PROCEDIMIENTO Y KIT PARA EL DIAGNOSTICO DE TRANSTORNOS DE LA COAGULACION.

Procedimiento y kit para el diagnóstico de trastornos de la coagulación.

Constituye el objeto de la invención un procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación mediante la determinación de las deficiencias de los gránulos densos de las plaquetas.

El procedimiento permite la detección del contenido de polifosfato inorgánico en muestras biológicas, particularmente en plaquetas y establecer una correlación entre la cantidad de polifosfato inorgánico determinada en las muestras biológicas, particularmente en las plaquetas, y la tendencia a presentar una deficiencia en los gránulos densos de las plaquetas.

Constituye otro objeto de la presente invención un kit para el diagnóstico de trastornos de la coagulación mediante el referido procedimiento

Procedimiento y kit para el diagnóstico de trastornos de la coagulación.

Objeto de la invención

Constituye un objeto de la presente invención un procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación, mediante la determinación de las deficiencias en los gránulos densos de las plaquetas. El método: (a) permite la detección del contenido de polifosfato inorgánico en muestras biológicas, particularmente en plaquetas y (b) permite establecer una correlación entre la cantidad de polifosfato inorgánico determinada en las muestras biológicas, particularmente en las plaquetas, y la tendencia a presentar una deficiencia en los gránulos densos de las plaquetas.

Estado de la técnica

Las plaquetas son componentes de la sangre que desempeñan un papel fundamental en los procesos de hemostasis y trombosis. Las plaquetas humanas, así como las de otros mamíferos, poseen un tipo de organelos denominado "gránulos densos" o "gránulos delta". De manera similar a otros organelos secretorios de las plaquetas, como son los lisosomas y los gránulos alfa, los contenidos de gránulos densos son liberados por las plaquetas activadas donde juegan un papel esencial en la coagulación de la sangre. En este sentido, los gránulos densos acumulan moléculas que, al ser secretadas, contribuyen con la activación de plaquetas circulantes adicionales para la formación del coágulo.

En algunos individuos, los gránulos densos de las plaquetas están deficientes lo que resulta en un trastorno de coagulación denominado "enfermedad de los reservorios delta" o "delta-storage pool disease" (abreviado como dSPD). Clínicamente, la dSPD se manifiesta como una tendencia moderada a las hemorragias, aunque en algunos individuos pueden presentarse hemorragias severas. Las manifestaciones típicas incluyen epistaxis, menorragia, hemorragias post-parto y hemorragias posteriores a los procedimientos quirúrgicos (McNicol, A. y Israels, S.J. Thromb Res 1999, 95, 1-18).

La dSPD suele ser debida a un defecto congénito (dSPD congénita) y puede presentarse como una entidad separada, en la cual el defecto en las plaquetas es la única anomalía (White, J.G. Crit Rev Oncol Hematol 1986, 4, 337-77), o como una parte de algunos síndromes hereditarios complejos, como el síndrome de Hermansky-Pudlak y el síndrome de Chediak-Higashi donde se observan variadas patologías adicionales (Rendu, F. y Brohard-Bohn, B. Platelets 2001, 12, 261-73). Aunque la dSPD congénita se diagnostica con poca frecuencia, se ha propuesto que la incidencia real de la enfermedad se desconoce al no realizarse un diagnóstico en individuos con síntomas leves (Nieuwenhuis, H.K. y col. Blood 1987, 70, 620-3).

Existe una variante de dSPD, denominada "dSPD adquirida", que se presenta como consecuencia de algunas condiciones clínicas como enfermedades hepáticas y renales, leucemias mieloides, mielodisplasias o síndromes mieloproliferativos (McNicol, A. y Israels, S.J. Thromb Res 1999, 95, 1-18).

Los gránulos densos de las plaquetas son orgánulos acídicos que acumulan nucleótidos de adenina, serotonina y calcio. El análisis de los contenidos de los gránulos densos de las plaquetas, se incluye entre las pruebas que se realizan para el diagnóstico de la dSPD, y requiere el uso de técnicas como agregometría, citometría de flujo, cromatografía líquida de alta presión, microscopía electrónica y microscopía de fluorescencia (Lorez, H.P. y col. J Lab Clin Med 1977, 89, 200-6 / Lages, B. y Weiss, H.J. Br J Haematol 1988, 68, 53-62 / White, J.G. Semin Thromb Hemost 1998, 24, 163-8 / Ramstrom, AS. y col. Platelets 1999, 10, 153-8 / Maurer-Spurej, E. y col. Am J Clin Pathol 2007, 127, 626-32). La mayoría de estas técnicas requieren equipamientos costosos así como procedimientos largos y laboriosos. Por lo tanto, se hace necesario la generación de nuevos métodos para estudiar la dSPD que puedan ser usados para analizar un gran número de muestras en tiempos reducidos, que sean más económicas y que usen equipamiento común en laboratorios de biomedicina. La presente invención se dirige a estas necesidades entre otras.

Se ha encontrado recientemente que los gránulos densos de la plaquetas acumulan altos niveles de polifosfato inorgánico (polyP) (Ruiz, F.A. y col. J Biol Chem 2004, 279, 44250-7). El polyP es un polímero de variado tamaño formado por residuos de fosfato unidos entre sí por enlaces fosfoanhidro de alta energía (Kornberg, A. J Bacteriol 1995, 177, 491-6) (Figura 1). Además de los gránulos densos de las plaquetas, el polyP se acumula en organelos similares que se encuentran en otros tipos celulares. En este sentido, estos organelos que acumulan polyP se conocen como "acidocalcisomas" y han sido descritos en bacterias (Seufferheld, M. y col. J Biol Chem 2003, 278, 29971-8), así como en varios eucariotas unicelulares, como son los parásitos tripanosomatidios y apicomplexa, el alga verde Chlamydomonas reinhardtii y el "slime mold" Dictyostelium discoideum (Docampo, R. y col. Nat Rev Microbiol 2005, 3, 251-61).

En la industria el polyP ha sido ampliamente usado en variadas aplicaciones que incluyen el procesamiento de alimentos, el uso como aditivo alimentario y la reducción de la dureza del agua, entre otros (Kornberg, A. J Bacteriol 1995, 177, 491-6). En medicina, el polyP se ha utilizado para el tratamiento de enfermedades de las encías (Yamaoka, M. y col. Gerodontology 2008, in press), para estimular la regeneración de los huesos (Hacchou, Y. y col. J Dent Res 2007, 86, 893-7) y la cicatrización de las heridas (Kim, H.R. y col. Patent WO200172313-A), así como para promover la coagulación y disminuir el sangrado (Morrissey, J.H. y col. Patent US2006198837-A1).

El polyP se ha encontrado en todos los seres vivos donde se ha estudiado (Kornberg, A. J Bacteriol 1995, 177, 491-6) y hace poco se ha relacionado con la modulación de la coagulación de la sangre y con la disolución de los coágulos sanguíneos (fibrinólisis) (Smith, S.A. y col. Proc Natl Acad Sci USA 2006, 103, 903-8). La invención que aquí se presenta, se relaciona con la correlación entre los niveles de polyP en extractos de plaquetas humanas y la presencia o ausencia de dSPD, la cual no había sido demostrada hasta el momento.

Explicación de la invención

Constituye un primer objeto de la presente invención un procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación que incluye las siguientes etapas:

a) obtener una muestra biológica del individuo a diagnosticar

b) determinar en dicha muestra el contenido de un compuesto y compararlo con el contenido de dicho compuesto en muestras de control,

Específicamente, cuando el trastorno de la coagulación a diagnosticar es la enfermedad de los reservorios delta ("delta storage pool disease" en inglés), el compuesto que se determina en la muestra biológica es polifosfato inorgánico.

Para la presente invención se aportan ejemplos en los cuales la muestra biológica se toma de humanos, pero además de los humanos, otros mamíferos como por ejemplo, perros, gatos, cerdos, ganado vacuno, y ratones, son también susceptibles de desarrollar dSPD (Meyers, K.M. y col. Am J Physiol 1979, 237, R239-48 / Meyers, K.M. y col. Am J Hematol 1981, 11, 241-53 / Novak, E.K. y col. Blood 1984, 63, 536-44 / Daniels, T.M. y col. Blood 1986, 67, 1043-7 / Callan, M.B. y col. Thromb Haemost 1995, 74, 949-53). Por lo tanto, el procedimiento de la invención es también útil para estudiar la enfermedad en general en mamíferos o para validar modelos animales de dSPD.

La muestra biológica incluye sangre y específicamente plaquetas. Cuando la muestra incluye plaquetas, el procedimiento comprende las siguientes etapas:

a) obtención de una muestra biológica del individuo a diagnosticar

b) aislamiento de las plaquetas de los otros componentes de la muestra biológica y determinación del número de plaquetas aisladas

c) ataque ácido sobre las plaquetas aisladas en la etapa anterior, para solubilizar el polifosfato inorgánico

d) separación del polifosfato inorgánico del resto de componentes de las plaquetas

e) determinación cuantitativa del polifosfato solubilizado y separado en las etapas anteriores.

La etapa...

1. Procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación que incluye las siguientes etapas:

a) obtener una muestra biológica del individuo a diagnosticar

b) determinar en dicha muestra el contenido de un compuesto y compararlo con el contenido de dicho compuesto en muestras de control,

caracterizado porque cuando el trastorno de la coagulación a diagnosticar es la enfermedad de los reservorios delta, el compuesto que se determina en la muestra biológica es polifosfato inorgánico.

2. Procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según la reivindicación 1, caracterizado porque el individuo del que se obtiene la muestra biológica es un mamífero.

3. Procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según la reivindicación 2, caracterizado porque el mamífero del que se obtiene la muestra biológica es un humano.

4. Procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la muestra biológica incluye sangre.

5. Procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la muestra biológica incluye plaquetas.

6. Procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según la reivindicación 5, caracterizado porque cuando la muestra incluye plaquetas, el procedimiento comprende las siguientes etapas:

a) obtención de una muestra biológica del individuo a diagnosticar

b) aislamiento de las plaquetas de los otros componentes de la muestra biológica y determinación del número de plaquetas aisladas

c) ataque ácido sobre las plaquetas aisladas en la etapa anterior, para solubilizar el polifosfato inorgánico.

d) separación del polifosfato inorgánico del resto de componentes de las plaquetas

e) determinación cuantitativa del polifosfato solubilizado y separado en las etapas anteriores.

7. Procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según la reivindicación 6, caracterizado porque la etapa de aislamiento de las plaquetas se lleva a cabo mediante un proceso de centrifugación simple, o bien mediante filtración en gel o bien mediante centrifugación en gradiente de densidad.

8. Procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según las reivindicaciones 6 y 7, caracterizado porque la determinación del número de plaquetas se realiza mediante un analizador hematológico, o bien mediante un hemacitómetro de Neubauer y un microscopio.

9. Procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según las reivindicaciones 6-8, caracterizado porque el ataque ácido sobre las plaquetas se efectúa mediante resuspensión de las plaquetas, previamente lavadas con un tampón isotónico, en un ácido fuerte como ácido perclórico o ácido tricloroacético.

10. Procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según las reivindicaciones 6-9, caracterizado porque la separación del polifosfato solubilizado se lleva a cabo mediante centrifugación.

11. Procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según las reivindicaciones 6-10, caracterizado porque la determinación cuantitativa del polifosfato solubilizado y separado en las etapas anteriores se efectúa, tras neutralización con solución alcalina, directamente mediante colorimetría o fluorimetría, preferentemente colorimetría.

12. Procedimiento para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según las reivindicaciones 6-10, caracterizado porque la determinación cuantitativa del polifosfato y solubilizado y separado en las etapas anteriores incluye tras la neutralización con solución alcalina

a) un ataque enzimático para procesar el polifosfato, para liberar los productos resultantes de dicha reacción enzimática.

b) determinación cuantitativa de alguno de los productos resultantes de la reacción enzimática mediante colorimetría o por luminiscencia, preferentemente mediante colorimetría.

13. Kit para el diagnóstico de trastornos de la coagulación mediante un procedimiento según las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque incluye:

- medios para aislar las plaquetas de la sangre y producir extractos acídicos de las mismas.

- medios para la detección y cuantificación del polifosfato.

- muestras de control de polifosfato y/o plaquetas para comparar con los valores obtenidos.

14. Kit para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según la reivindicación 13, caracterizado porque incluye adicionalmente enzimas para el procesamiento específico de polifosfato en productos detectables mediante colorimetría o por luminiscencia.

15. Kit para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según las reivindicaciones 13 y 14, caracterizado porque los medios para producir extractos acídicos de las plaquetas son ácidos que se seleccionan entre ácido perclórico o ácido tricloroacético.

16. Kit para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según las reivindicaciones 13-15, caracterizado porque los medios para la detección y cuantificación del polifosfato son reactivos para ensayos colorimétricos, de fluorescencia o de luminiscencia, preferentemente reactivos colorimétricos que se seleccionan entre colorantes básicos como el azul de toulidina o fluoróforos como Fura-2 o DAPI.

17. Kit para el diagnóstico de trastornos de la coagulación según las reivindicaciones 14-16, caracterizado porque las enzimas se seleccionan entre las exopolifosafatasas, la polifosfato kinasas, o la polifosfato glucokinasas.