da una idea de la gran diversidad de PHAs que pueden ser sintetizados y el amplio rango de propiedades físicas y mecánicas que pueden llegar a tener. Además, éstos bioplásticos son biodegradables y biocompatibles, lo que lo hacen muy adecuados para aplicaciones médicas y los 3-hidroxiácidos obtenidos de su despolimerización son compuestos con el elevado potencial biotecnológico.

Se han descrito las rutas metabólicas para la síntesis de PHA en diversos grupos de bacterias (Cupriavidus necátor, Rhodosporillum rubrum, Pseudomonads) . Uno de los grupos más estudiados son las especies del género Pseudomonas, las cuales son capaces de acumular PHA a partir de ácidos grasos obtenidos a partir de las rutas de β-oxidación y síntesis de novo (Rhem. 2010. Nature 8, 578-592; Koller et al. 2010. Food Technol. Biotechnol. 48, 255–269) Los genes implicados en la biosíntesis de PHAmcl han sido caracterizados en varias especies de Pseudomonas y en todas ellas los genes están agrupados en el cluster pha, el cual está muy conservado entre cepas. El cluster está compuesto por dos genes que codifican para PHA sintasas (phaC1 y phaC2) , el gen phaZ que codifica para una despolimerasa responsable de la movilización de PHA y el gen phaD que codifica un regulador transcripcional. Además existen otros dos genes en el cluster, phaF y phaI que codifican las fasinas.

A pesar de la gran variabilidad de PHA que pueden ser sintetizados por los microorganismos, tan solo unos pocos se producen a escala industrial para su comercialización debido a los elevados costes de producción. La producción de PHA involucra pasos de fermentación, separación de la biomasa del caldo de cultivo, secado de la biomasa y la extracción, purificación y secado del PHA (Queiroz et al. 2009. Polymer Reviews. 49, , 65-78; Shen et al. 2010. Biofuels, Bioprod. Bioref. 4, 25–40.) . El aislamiento de cepas superproductoras de PHA, el aumento de la tasa de conversión de sustrato en PHA, el diseño de un buen proceso de fermentación o la optimización de los procesos de extracción y purificación son factores claves para conseguir un proceso rentable a nivel industrial para la producción de PHA

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención tiene por objetivo resolver desde el punto de vista estratégico, económico y técnico la producción de polímeros plásticos de origen microbiano (polihidroxialcanoatos) y los monómeros que los forman (3-hidroxiácidos) .

Los autores de la presente invención han desarrollado un procedimiento para la producción de polímeros plásticos de origen microbiano (bioplásticos) y de los monómeros que los forman. El procedimiento se basa en la utilización de un nuevo microorganismo, que resulta ser súper-productor y que, de manera natural, es capaz: a) de metabolizar diferentes fuentes de carbono incluyendo derivados aromáticos, b) crecer a elevadas concentraciones celulares, y c) producir una gran cantidad de polihidroxialcanoatos o 3-hidroxiácidos. Ambos procesos de producción alcanzan elevados rendimientos de forma rápida, sencilla y con un bajo coste de producción.

En un primer aspecto la invención se relaciona con un microorganismo de la especie Pseudomonas putida depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con número de acceso CECT 8092. Dentro de dicho primer aspecto, la invención también se relaciona con un microorganismo de la especie Pseudomonas putida CECT 8092 que presenta una deleción en los genes fadB y fadA y, finalmente, con un microorganismo de la especie Pseudomonas putida CECT 8092, que presenta una deleción en los genes fadB y fadA, y que contiene al menos una copia adicional del propio gen phaZ o, expresado de otra manera, que presenta una mayor dosis génica del propio gen phaZ.

En un segundo aspecto la invención se relaciona con un cultivo biológicamente puro de cada uno de los microorganismos referidos en el párrafo anterior.

En un tercer aspecto la invención se relaciona con un procedimiento para la obtención de bioplásticos que comprende las siguientes etapas:

a. cultivo de un microorganismo seleccionado entre Pseudomonas putida CECT 8092 y Pseudomonas putida CECT 8092∆fadBA, en presencia de al menos una fuente de carbono que incluye un ácido carboxílico, y de al menos una fuente de nitrógeno,

b. separación de la biomasa microbiana del caldo de cultivo,

c. extracción del bioplástico de la biomasa microbiana obtenida en la etapa anterior y, opcionalmente,

d. purificación del bioplástico

En un cuarto aspecto la invención se relaciona con un procedimiento para la obtención de 3-hidroxiácidos que comprende las siguientes etapas:

a. cultivo de Pseudomonas putida CECT 8092∆fadBA que contiene al menos una copia adicional del propio gen phaZ, en presencia de al menos una fuente de carbono que incluye un ácido arilcarboxílico, y de al menos una fuente de nitrógeno,

b. separación de la biomasa microbiana del caldo de cultivo, y

c. extracción de los 3-hidroxiácidos del caldo de cultivo obtenido en la etapa anterior.

En un aspecto adicional, la invención se relaciona... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un microorganismo de la especie Pseudomonas putida depositado en la Colección Española de Cultivos 5 Tipo (CECT) con número de acceso CECT 8092.

2. Un microorganismo según la reivindicación 1 que presenta una deleción en los genes fadB y fadA.

3. Un microorganismo según la reivindicación 2 que contiene al menos una copia adicional del propio gen

phaZ

4. Cultivo biológicamente puro de un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Procedimiento para la obtención de bioplásticos que comprende las siguientes etapas:

a. cultivo de un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 en presencia de al menos una fuente de carbono que incluye un ácido carboxílico, y de al menos una fuente de nitrógeno,

b. separación de la biomasa microbiana del caldo de cultivo,

c. extracción del bioplástico de la biomasa microbiana obtenida en la etapa anterior y, opcionalmente,

d. purificación del bioplástico.

6. Procedimiento según la reivindicación 5 en el que el ácido carboxílico presenta una cadena lineal.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 y 6 en el que el ácido carboxílico es un ácido arilcarboxílico, preferiblemente n-arilcarboxílco o un ácido graso.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 en el que el ácido carboxílico sin sustitución aromática tiene entre 4 y 14, preferiblemente entre 6 y 12 átomos de carbono, y el ácido arilcarboxílico tiene entre 10 y 32 átomos de carbono y preferiblemente es n-fenilcarboxílico.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 en que la fuente de carbono también incluye glucosa, lactosa, glicerol, melazas, manosa, fructosa, acetato, o combinaciones de los mismos.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 en donde los polímeros obtenidos contienen 3-hidroxiácidos con cadenas alifáticas de longitud de entre 3 y 13, preferiblemente entre 5 y 11 átomos de carbono.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 en el que los polímeros obtenidos contienen al menos un residuo aromático, preferiblemente fenilo.

12. Procedimiento para la obtención de 3-hidroxiácidos que comprende las siguientes etapas:

a. cultivo de un microorganismo según la reivindicación 3 en presencia de al menos una fuente de carbono que incluye un ácido arilcarboxílico, y de al menos una fuente de nitrógeno, 45 b. separación de la biomasa microbiana del caldo de cultivo, y

c. extracción de los 3-hidroxiácidos del caldo de cultivo de la etapa anterior.

13. Procedimiento según la reivindicación 12 en el que el ácido arilcarboxílico presenta una cadena alquílica lineal.

14. Procedimiento según la reivindicación 13 en la que el ácido arilcarboxílico es un ácido n-arilcarboxílico.

15. Procedimiento según la reivindicación 14 en el que el ácido n-arilcarboxílico tiene entre 10 y 32 átomos de

carbono, preferiblemente es un n-fenilcarboxílico. 55

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 en el que la fuente de carbono también incluye glucosa, lactosa, glicerol, melazas, manosa, fructosa, acetato o combinaciones de los mismos.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16 en el que los hidroxiácidos obtenidos contienen al menos un residuo aromático, preferiblemente fenilo, y una cadena alifática de longitud entre 3 y 10, preferiblemente entre 4 y 8 átomos de carbono.

18. Uso de un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 en la obtención de biopolímeros.

19. Uso de un microorganismo según la reivindicación 3 en la obtención de 3-hidroxiácidos.

20. Uso de un polinucleótido que presenta la secuencia de nucleótidos del gen phaZ mostrada en la SEQ. ID NO: 5 para aumentar el rendimiento en la obtención de 3-hidroxiácidos por un microorganismo según la reivindicación 2.

gaacgaattc accgtcaagg cgccggaaga cgtcaccctg atggacgttt cgccgaagca ggttgtttcc gttgcagcgt cgctgattcc gttcctcgag cacgacgacg ccaaccgtgc

gttgatgggt tcgaacatgc agcgtcaggc tgtaccaacc ctgcgtgccg acaagccgct

ggtaggtacc ggcatggagc gcaacgttgc ccgtgactcc ggtgtctgtg tggttgctcg 780

ccgcggtggt gtgatcgact cggtcgacgc tagccgtatc gttgttcgcg ttgccgacga 84 O

cgaagtggaa accggcgaag caggtgtgga tatctacaac ctgaccaagt acacccgttc 900

gaaccagaac acctgcatca accagcgtcc gctggtgagc aaaggtgaca aggttcagcg 960

tggtgacatc atggccgacg gcccgtccac cgacatgggt gagctggctc tgggtcagaa 102 O

catgcgcatc gcgttcatgg cgtggaacgg cttcaacttc gaagactcca tctgcctgtc 1080

cgagcgtgtg gttcaggaag atcgcttcac caccatccac attcaggaac tgacctgtgt 1140

ggcgcgtgac accaagctcg gcccagagga aatcactgcg gacatcccga acgtgggtga 1200

agccgcactg aacaagctgg acgaagccg 1229

<210> 2

<211> l460

<212> DNA

<213> Pseudomonas putida, ARN ribosomal 16S

<400> 2 attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc ggatgacggg agcttgctcc

ttgattcagc ggcggacggg tgagtaatgc ctaggaatct gcctggtagt gggggacaac

gtttcgaaag gaacgctaat accgcatacg tcctacggga gaaagcaggg gaccttcggg

ccttgcgcta tcagatgagc ctaggtcgga ttagctagtt ggtggggtaa tggctcacca aggcgacgat ccgtaactgg tctgagagga tgatcagtca cactggaact gagacacggt

ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca atgggcgaaa gcctgatcca 360

gccatgccgc gtgtgtgaag aaggtcttcg gattgtaaag cactttaagt tgggaggaag 42 O

ggcagtaagc taataccttg ctgttttgac gttaccgaca gaataagcac cggctaactc 480

tgtgccagca gccgcggtaa tacagagggt gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa 54 O

agcgcgcgta ggtggtttgt taagttggat gtgaaagccc cgggctcaac ctgggaactg 600

catccaaaac tggcaagcta gagtacggta gagggtggtg gaatttcctg tgtagcggtg 660

aaatgcgtag atataggaag gaacaccagt ggcgaaggcg accacctgga ctgatactga 720

cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt 780

aaacgatgtc aactagccgt tggaatcctt gagattttag tggcgcagct aacgcattaa 84 O

gttgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg 900

cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggccttg 960

acatgcagag aactttccag agatggattg gtgccttcgg gaactctgac acaggtgctg 102 O

catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgtaac gagcgcaacc 1080

cttgtcctta gttaccagca cgttatggtg ggcactctaa ggagactgcc ggtgacaaac 1140

cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat catggccctt acggcctggg ctacacacgt 1200

gctacaatgg tcggtacaga gggttgccaa gccgcgaggt ggagctaatc tcacaaaacc 1260

gatcgtagtc cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga agtcggaatc gctagtaatc 132 O

gcgaatcaga atgtcgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc l380

atgggagtgg gttgcaccag aagtagctag tctaaccttc gggaggacgg ttaccacggt l440

gtgattcatg actggggtga l460

<210> 3

<211> 1176

<212> DNA

<213> Pseudomonas putida, gen fadA

<400> 3

atgagcctga atccaagaga cgtggtgatt gtcgacttcg gtcgcacgcc aatgggccgc 60

tccaagggtg gcatgcaccg caacacccgc gccgaagaca tgtcggcgca cctgatcagc 120

aagctgctgg aacgcaacgg caaggttgac ccgaaagaag tcgaggacgt gatctggggc 180

tgcgtcaacc agaccctgga gcagggctgg aacatcgccc gcatggcctc gctgatgacc 240

cagatcccgc acacttccgc ggcgcagacc gtcagccgcc tgtgcggctc gtccatgagc 300

gcgctgcaca cggccgccca ggcgatcatg accggtaacg gtgatgtgtt cgtggtcggt 360

ggcgtggagc acatgggcca cgtcagcatg atgcatggcg tagaccccaa cccgcacctg 420

tccttgcatg ccgccaaggc ttccgggatg atgggcctga ctgcagaaat gctcggcaag

atgcacggca tcacccgtga gcagcaggac ctgttcggct tgcgttcgca ccagctggcc 54 O

cacaaggcca cggtcgaagg caagttcaag gacgagatca tcccgatgca gggctacgac

gagaacggct tcctgaaggt gttcgatttc gacgaaacca ttcgcccgga aaccaccctc

gaaggcctgg catcgctgaa gcctgcgttc aacccgaaag gcggtacggt cacggccggt

acctcgtcgc agatcaccga cggcgcctcg tgcatgatcg tcatgtccgg tcagcgtgcc 780

atggacctcg gtatccagcc attggcggtg atccgttcga tggcagtggc cggtgtcgac 84 O

ccggcaatca tgggctacgg cccggtgcca tcgacccaga aagccctcaa gcgtgcgggc 900

ttgaccatgg ccgatatcga cttcatcgag ctcaacgaag ccttcgctgc acaggccctg 960

cccgtgctga aagacttgaa agtgctcgac aagatggatg agaaggttaa cctgcacggc 102 O

ggcgccattg ctttgggcca cccgtttggt tgctccgggg cgcggatttc cggcaccctg 1080

ctcaacgtca tgaagcaaaa tggcggtacg ctgggtgttg cgaccatgtg cgtcggcctg 1140

ggccaaggta tcaccactgt ctttgaacgc gtctga 1176

<210> 4

<211> 2148

<212> DNA

<213> Pseudomonas putida , gen fadB

<400> 4 atgatttacg aaggtaaagc catcacggtt aaggctcttg aaagtggcat cgtcgagctc

aagttcgacc tcaagggtga gtccgtcaac aagttcaacc gccttaccct gaacgagctg

cgccaggccg tcgatgccat ccaggccgat gcctcggtca aaggcgtgat cgtcagcagt

ggcaaggacg tgttcatcgt cggcgccgac atcaccgagt tcgtcgacaa cttcaagctg

cctgaggccg aactggtcgc cggcaacctg gaagccaatc gtatcttcaa cgccttcgaa gacctcgaag tgccgaccgt tgccgccatc aacggcatcg cgctgggcgg cggcctggaa atgtgcctgg cggccgacta ccgggtcatg tccaccagcg ccaggatcgg cctgccggaa 42 O

gtcaagctgg gtatctaccc gggctttggc ggtaccgtgc gcctgccgcg cctgatcggc 480

tcggacaacg ccatcgagtg gatcgccgcc ggcaaggaaa accgtgccga agacgccctg 54 O

aaagtggggg ccgtcgacgc ggtggtcgcc cctgagctgc tgctggccgg tgccctcgac 600

ctgatcaagc gtgccatcag tggcgagctg gactacaagg ccaagcgcca gccgaagctg 660

gaaaagctca agctcaatgc catcgagcag atgatggcct tcgagacggc caagggcttc 720

gtcgctggcc aggccggccc gaactaccca gccccggtcg aagcaatcaa gagcatccag 780

aaagccgcca acttcggtcg cgacaaggcc ctggaagttg aagccgcagg ctttgccaag 84 O

ctggccaaga cctcggtcgc cgagagcctg atcggcttgt tcctcaacga tcaggaactc 900

aagcgcaagg ccaaggcgca tgacgagatc gcccacgacg tgaagcaggc cgccgtgctc 960

ggcgccggca tcatgggcgg cggtatcgcc taccagtcgg cggtcaaagg tacgccgatc 102 O

ctgatgaaag acatccgcga agaagccatt cagctgggtc tgaacgaggc ctccaagttg 1080

cttggcaacc gcgtcgagaa gggccgcctg accccagcca agatggccga ggccctcaac 1140

gccattcgac cgaccctgtc ctatggcgat tttgccaatg tcgacatcgt cgtcgaggca 1200 gtggtcgaga acccgaaggt caagcaagcg gtactggcgg aagtggaagg ccaggtgaag 1260

gacgatgcga tcctcgcttc caacacctct accatctcta tcaacctgct ggccaaggcg 132 O

ctcaagcgcc cggaaaactt cgtcggcatg cacttcttca acccggtgca catgatgccg l380

ctggtggaag tgatccgtgg tgagaagtcc agtgacgtgg cggtcgccac caccgtggcc l440

tacgccaaga aaatgggcaa gaacccgatc gtggtcaacg actgcccggg ctttttggtc 1500

aaccgcgtgc tgttcccgta ctttggcggt tttgccaagc tggtcagcgc cggtgtcgac 1560

ttcgtgcgca tcgacaaggt catggagaag ttcggctggc cgatgggccc agcctacttg 1620

atggacgtgg tcggcatcga caccggccac cacggccgtg acgtcatggc cgaaggcttc 1680

ccggatcgca tgaaggacga gcgccgctcg gcagtcgacg cgttgtacga ggccaaccgc 1740

ctgggccaga agaacggtaa gggcttctac gcctacgaaa ccgacaagcg cggcaagccg 1800

aagaaggttt tcgatgccac cgtgctcgac gtgctcaaac cgatcgtgtt cgagcagcgc 1860

gaagtcactg acgaagacat catcaactgg atgatggtcc cgctgtgcct ggagaccgtg 192 O

cgttgcctgg aagacggcat cgtcgaaacc gctgccgaag ccgacatggg cctggtctac 1980

ggcattggtt tccctccctt ccgcggtggt gcgctgcgtt acatcgactc gatcggtgtg 2040

gccgaattcg tcgccctggc cgatcagtat gccgacctgg ggccgctgta ccacccgacc 2100

gccaagctgc gtgaaatggc caagaacggc cagcgcttct tcaactga <210> 5 <211> 852

<212> DNA

<213> Pseudomonas putida, gen phaZ

<400> 5 atgccgcaac cctatatttt caggaccgtc gagctggacc accagtccat ccgcaccgct

gttcgccccg gcaaaccgca cctgacgccg ttgctgatct tcaacggcat cggcgccaac 120

ctcgagctgg tgttcccgtt catcgatgca cttgacccgg acctggaagt catcgccttc 180

gatgtgcctg gggtcggcgg ctcgtccaca ccacgccacc cgtatcgctt ccctgggctg 240

gccaagctga ccgcacgcat gctcgactac ctcgactacg gccaggtcaa cgtcatcggc 300

gtgtcctggg gcggcgccct ggcccagcag tttgctcacg attaccccga gcgctgcaag 360

aaactggtgc tggccgccac cgctgccggt gcggtaatgg tgccaggcaa gcccaaggtg 420

ctgtggatga tggccagccc ccggcgttac gtgcagccgt cgcatgtcat ccgcattgca 480

ccgatgatct atggcggcgg cttccgacgt gaccccgacc tggccatgca ccatgctgcc 540

aaagtgcgct ccggcggcaa gctgggctac tactggcagc tgttcgccgg gctgggctgg 600

accagcatcc actggctgca caagatccag cagcccaccc tggtactggc cggtgacgac 660

gacccgctga tcccgctgat caacatgcgc ctgctggcct ggcggattcc caatgcccag 720

ctacacatta tcgacgacgg ccatctgttc ctgatcaccc gtgccgaagc cgtcgccccg

atcatcatga agttcctgca ggaagaacgt cagcgtgcgg tcatgcatcc ccgtccggcc

tcgggggggt ga