Procedimiento de purificación del virus de la rabia.

Un procedimiento de purificación del virus de la rabia que comprende una sola etapa de cromatografía por intercambio de iones

, siendo dicha etapa una cromatografía por intercambio de cationes según la cual:

a) se pone en contacto el sobrenadante de un cultivo de células infectadas por este virus con un soporte de cromatografía intercambiadora de cationes que comprende una matriz de polimetacrilato en la que se han injertado por enlace covalente unos grupos sulfoisobutilo de tal manera que el virus de la rabia se fija sobre este soporte, y

b) se eluye el virus de su soporte.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/FR2010/050679.

Solicitante: SANOFI PASTEUR.

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: 2, AVENUE PONT PASTEUR 69367 LYON CEDEX 07 FRANCIA.

Inventor/es: FABRE,VIRGINIE, ROCCA,CÉLINE, RIFFARD,PIERRE, CALVOSA,ERIC.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Virus, p. ej. bacteriófagos; Composiciones que los... > C12N7/02 (Aislamiento o purificación)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen antígenos... > A61K39/205 (Rhabdoviridae, p. ej. virus de la rabia)

PDF original: ES-2498726_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Procedimiento de purificación del virus de la rabia La invención tiene por objeto un método de purificación del virus de la rabia obtenido a partir de un cultivo de células.

De manera general, las cosechas de virus obtenidas a partir de cultivos celulares infectados contienen no sólo los virus deseados, sino también las proteínas y el ADN de las células, que son unas impurezas de las cuales conviene deshacerse. Las cantidades en proteínas y en ADN celulares liberadas son tanto más importantes si los virus son responsables de una lisis celular importante y/o si las cosechas virales se efectúan tarde. Además de las impurezas de tipo celular, las proteínas del medio en el que se encuentran las células infectadas son también unas impurezas de las que se desea también deshacerse durante la aplicación del procedimiento de purificación viral.

Cuando los virus sirven para la fabricación de vacunas, se busca obtener unas preparaciones que sean lo más puras posible para evitar el desarrollo de reacciones alérgicas contra las impurezas proteicas. En algunos países, existe una legislación que limita a 100 pg/dosis vaccínea, incluso menos, la cantidad máxima autorizada de ADN celular en las vacunas que comprenden unos productos obtenidos a partir de las líneas celulares continuas.

En la técnica anterior, ya se han descrito diferentes procedimientos de purificación del virus de la rabia:

El documento US 4, 664, 912 describe un método de purificación del virus de la rabia por centrifugación zonal después de que se haya inactivado con la ï?¢ propiolactona. Otro método consiste en combinar una cromatografía por exclusión de tamaño y una cromatografía por intercambio de aniones cuando el volumen de la cosecha del virus a purificar es importante.

El documento US 4, 725, 547 describe un método de purificación del virus de la rabia por cromatografía de afinidad sobre sulfato de celulofina (éster de ácido sulfúrico y de celulosa) .

El documento WO 97/06243 describe un método de purificación de los virus, en particular del virus de la rabia a partir de un cultivo de células Vero infectadas. El procedimiento comprende una cromatografía por intercambio de aniones seguida de una cromatografía por intercambio de cationes y se completa por una cromatografía de afinidad por quelación metálica. Utilizando este procedimiento, la cantidad de ADN residual contenido en una dosis de vacuna es ï£ a 30-40 pg, utilizando la técnica denominada del "Treschold Total DNA assay".

Kumar A.P. et al. en Microbes and Infection (2005) 7; 1110-1116 ha comparado dos procedimientos de purificación del virus de la rabia a partir de un sobrenadante de cultivo de células Vero infectadas que se cultivaron en un medio que contiene un suero de ternera fetal. Muestra que el procedimiento de purificación basado en la utilización de una columna de cromatografía intercambiadora de aniones (DEAE-sefarosa CL -6B) es más eficaz que el procedimiento de purificación por centrifugación zonal en un gradiente de sacarosa, ya que a un grado de pureza comparable en términos de cantidad de ácidos nucleicos y de proteínas residuales, el rendimiento del virus de la rabia es mejor con el procedimiento cromatográfico.

Frazatti-Gallina N.M. en Vaccine (2004) 23; 511-517 ha descrito también un procedimiento de purificación del virus de la rabia a partir de un sobrenadante de cultivo de células Vero infectadas que han sido cultivadas en un medio desprovisto de suero de ternera fetal. El procedimiento de purificación utiliza también una etapa de cromatografía por intercambio de aniones sobre un soporte a base de DEAE-celulosa después de una etapa de clarificación y de concentración de la cosecha viral. Utilizando este procedimiento, la cantidad de ADN residual medida por la técnica de hibridación sobre transferencia es < 23 pg por dosis de vacuna.

Así, cuando el procedimiento de purificación del virus de la rabia comprende una etapa de cromatografía por intercambio de iones, se encuentra casi sistemáticamente una etapa de cromatografía por intercambio de aniones a fin de retener los ácidos nucleicos del medio que contiene el virus a purificar sobre el soporte cromatográfico.

Por otro lado, JungBauer et al. han descrito en Journal of chromatography (2008) , vol 184, p. 62-79 las potencialidades de un nuevo soporte cromatográfico monolítico para purificar con un grado muy bueno de pureza el virus del mosaico del tabaco (VMT) .

Un procedimiento de purificación de virus particularmente eficaz debería permitir eliminar de manera óptima las impurezas proteicas y el ADN celular, garantizando al mismo tiempo un rendimiento máximo del virus de la rabia purificado, y existe todavía la necesidad de encontrar nuevos procedimientos que responden a estos criterios.

Un objetivo de la invención es proporcionar un nuevo procedimiento de purificación que responde a estos criterios.

Otro objetivo de la invención es proporcionar un procedimiento para purificar un virus de la rabia a partir de una cosecha de virus desprovista de suero animal o de cualquier proteína sérica, y más particularmente proporcionar un procedimiento de purificación en el que se utilizan únicamente unos productos de origen no animal.

Para ello, la presente invención tiene por objeto:

Un procedimiento de purificación del virus de la rabia que comprende una sola etapa de cromatografía por intercambio de iones, siendo dicha etapa una cromatografía por intercambio de cationes según la cual:

a. se pone en contacto el sobrenadante de un cultivo de células infectadas por este virus con un soporte de cromatografía intercambiadora de cationes que comprende una matriz de polimetacrilato sobre la que se han injertado por enlace covalente unos grupos sulfoisobutilo de manera que el virus de la rabia se fije sobre este soporte, y en segundo lugar

b. se eluye el virus de su soporte.

Según un aspecto del procedimiento según la invención, el sobrenadante de cultivo de células infectadas por el virus de la rabia está desprovisto de suero animal o de cualquier proteína sérica. Según otro aspecto, el sobrenadante de cultivo de células infectadas por el virus de la rabia está desprovisto de cualquier proteína exógena de origen animal.

Según también otro aspecto, la concentración en proteínas exógenas de origen no animal en el sobrenadante de cultivo de células infectadas por el virus de la rabia es ï£ 15 mg/l. Según también otro aspecto, el sobrenadante de cultivo de células infectadas por el virus de la rabia está

desprovisto de cualquier producto exógeno de origen animal. Según un modo de realización del procedimiento según la invención, el sobrenadante de cultivo de células infectadas por el virus de la rabia está previamente clarificado antes de ser puesto en contacto con el soporte de cromatografía intercambiador de cationes. El procedimiento de purificación según la invención se caracteriza por que la cantidad de virus medida en el eluido corresponde a al menos el 70% de la cantidad de virus medida en el sobrenadante puesto en contacto con el soporte cromatográfico. Más particularmente, está caracterizado por que la cantidad de proteínas totales medida en el eluido corresponde a menos del 40% de la cantidad de proteínas totales medida en el sobrenadante puesto en contacto con el soporte cromatográfico y por que la cantidad de ADN medida en el eluido corresponde a menos del 5%, preferentemente a menos del 2, 5% y de manera aún más preferida a menos del 1% de la cantidad de ADN medida en el sobrenadante que se ha puesto en contacto con el soporte cromatográfico.

Según otro modo de realización del procedimiento según la invención, después de haber eluido... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento de purificación del virus de la rabia que comprende una sola etapa de cromatografía por intercambio de iones, siendo dicha etapa una cromatografía por intercambio de cationes según la cual:

a) se pone en contacto el sobrenadante de un cultivo de células infectadas por este virus con un soporte de cromatografía intercambiadora de cationes que comprende una matriz de polimetacrilato en la que se han injertado por enlace covalente unos grupos sulfoisobutilo de tal manera que el virus de la rabia se fija sobre este soporte, y b) se eluye el virus de su soporte.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, según el cual el sobrenadante de cultivo de las células infectadas por el virus de la rabia está desprovisto de suero animal o de cualquier proteína sérica.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, según el cual el sobrenadante de cultivo de las células infectadas por el virus de la rabia está desprovisto de cualquier proteína exógena de origen animal.

4. Un procedimiento según la reivindicación 3, según el cual la concentración en proteínas exógenas de origen no animal en el sobrenadante de cultivo de células infectadas por el virus de la rabia es â 15mg/l.

5. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, según el cual el sobrenadante de cultivo de las células infectadas por el virus de la rabia está desprovisto de cualquier producto exógeno de origen animal.

6. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, según el cual el sobrenadante de cultivo de células infectadas por el virus de la rabia está previamente clarificado antes de ser puesto en contacto con el soporte de cromatografía intercambiador de cationes.

7. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que la cantidad de virus medida en el eluido corresponde a al menos el 70% de la cantidad de virus medida en el sobrenadante puesto en contacto con el soporte cromatográfico.

8. Un procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado por que la cantidad de proteínas totales medida en el eluido corresponde a menos del 40% de la cantidad de proteínas totales medida en el sobrenadante puesto en contacto con el soporte cromatográfico y por que la cantidad de ADN medida en el eluido corresponde a menos del 5%, preferentemente a menos del 2, 5% y de manera aún más preferida a menos del 1% de la cantidad de ADN medida en el sobrenadante puesto en contacto con el soporte cromatográfico.

9. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, según el cual se concentra eventualmente el eluido y después se trata con una nucleasa.

10. Un procedimiento según la reivindicación 9, según el cual la nucleasa es una endonucleasa tal como la benzonasa.

11. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, según el cual se somete después el eluido a una ultra-centrifugación sobre un gradiente de sacarosa y se recoen la o las fracciones del gradiente que contienen el virus purificado.

12. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, según el cual se inactiva después el virus de la rabia purificado por medio de un agente de inactivación viral.

13. Un procedimiento según la reivindicación 12, según el cual el agente de inactivación viral es la ï?¢-propiolactona.

14. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 13, según el cual todas las etapas del procedimiento se realizan por medio de productos de origen no animal.

15. Un procedimiento de fabricación de una vacuna contra la rabia según el cual: a) se infecta un cultivo de células con el virus de la rabia, b) se purifica el virus de la rabia a partir del sobrenadante de cultivo de células infectadas según un procedimiento tal

como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 14, c) se mezcla la suspensión de virus purificado obtenido en b) en un tampón de conservación, y d) se reparte la suspensión de virus purificado obtenido en c) en forma de vacunas unidosis o multidosis.

16. Un procedimiento de fabricación de una vacuna contra la rabia según el cual: a) se infecta un cultivo de células con el virus de la rabia,

b) se purifica el virus de la rabia a partir del sobrenadante de cultivo de células infectadas según un procedimiento tal como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 14, c) se mezcla la suspensión de virus purificado obtenido en b) en un tampón de liofilización, d) se reparte la suspensión de virus purificado obtenido en c) en forma de vacunas unidosis o multidosis, y e) se liofilizan las dosis de vacunas.