Polipéptidos con actividad polisacárido monooxigenasa y su uso para la producción de azúcares fermentables.

Polipéptidos con actividad polisacárido monooxigenasa y su uso para la producción de azúcares fermentables.

La invención se refiere a polipéptidos con actividad polisacárido monooxigenasa, a una célula hospedadora que los expresa, preferiblemente una célula de Myceliophthora thermophila, a una composición enzimática que comprende al menos uno de dichos polipéptidos, preferiblemente junto con otras enzimas celulolíticas, al uso de esta célula hospedadora, de al menos uno de los polipéptidos con actividad polisacárido monooxigenasa o de la composición enzimática para la degradación de biomasa celulósica y a un procedimiento para producir bioproductos, preferiblemente bioetanol, que comprende el uso de dicha célula hospedadora, de al menos uno de los polipéptidos de la invención o de la composición enzimática de la invención.

La invención se refiere al campo de los bioproductos, más particularmente, a las enzimas con actividad polisacárido monooxigenasa y a su uso, formando parte de cócteles enzimáticos, para la producción de azúcares fermentables a partir de biomasa celulósica durante los procesos de producción de bioproductos tales como bioetanol.

TÉCNICA ANTERIOR

La biomasa vegetal proporciona una fuente abundante de energía potencial en forma de carbohidratos que pueden utilizarse para numerosos procesos industriales y agrícolas y, por lo tanto, es una importante fuente renovable para la generación de azúcares fermentables. La fermentación de estos azúcares puede producir productos finales comercialmente valiosos, tales como el etanol también denominado bioetanol.

Aunque la fermentación de los azúcares a etanol es relativamente directa, la conversión eficiente de biomasa celulósica en azúcares fermentables, tales como la glucosa, supone un mayor desafío. La enorme energía potencial de las grandes cantidades de hidratos de carbono que integran la biomasa vegetal no está suficientemente utilizada porque los azúcares forman parte de polímeros complejos (polisacaridos, tales como celulosa y hemicelulosa) y, por tanto, no se encuentran facilmente accesibles para la fermentación. Así, la celulosa se puede tratar previamente, de forma mecanica, química, enzimática o de otros modos, para aumentar su susceptibilidad a la hidrólisis. Después de este proceso de pretratamiento, tiene lugar una etapa de sacarificación o hidrólisis consistente en un proceso enzimatico por el que los hidratos de carbono complejos (como almidón o celulosa) se hidrolizan en sus componentes monosacaridos. El objetivo de cualquier tecnología de sacarificación es, por tanto, alterar o eliminar los impedimentos estructurales y de composición con el fin de mejorar la tasa de hidrólisis enzimática y aumentar los rendimientos de azúcares fermentables obtenidos a partir de celulosa o hemicelulosa (N. Mosier y col. , 2005, Bioresource Technology 96, 673--686) . Después de esta etapa de sacarificación se realiza un proceso de fermentación. Por lo tanto,

cuanto mayor es la cantidad de azúcares complejos que permanecen al final del proceso hidrolítico, menor es el rendimiento de la producción de etanol al final del proceso de fermentación. Así, un área de investigación dirigida a disminuir los costes y mejorar el rendimiento de los procesos de producción de biocombustible está

centrada en la mejora de la eficacia técnica de las enzimas hidrolíticas, o en general en la mejora de la eficacia de los cócteles enzimáticos empleados para generar azúcares fermentables a partir de la biomasa.

Se ha demostrado que las enzimas individuales son únicamente capaces de digerir

parcialmente la celulosa y la hemicelulosa y, por lo tanto, se requiere la acción concertada de diferentes clases de enzimas para completar su conversión en azúcares monoméricos. Se requieren muchas más enzimas para digerir la hemicelulosa hasta azúcares monoméricos que la celulosa, incluyendo enzimas con actividad xilanasa, beta-xilosidasa, arabinofuranosidasa, mananasa, galactosidasa y

glucuronidasa. También pueden estar involucradas otras enzimas sin actividad glicosil hidrolasa, tales como acetil xilano esterasa y ácido ferúlico esterasa. Por ello, la hidrólisis enzimática de los polisacáridos para su conversión en azúcares solubles y, por último, en monómeros tales como xilosa, glucosa y otras pentosas y hexosas, se cata liza mediante varias enzimas que en conjunto se denominan "celulasas". Las celulasas son complejos multienzimáticos que comprenden, al menos, tres componentes principales, endo-~-glucanasa (EC 3.2.1.4) , exo-~-glucanasa o celobiohidrolasa (EC 3.2.1.9.1) Y ~-glucosidasa (EC 3.2.1.21) , y se ha demostrado que actúan de forma sinérgica en la hidrólisis de la celulosa (Woodward, J. 1991, Bioresource TechnologyVol36, pág. 67-75) .

Las celulasas microbianas se han convertido en biocatalizadores focales debido a su naturaleza compleja y a sus extensas aplicaciones industriales (Kuhad R. C. y col., 2011 , Enzyme Research, Article ID 280696) . Hoy en día se ha prestado una considerable atención a los conocimientos actuales sobre la producción de celulasas y

los retos en la investigación sobre celulasas, especialmente en la dirección de la mejora de la economía del proceso de varias industrias, con el fin de obtener celulasas con mayor actividad y mejores propiedades.

Por otro lado, las proteínas glicosil-hidrolasas de la familia 61 (GH61) se conocen desde hace más de 20 años. La primera GH61 descrita, denominada CEL 1, fue aislada de Agaricus bisporus en 1992 (Raguz y col., 1992, Gene 119: 183-190) . Estas proteínas GH61 son proteínas accesorias que contribuyen a la degradación de la celulosa. El hecho de que estas enzimas actúen por oxidación directa de la celulosa, en lugar de por su hidrólisis, ha llevado a su denominación actual: monooxigenasas de polisacáridos dependientes de Cu (Polysaccharide Monooxygenase; PMOs) . En 5 comparación con otras enzimas celulolíticas, las PMOs son proteínas relativamente pequeñas con masas moleculares típicamente de entre 20 y 50 kDa (Baldrian y Valaskova 2008, FEMS Mierobiology Reviews 32: 501-521; Harris y col., 2010, Biochemistr y 49: 3305-3316) . Estas proteínas requieren dos moléculas de oxígeno para producir la rotura del producto y su oxidación. Una de estas moléculas deriva del

agua, la otra entra en la reacción en forma de oxígeno molecular, el cual es necesario para la oxidación directa del sustrato. Por tanto, los miembros de esta familia de enzimas actúan como monooxigenasas de Cu que catalizan la rotura de la celulosa mediante un mecanismo oxidativo, liberando celodextrinas (Langston y col., 201 1, Applied and Environmental Mierobiology 77: 7007-7015) .

La eficiencia hidrolítica de un complejo multi-enzimático en el proceso de sacarificación del material celulósico depende tanto de las propiedades de las enzimas individuales como de la proporción de cada enzima presente en el complejo. Por tanto, en el contexto de los procesos de producción de biocombustibles, es necesario el diseño de cócteles enzimáticos con actividades individuales mejoradas, y con la proporción de cada una optimizada, cuyo empleo durante la etapa de sacarificación o hidrólisis de la biomasa celulósica conduzca a una mejora en el rendimiento de dicha etapa mediante un incremento en la cantidad de azúcares fermentables obtenidos a bajas dosis de enzima. Estos azúcares podrán ser

posteriormente fermentados para producir biocombustibles, tales como bioetanoJ, por lo que se incrementaría en último término la eficiencia y la rentabilidad de todo el proceso de producción de biocombustibles.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

La presente invención proporciona polipéptidos con actividad polisacárido monooxigenasa (PMO, también conocidos como glicosil-hidrolasas de la familia 61 o GH61) los cuales han sido identificados, aislados y caracterizados a partir de la cepa C1 de Myceliophthora thermophiJa. Como muestran los ejemplos de la presente invención, estos polipéptidos presentan la ventaja de que son capaces de incrementar el rendimiento de sacarificación de biomasa celulósica, mediante un incremento en la cantidad de azúcares fermentables producidos al final de dicho proceso hidrolítico, cuando son añadidos a los cócteles enzimáticos empleados en los procesos de producción de biocombustibles.

Dichos polipéptidos son enzimas monooxigenasas de polisacáridos que intervienen en las fases iniciales del proceso de descomposición de biomasa celulósica hasta azúcares fermentables, siendo estas enzimas las responsables de mejorar la accesibilidad del resto de la maquinaria enzimática al sustrato. De esta forma, aumentan el rendimiento del proceso de hidrólisis incrementando la cantidad de

azúcares simples obtenidos (fundamentalmente, glucosa) y con ello, en último término, el rendimiento de la producción de etanol a partir de biomasa.

Los inventores de la presente invención han identificado, en el genoma de Myceliophthora thermophila, 21 genes que codifican enzimas con actividad PMO (las 15 secuencias de aminoácidos de estas 21 enzimas maduras se muestran en las SEO ID NO: 43 a SEO ID NO: 63) . Como se puede ver en los ejemplos, estos polipétidos fueron aislados a partir del hongo, caracterizados y añadidos a una mezcla enzimática comprendiendo las principales enzimas celulolíticas producidas por la cepa C1 de Myceliophthora thermophila, con el fin de evaluar su efecto sobre el rendimiento de sacarificación de biomasa pretratada (peS o pretreated corn stover) , comprobándose...

1. Construcción génica que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido que consiste en la SEQ ID NO: 43, y otro polinucleótido que codifica el polipéptido 5 que consiste en la SEQ ID NO: 44.

2. Construcción génica según la reivindicación 1, donde dicha construcción génica es un vector de expresión.

3. Célula hospedadora que comprende la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.

4. Célula hospedadora según la reivindicación 3, donde la célula hospedadora es Myceliophthora thermophila C1 . 15

5. Composición enzimática que comprende un polipéptido que consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 43 y otro polipéptido que consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 44 y, preferiblemente, otra enzima celulolítica seleccionada de la lista que consiste en: endoglucanasa, beta-glucosidasa,

celobiohidrolasa, beta-xilosidasa, endoxilanasa, endoxiloglucanasa, polisacárido monooxigenasa o cualquier combinación de las mismas.

6. Composición enzimática según la reivindicación 5, donde dicha composición es una mezcla enzimática expresada por la célula según cualquiera de las 25 reivindicaciones 3 ó 4.

7. Uso de la célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, o de

la composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, para la degradación

de biomasa celulósica.

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8. Uso según la reivindicación 7, donde la degradación de biomasa celulósica tiene

lugar en un proceso de producción de un bioproducto.

9. Uso según la reivindicación 8, donde el bioproducto es un biocombustible.

10. Uso según la reivindicación 9, donde el biocombustible es bioetanol. 41

11. Procedimiento para producir azúcares fermentables que comprende los siguientes pasos: a) incubar biomasa celulósica con la composición según cualquiera de las 5 reivindicaciones 5 ó 6, y

b) recuperar los azúcares fermentables obtenidos después de la incubación del paso (a) .

12. Procedimiento para producir un bioproducto a partir de biomasa celulósica que 10 comprende los siguientes pasos: a) incubar biomasa celulósica con la composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, b) fermentar los azúcares fermentables obtenidos después de la incubación del paso (a) con al menos un microorganismo fermentador, y 15 c) recuperar el bioproducto obtenido después de la fermentación del paso (b) .

13.EI procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, donde el bioproducto es un biocombustible.

14.EI procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, donde el biocombustible es bioetanol.