Proceso mejorado para la preparación de fosfolípidos oxidados.

Un método para preparar un compuesto de la fórmula general II a continuación que tiene una estructuraglicerólica y por lo menos un residuo que contiene un resto oxidado unido a la posición sn-2 de la estructuraglicerólica vía un enlace éter,

y que tiene adicionalmente un resto que contiene fósforo unido a la posición sn-3 de laestructura glicerólica,

Fórmula II

en la que:

A1 se selecciona del grupo que consiste en CH2, CH≥CH y C≥O;

A2 es CH2;

R1 es un alquilo que tiene 1-30 átomos de carbono;

R2 es

mientras que:

X es una cadena alquílica que tiene 1-24 átomos de carbono;

Y se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxi, alquilo, alcoxi, haluro, acetoxi y un grupo funcionalaromático; y

Z se selecciona del grupo que consiste en:**Fórmula**

Proceso mejorado para la preparación de fosfolípidos oxidados Campo y antecedentes de la invención La presente invención se refiere al campo de la química sintética, y más particularmente, a nuevos procedimientos sintéticos útiles para la preparación de fosfolípidos oxidados como se define en la presente memoria.

En la técnica de la farmacología, los fosfolípidos modificados son conocidos en muchas aplicaciones. En la patente de EE.UU. No. 5.985.292 se describen composiciones para aplicación transdérmica y transmembrana que incorporan compuestos activos solubles en lípido que llevan fosfolípidos. En las patentes de EE.UU. Nos. 6.261.597,

6.017.513 y 4.614.796 se describen derivados de fosfolípido incorporados en liposomas y biovectores para suministro de fármaco. En las patentes de EE.UU. No. 5.660.855 se describen construcciones de lípido de colesterol derivatizado con aminomanosa apropiadas para marcar células o tejido de músculo liso, formuladas en liposomas. Estas formulaciones tienen como objetivo reducir la restenosis en arterias, usando procedimientos de PTCA.

El uso de liposomas para tratar la aterosclerosis ha sido descrito adicionalmente en la solicitud de patente PCT publicada como WO 95/23592. En ella se describen composiciones farmacéuticas de liposomas unilamelares que pueden contener fosfolípidos. Los liposomas descritos en el documento WO/23592 tienen como objetivo optimizar el eflujo de colesterol de la placa aterosclerótica y son típicamente fosfolípidos no oxidados.

Se sabe que los derivados de fosfolípido modificado que simulan las estructuras del factor de activación de plaquetas (PAF) son farmacéuticamente activos, afectando a tales funciones como permeabilidad vascular, presión sanguínea e inhibición de la función cardíaca. En la patente de EE.UU. No. 4.778.912 se sugiere que un grupo de tales derivados tiene actividad anticáncer.

En la patente de EE.UU. No. 4.329.302 se describen compuestos sintéticos de 1-O-alquil-éter- o 1-O-acilo grasofosfoglicéridos que son derivados de lisolecitina usables para mediar en la activación de plaquetas. En la patente de EE.UU. No. 4.329.302 se describe que la acilación de la cadena pequeña de lisolecitina dio lugar a compuestos con comportamiento de activación de plaquetas al contrario que la acilación de la cadena larga, y que los derivados de O-alquil-éter son biológicamente superiores a los correspondientes derivados de O-acilo graso en simular el PAF.

El efecto estructural de varios fosfolípidos sobre su actividad biológica ha sido investigado por Tokumura et al. (Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, July 1981, vol. 219. No.1) y en la patente de EE.UU. No. 4.827.011, con respecto a la hipertensión.

En la patente suiza CH 642.665 se describen derivados de éter modificado con fosfolípido que pueden tener algún efecto fisiológico.

Davies et al. (J. Biol. Chem. 2001, 276:16015) enseñan el uso de fosfolípidos oxidados como agonistas de receptor activado por proliferador de peroxisoma.

En la patente de EE.UU. No. 6.838.452 y en el documento WO 04/106486 (que se incorporan como referencia como si se describieran en la presente memoria completamente) , por el presente cesionario, se describe la preparación de bien definidos fosfolípidos oxidados, así como, otro componente de LDL (lipoproteína de baja densidad) oxidada sintética. Se dice que los compuestos descritos son muy efectivos para tratar la aterosclerosis y enfermedades relacionadas, así como enfermedades autoinmunes y trastornos inflamatorios. Se dice adicionalmente que el fosfolípido oxidado regula la respuesta inmune a LDL oxidada. Se dice adicionalmente que generalmente, los fosfolípidos oxidados eterificados son superiores a los fosfolípidos oxidados esterificados comparables como agentes terapéuticos.

La oxidación de fosfolípidos ocurre in vivo por medio de la acción de radicales libres y reacciones enzimáticas abundantes en la placa ateromatosa. La preparación in vitro de fosfolípidos oxidados usualmente implica la oxidación química simple de una LDL nativa o componente fosfolípido de LDL. Los investigadores que estudian el papel de la LDL oxidada han empleado, por ejemplo, iones ferrosos y ácido ascórbico (Itabe H., et al., J. Biol. Chem. 1996; 271:33208-217) y sulfato de cobre (George, J. et al., Atherosclerosis. 1998; 138:147-152; Ameli, S. et al., Arteriosclerosis Thromb Vasc Biol 1996; 16:1074-79) para producir moléculas de fosfolípido oxidado o suavemente oxidado similares a las asociadas a componentes de la placa. Se ha mostrado que moléculas similarmente preparadas son idénticas a los auto-antígenos asociados a aterogénesis (Watson A.D. et al., J. Biol. Chem. 1997; 272:13597-607) y capaces de inducir tolerancia inmune anti-aterogénica protectora (solicitud de patente de EE.UU. No. 09/806.400 de Shoenfeld et al., presentada el 30 de septiembre de 1999) en ratones. Similarmente, en la patente de EE.UU. No. 5.561.052, se describe un método para producir lípidos oxidados y fosfolípidos usando sulfato de cobre y superóxidodismutasa para producir ácido araquidónico o linoléico oxidados y LDL oxidada para uso en diagnóstico.

Las técnicas de oxidación descritas anteriormente para preparar fosfolípidos oxidados implican reacciones que no son específicas y dan una mezcla de productos oxidados. La no especificidad de las reacciones reduce el

rendimiento, requiere una etapa de separación adicional y plantea la preocupación por los efectos secundarios no deseados cuando los productos se integran en composiciones farmacéuticas.

La 1-palmitoil-2- (5-oxovaleroil) -sn-glicero-3-fosfocolina (POVPC) y sus derivados tales como 1-palmitoil-2-glutaroilsn-glicero-3-fosfocolina (PGPC) son ejemplos representativos de fosfolípidos esterificados suavemente oxidados que se han estudiado con respecto a la aterogénesis (véase, por ejemplo, Boulier et al., J. Biol. Chem. 2000, 275:9163; Subbanagounder et al., Circulation Research, 1999, págs. 311) . El efecto de diferentes análogos estructurales que pertenecen a esta clase de fosfolípidos oxidados ha sido estudiado también (véase, por ejemplo, Subbanagounder et al., Aterioscler. Thromb. Nasc. Biol. 2000, págs. 2248; Leitinger et al., Proc. Nat. Ac. Sci. 1999, 96:12010) .

La POVPC se prepara típicamente proporcionando una fosfatidilcolina que lleva un ácido graso insaturado y oxidando el enlace insaturado del ácido graso, por ejemplo, por ozonolisis (escisión oxidativa) o usando un per y odato como agente oxidante. Tal ruta sintética típicamente implica una síntesis multietapa y requiere la separación de la mayoría de los intermedios formados por medio de cromatografía en columna.

Como se describe en la patente de EE.UU. No. 6.838.452 citada anteriormente, los fosfolípidos oxidados eterificados se han preparado similarmente oxidando un enlace insaturado de un ácido graso unido a una estructura de fosfolípido. Más particularmente, los fosfolípidos oxidados eterificados se prepararon, según las enseñanzas de esta patente, introduciendo un ácido graso corto insaturado en un glicerolípido, introduciendo un resto fosfato en el intermedio obtenido y oxidando el enlace insaturado en la cadena de ácido graso por medio de (i) peróxido de hidrógeno y ácido fórmico, para obtener un diol, seguido de per y odato de potasio, para obtener un aldehído; o (ii) ozonolisis. Aunque, la escisión oxidativa del enlace insaturado da como resultado un resto aldehído, se obtuvieron otros restos oxidados (por ejemplo, ácido carboxílico, acetal, etc.) oxidando adicionalmente el resto aldehído. Tal ruta sintética multietapa está caracterizado a veces por relativamente bajos rendimientos generales y de nuevo, requiere la separación de la mayor parte de los intermedio formados por medio de cromatografía en columna.

Se ha encontrado que las aplicaciones in vivo que emplean fosfolípidos oxidados esterificados preparados como anteriormente tienen la desventaja de la susceptibilidad al reconocimiento, unión y metabolismo del componente activo en el cuerpo, haciendo la dosificación y la estabilidad después de la administración un factor importante. Los fosfolípidos oxidados eterificados, tales como aquellos descritos en la patente de EE.UU. No. 6.838.452 y en el documento WO 04/106486, exhiben más alta bioestabilidad y alta actividad terapéutica.

De este modo, los métodos conocidos actualmente para preparar fosfolípidos oxidados eterificados, así como esterificados implican procedimientos complejos multietapa apropiados para la preparación en el laboratorio, que sin embargo vuelven la preparación a escala industrial ineficiente y compleja. En particular, estos procedimientos multietapa requieren... [Seguir leyendo]

1. Un método para preparar un compuesto de la fórmula general II a continuación que tiene una estructura glicerólica y por lo menos un residuo que contiene un resto oxidado unido a la posición sn-2 de la estructura glicerólica vía un enlace éter, y que tiene adicionalmente un resto que contiene fósforo unido a la posición sn-3 de la estructura glicerólica,

Fórmula II

en la que: A1 se selecciona del grupo que consiste en CH2, CH=CH y C=O;

A2 es CH2; R1 es un alquilo que tiene 1-30 átomos de carbono; R2 es mientras que: 15 X es una cadena alquílica que tiene 1-24 átomos de carbono;

Y se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxi, alquilo, alcoxi, haluro, acetoxi y un grupo funcional aromático; y Z se selecciona del grupo que consiste en:

siendo R4 un alquilo o arilo; y

R3 se selecciona del grupo que consiste en ácido fosfórico, fosforilcolina, fosforiletanolamina, fosforilserina, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilcardiolipina, fosfatidilinositol, fosforilcardiolipina, fosforilinositol, etilfosfocolina, fosforilmetanol, fosforiletanol, fosforilpropanol, fosforilbutanol, fosforiletanolamina-N

lactosa, fosfoetanolamina-N-[metoxi (propilenglicol) ], fosfoinositol-4-fosfato, fosfoinositol-4, 5-bifosfonato, pirofosfato, fosfoetanolamina-dietilentriaminapentaacetato, dinitrofenil-fosfoetanolamina y fosfoglicerol.

comprendiendo el método:

proporcionar un primer compuesto que tiene una estructura glicerólica y un grupo hidroxilo libre en la posición sn-2, teniendo dicho primer compuesto la fórmula general I:

en la que: A1 se selecciona del grupo que consiste en CH2, CH=CH y C=O; R1 se selecciona del grupo que consiste en H y una cadena hidrocarbonada que tiene de 1 a 30 átomos de carbono,

y R3 es hidrógeno; proporcionar un segundo compuesto que tiene por lo menos un enlace insaturado y por lo menos un grupo reactivo

capaz de formar un enlace éter con dicho grupo hidroxilo libre; hacer reaccionar dicho primer compuesto y dicho segundo compuesto para obtener por ello un tercer compuesto,

teniendo dicho tercer compuesto dicha estructura glicerólica y un residuo que comprende un enlace insaturado, estando unido dicho residuo a dicha estructura glicerólica vía un enlace éter en la posición sn-2; aislar dicho tercer compuesto para obtener por ello un tercer compuesto purificado, en el que el aislamiento de dicho tercer compuesto comprende: recoger dicho tercer compuesto; proporcionar una disolución de dicho tercer compuesto en un disolvente, siendo seleccionado dicho disolvente de

éter de petróleo, hexano, heptano, benceno y tolueno, para proporcionar por ello una mezcla que incluye dicha disolución de dicho tercer compuesto en dicho disolvente e impurezas insolubles; retirar dichas impurezas insolubles; y

retirar dicho disolvente, obteniendo por ello dicho tercer compuesto purificado; hacer reaccionar dicho tercer compuesto purificado con un agente oxidante para oxidar dicho enlace insaturado, para obtener por ello un cuarto compuesto que tiene dicha estructura glicerólica y un residuo que contiene un resto oxidado unido a dicha estructura glicerólica vía un enlace éter en la posición sn-2,

aislar y purificar dicho cuarto compuesto para obtener por ello un cuarto compuesto purificado, en el que el método comprende adicionalmente, después de purificar dicho cuarto compuesto; hacer reaccionar dicho cuarto compuesto purificado con un resto que contiene fósforo, para obtener por ello dicho

compuesto que tiene una estructura glicerólica y por lo menos un residuo que contiene un resto oxidado unido a la estructura glicerólica y que tiene adicionalmente un resto que contiene fósforo unido a la estructura glicerólica, estando el método desprovisto de cromatografía en columna.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho agente oxidante se selecciona del grupo que consiste en ácido fórmico, peróxido de hidrógeno, un per y odato, un perclorato, un bismutato, un permanganato, un clorito, ozono, óxido de plata, tetróxido de osmio y cualquiera de sus combinaciones.

3. El método de la reivindicación 1, en el que dicho resto oxidado es un grupo ácido carboxílico.

4. El método de la reivindicación 1, en el que dicho resto oxidado es un grupo ácido carboxílico y la reacción de dicho tercer compuesto purificado con dicho agente oxidante comprende:

convertir dicho tercer compuesto purificado en un compuesto que tiene una estructura glicerólica y un residuo que contiene aldehído unido a dicha estructura glicerólica vía un enlace éter; y

oxidar dicho compuesto que tiene una estructura glicerólica y un residuo que contiene aldehído unido a dicha estructura glicerólica, para obtener por ello un compuesto que tiene una estructura glicerólica y un residuo que contiene ácido carboxílico unido a dicha estructura glicerólica vía un enlace éter.

5. El método de la reivindicación 1, en el que dicho resto oxidado es un grupo ácido carboxílico y la reacción de dicho tercer compuesto purificado con dicho agente oxidante comprende:

convertir dicho tercer compuesto purificado en un compuesto que tiene una estructura glicerólica y un residuo que contiene epóxido unido a dicha estructura glicerólica vía un enlace éter; y

oxidar dicho compuesto que tiene una estructura glicerólica y un residuo que contiene epóxido unido a dicha estructura glicerólica, para obtener por ello un compuesto que tiene una estructura glicerólica y un residuo que contiene ácido carboxílico unido a dicha estructura glicerólica vía un enlace éter.

6. El método de la reivindicación 1, en el que el primer compuesto de Fórmula I tiene un grupo hidroxilo libre adicional en la posición sn-1 o sn-3, el método comprende adicionalmente previamente a la reacción del primer compuesto y el segundo compuesto: proteger dicho grupo hidroxilo libre adicional con un grupo protector.

7. El método de la reivindicación 6, en el que dicho grupo protector es tritilo.

8. El método de la reivindicación 4, en el que R3 de la Fórmula I es hidrógeno, y el método comprende adicionalmente, previamente a la reacción de dicho primer compuesto y dicho segundo compuesto:

proteger un grupo hidroxilo libre en la posición sn-3 de dicha estructura glicerólica con un grupo protector.

9. El método de la reivindicación 8, en el que dicho grupo protector es tritilo.

10. El método de la reivindicación 9, que comprende adicionalmente, previamente a la reacción de dicho tercer compuesto y dicho agente oxidante:

reemplazar dicho tritilo por un grupo protector seleccionado del grupo que consiste en acetato, pivaloato y benzoato.

11. El método de la reivindicación 1, en el que dicho resto que contiene fósforo es un resto fosfato que está unido a dicha estructura glicerólica vía un enlace fosfodiéster.

12. El método de la reivindicación 1, en el que la reacción de dicho cuarto compuesto purificado y dicho resto que contiene fósforo comprende:

proporcionar dicho cuarto compuesto purificado que tiene un grupo hidroxilo libre en la posición sn-3 de dicha estructura glicerólica;

hacer reaccionar dicho cuarto compuesto purificado con un compuesto reactivo que contiene fósforo que tiene un segundo grupo reactivo y un tercer grupo reactivo, siendo dicho segundo grupo reactivo capaz de reaccionar con dicho grupo hidroxilo libre, para proporcionar por ello un compuesto que tiene un grupo reactivo que contiene fósforo unido a la estructura glicerólica; y

convertir dicho grupo reactivo que contiene fósforo en dicho resto que contiene fósforo.

13. El método de la reivindicación 12, en el que dicho compuesto reactivo que contiene fósforo es oxicloruro de fósforo (POCl3) .

14. El método de la reivindicación 1, en el que cuando dicho resto oxidado es un grupo éster, el método comprende adicionalmente proporcionar un compuesto que contiene ácido carboxílico, y convertir a continuación un grupo ácido carboxílico en un grupo éster.

15. El método de la reivindicación 10, que comprende adicionalmente retirar dicho grupo protector.

16. El método de la reivindicación 1, en el que la oxidación de dicho enlace insaturado comprende convertir el enlace insaturado en un grupo epóxido, y convertir el grupo epóxido en un grupo ácido carboxílico.

17. El método de la reivindicación 16, en el que la conversión de dicho epóxido en dicho ácido carboxílico se efectúa convirtiendo el epóxido en diol, y oxidando el diol para obtener dicho grupo ácido carboxílico.