Plantas que tienen rasgos potenciados relacionados con el rendimiento y un procedimiento de producción de las mismas.

Procedimiento para incrementar el rendimiento en semillas y/o la biomasa aérea en plantas en relación con plantas control adecuadas, que comprende incrementar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de transcripción que comprende del extremo N-terminal al extremo C-terminal:

(i) el Motivo 1 como se representa en la SEC ID N°: 276; y (ii) al menos 65 % de identidad de secuencia con el DBD de SPL representado por la SEC ID Nº 277; y el Motivo 2 como se representa en la SEC ID N°: 278, en el que el motivo 1 y el motivo 2 tienen permitidos uno o más cambios conservadores en cualquier posición y / o uno, dos o tres cambio(s) no conservadore(s) en cualquier posición y, opcionalmente, la selección de plantas que tienen mayor rendimiento de semillas y / o biomasa aérea.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E11194328.

Solicitante: BASF PLANT SCIENCE GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: 67056 LUDWIGSHAFEN ALEMANIA.

Inventor/es: FRANKARD,VALERIE, SANZ MOLINERO,ANA ISABEL, REUZEAU,CHRISTOPHE.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA > NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION;... > Plantas con flores, es decir, angiospermas > A01H5/10 (Granos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/82 (para células vegetales)
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Texto extraído del PDF original:

DESCRIPCIÓN

Plantas que tienen rasgos potenciados relacionados con el rendimiento y un procedimiento de producción de las mismas La presente invención se refiere, en general, al campo de la biología molecular y se refiere a un procedimiento para aumentar el rendimiento de las semillas y / o la biomasa aérea mediante el aumento de la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un factor de transcripción SPL15. La presente divulgación también se refiere a plantas que tienen la expresión aumentada de un ácido nucleico que codifica un factor de transcripción SPL15, plantas que tienen un mayor rendimiento de semillas y/o biomasa aérea en comparación con las correspondientes plantas de tipo silvestre u otras plantas control. La invención también proporciona construcciones útiles en los procedimientos de la invención.

La población mundial en crecimiento y el suministro menguante de tierra arable disponible para agricultura está estimulando la investigación hacia el incremento de la eficiencia de la agricultura. Los medios convencionales para mejoras de cultivos y horticultura usan técnicas de siembra selectivas para identificar plantas que tengan características deseables. No obstante, dichas técnicas selectivas tienen varios inconvenientes, es decir, estas técnicas normalmente son muy laboriosas y dan lugar a plantas que a menudo contienen componentes genéticos heterogéneos que no siempre pueden hacer que el rasgo deseable se pase de las plantas parentales Los avances en biología molecular han permitido que la humanidad modifique el plasma germinal de los animales y las plantas. La ingeniería genética de las plantas implica el aislamiento y manipulación del material genético (típicamente en forma de ADN o ARN) y la introducción posterior de ese material genético en una planta. Dicha tecnología tiene la capacidad de producir cultivos o plantas que tienen diversos rasgos económicos, agronómicos u hortícolas mejorados.

Un rasgo de interés económico particular es el aumento del rendimiento. El rendimiento se define normalmente como el producto medible de valor económico de un cultivo. Esto puede definirse en términos de cantidad y/o calidad. El rendimiento depende directamente de varios factores, por ejemplo, del número y tamaño de los órganos, de la arquitectura de la planta (por ejemplo, el número de ramas), de la producción de semillas, de la senescencia de la hoja y más. El desarrollo de las raíces, la absorción de nutrientes, la tolerancia al estrés y el vigor inicial también pueden ser factores importantes para determinar el rendimiento. Por lo tanto, optimizar los factores mencionados anteriormente puede contribuir a incrementar el rendimiento de una cosecha.

El rendimiento de semillas es un rasgo particularmente importante, ya que las semillas de muchas plantas son importantes para la nutrición de seres humanos y animales. Cosechas tales como maíz, arroz, trigo, canola y soja representan más de la mitad del aporte calórico total de los seres humanos, ya sea a través del consumo directo de las propias semillas o a través del consumo de productos alimenticios generados con semillas procesadas. También son una fuente de azúcares, aceites y muchos tipos de metabolitos usados en procedimientos industriales. Las semillas contienen un embrión (la fuente de nuevos vástagos y raíces) y un endospermo (la fuente de nutrientes para el crecimiento del embrión durante la germinación y durante el crecimiento inicial de las plántulas). El desarrollo de una nueva semilla implica muchos genes y requiere la transferencia de metabolitos desde las raíces, las hojas y los tallos hasta la semilla en crecimiento. El endospermo, en particular, asimila los precursores metabólicos de carbohidratos, aceites y proteínas y los sintetiza como macromoléculas de almacenamiento para engordar el grano.

Otro rasgo importante para muchos cultivos es el vigor inicial. La mejora del vigor inicial es un importante objetivo de los modernos programas de cultivo del arroz en variedades cultivadas de arroz tanto en climas templados como tropicales. Las raíces largas son importantes para el anclaje apropiado al suelo en arroz sembrado en agua. Cuando el arroz se siembra directamente en campos anegados y cuando las plantas deben emerger rápidamente a través del agua, los vástagos más largos se asocian al vigor. Cuando se practica la siembra en línea, los mesocotilos y los coleóptilos más largos son importantes para una buena emergencia de las plántulas. La capacidad para manipular genéticamente el vigor inicial en plantas sería de gran importancia en la agricultura. Por ejemplo, un vigor inicial escaso ha sido una limitación para la introducción de híbridos de maíz (Zea mays L.) basados en el germoplasma de Corn Belt en la Europa atlántica.

Otro rasgo importante es el de la tolerancia mejorada al estrés abiótico. El estrés abiótico es una causa principal de pérdida de cosechas en todo el mundo, reduciendo los rendimientos medios para la mayoría de las plantas de cultivo principales en más de 50% (Wang y col., Planta (2003) 218: 1–14). Los estreses abióticos pueden estar provocados por sequía, salinidad, extremos de temperatura, toxicidad química y estrés oxidativo. La capacidad para mejorar la tolerancia de las plantas al estrés abiótico sería de un gran beneficio económico para los agricultores de todo el mundo y permitiría el cultivo de cosechas en condiciones adversas y en territorios en los que el cultivo de las cosechas no es posible de otro modo.

Por lo tanto, el rendimiento de las cosechas puede incrementarse optimizando uno de los factores mencionados anteriormente.

Dependiendo del uso final, la modificación de ciertos rasgos de rendimiento puede favorecerse sobre otros. Por ejemplo, para aplicaciones tales como la producción de forraje o madera, o fuente de biocombustibles, puede ser deseable un incremento en las partes vegetativas de una planta, y para aplicaciones tales como producción de harina, almidón o aceite, puede ser particularmente deseable un incremento en los parámetros de las semillas. Incluso entre los parámetros de las semillas, algunos pueden ser favorecidos sobre otros, dependiendo de la aplicación. Diversos mecanismos pueden contribuir a incrementar el rendimiento de las semillas, ya sea en forma de tamaño incrementado de las semillas o en el número incrementado de semillas.

Un enfoque para incrementar el rendimiento (rendimiento de semillas y/o biomasa) en plantas puede ser a través de la modificación de los mecanismos de crecimiento inherentes de una planta, tales como el ciclo celular o diversas rutas de señalización implicadas en el crecimiento de las plantas o en mecanismos de defensa.

Ahora se ha comprobado que pueden aumentarse el rendimiento de semillas y/o la biomasa aérea en plantas aumentando la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un factor de transcripción SLP15.

Antecedentes

Los factores de transcripción normalmente se definen como proteínas que se unen a elementos reguladores en cis (por ejemplo, un potenciador, una caja TATA) y que, en asociación con la ARN polimerasa, son capaces de activar y/o reprimir la transcripción. El genoma de Arabidopsis codifica al menos 1.533 reguladores de la transcripción, que representan el ~5,9 % de su número total estimado de genes (Riechmann y col., 2000 (Science Vol. 290, 2105– 2109)).

Los polipéptidos del factor de la transcripción de la proteína de unión al promotor Squamosa de tipo 11 (SPL) son proteínas estructuralmente diversas que comparten un dominio de unión al ADN (DBD) muy conservado de aproximadamente 80 restos de aminoácidos de longitud (Klein y col., (1996) Mol Gen Genet 259: 7–16; Cardon y col., (1999) Gene 237: 91–104). El sitio de unión a la secuencia consenso del ADN del factor de la transcripción de SPL en el promotor de genes diana es 55'–TNCGTACAA–3', en la que N representa cualquier base. Dentro del DBD de SPL hay diez restos de cisteína (Cys) o histidina (His) conservados (véase la Figura 23) de los cuales ocho son restos de coordinación del cinc que se unen a dos iones de cinc necesarios para la formación de la estructura terciaria del dedo de cinc específico de SPL (Yamasaki y col., (2004) J Mol Biol 337: 49–63). Una segunda característica conservada dentro del DBD de SPL es una señal de localización nuclear bipartita. Fuera del DBD, en la mayoría de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de factores de transcripción de SPL (bien en la región codificante o en la 3' UTR) en todo el reino vegetal (Rhoades y col. (2002) Cell 110: 513-520), se encuentra un motivo diana de micro ARN (miARN), dirigido específicamente por la familia miR156 de los miARN. Los miARN controlan la expresión de los genes de SPL postranscripcionalmente dirigiendo los ARNm que codifican la SPL para degradación o por represión traduccional.

Riechmann y col., (Science 290: 2105–2109, 2000) informan sobre 16 polipéptidos de factores de transcripción de SPL en Arabidopsis thaliana, con escasa similitud de secuencia entre ellos (excepto las características mencionadas anteriormente), variando el tamaño del polipéptido SPL deducido de 131 a 927 aminoácidos. No obstante, se detectaron pares de polipéptidos de factores de transcripción de SPL que comparten mayor homología de secuencia dentro de la familia de SPL de esta planta (Cardon y col., (1999)).

Se ha mostrado que los polipéptidos de factores de transcripción de SPL (solamente encontrados en plantas) caracterizados hasta ahora funcionan en el desarrollo de las plantas, en particular en el desarrollo de las flores. Se ha indicado que las plantas transgénicas que sobreexpresan un polipéptido del factor de transcripción de SPL3 florecían antes (Cardon y col., (1997) Plant J 12: 367–377).

En la solicitud de patente Europea EP1033405, se presentan las secuencias polipeptídicas deducidas y de ácidos nucleicos del polipéptido del factor de transcripción de SPL15.

En la solicitud de patente internacional WO03013227 se presenta una secuencia de ácido nucleico (y la secuencia polipeptídica deducida; referencia interna G2346) que codifica parte del polipéptido del factor de transcripción SPL15 aunque 38 aminoácidos desde el extremo C-terminal del factor de transcripción SL15. Las plantas transgénicas de

Arabidopsis fhaliana que sobreexpresan de forma constitutiva el polipéptido del factor de transcripción SPL15 (o G2346) tienen cotiledones de un tamaño ligeramente mayor. En estadios posteriores del desarrollo, se ha indicado que las mismas plantas no muestran diferencias consistentes con respecto a las plantas control.

Sumario de la invención

Sorprendentemente, ahora se ha comprobado que el aumento de la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de transcripción SPL15 como se define en el presente documento produce plantas que tienen un mayor rendimiento en cuanto a las semillas y/o la biomasa aérea con respecto a las plantas control.

De acuerdo con una realización adicional, la invención proporciona un procedimiento para aumentar el rendimiento de las semillas y/o la biomasa aérea en plantas con respecto a plantas de control, que comprende aumentar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de factor de transcripción SPL15 como se define en el presente documento.

Definiciones

Polipéptido(s)/Proteína(s)

Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento, y se refieren a aminoácidos en forma polimérica de cualquier longitud.

Polinucleótido(s) /ácido(s) nucleico(s) /secuencia(s) de ácido nucleico/secuencia(s) de nucleótidos Las expresiones “polinucleótido(s)”, “secuencia(s) de ácidos nucleicos”, “secuencia(s) de nucleótidos”, “ácido(s) nucleico(s)”, se usan en el presente documento de forma intercambiable y hacen referencia a nucleótidos, ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos, o a una combinación de ambos, en una forma polimérica de cualquier longitud.

Planta(s) control La elección de plantas control adecuadas es una parte rutinaria de una situación experimental y puede incluir las correspondientes plantas de tipo silvestre o las correspondientes plantas sin el gen de interés. La planta de control es típicamente de la misma especie de planta o incluso de la misma variedad que la planta que se va a evaluar. La planta de control también puede ser un nulicigoto de la planta que se va a evaluar. Una “planta de control” como se usa en el presente documento no solo se refiere a plantas completas, sino también a partes de las plantas, que incluyen semillas y partes de semilla Homólogo(s) Los “homólogos” de una proteína incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos con relación a la proteína no modificada en cuestión y que tienen actividad biológica y funcional similar a la de la proteína no modificada de la cual derivan.

Una deleción se refiere a la eliminación de uno o más aminoácidos de una proteína.

Una inserción se refiere a uno o más restos de aminoácido que se introducen en un sitio predeterminado en una proteína. Las inserciones pueden comprender fusiones en N-terminal y / o en C-terminal, así como inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos individuales o múltiples. Generalmente, las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos serán más pequeñas que las fusiones en N- o C-terminal, del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos. Ejemplos de proteínas o péptidos de fusión en N- o C-terminal incluyen el dominio de activación o dominio de unión de un activador de la transcripción como se utiliza en el sistema en levadura de dos híbridos, las proteínas de recubrimiento de fago, cola de 6 (histidinas), marcador de glutatión S-transferasa, proteína A, proteína de unión a maltosa, dihidrofolato reductasa, epítopo Tag•100, epítopo de c-myc, epítopo FLAG®, lacZ, CMP (péptido de unión a calmodulina), epítopo HA, epítopo de proteína C y epítopo VSV.

Una sustitución se refiere a un reemplazo de aminoácidos de la proteína por otros aminoácidos que tienen propiedades similares (tales como hidrofobicidad, hidrofilicidad, antigenicidad, propensión a formar o romper estructuras en α hélice o estructuras en lámina β similares). Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos individuales, pero pueden agruparse dependiendo de restricciones funcionales sobre el polipéptido; las inserciones normalmente serán del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos de aminoácidos. Preferentemente, las sustituciones de aminoácidos comprenden sustituciones de aminoácidos conservadoras. En la técnica se conocen bien las tablas de sustituciones conservadoras (véase, por ejemplo, Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman y Company y la Tabla 1 dada a continuación).

Tabla 1: Ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservados

Resto

Sustituciones

Resto

Sustituciones

conservadoras

conservadoras

Ala Ser Leu Ile; Val Arg Lys Lys Arg; Gln Asn Gln; His Met Leu; Ile Asp Glu Phe Met; Leu; Tyr Gln Asn Ser Thr; Gly Cys Ser Thr Ser; Val Glu Asp Trp Tyr Gly Pro Tyr Trp; Phe His Asn; Gln Val Ile; Leu Ile Leu, Val Las sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos pueden fabricarse fácilmente utilizando técnicas de síntesis de péptidos bien conocidas en la materia, tales como la síntesis de péptidos en fase sólida y similares, o o por manipulación de ADN recombinante. En la técnica se conocen bien los procedimientos para la manipulación de secuencias de ADN para producir variantes de sustitución, inserción o deleción de una proteína. Por ejemplo, técnicas para realizar mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en el ADN son bien conocidas para los expertos en la técnica e incluyen mutagénesis M13, mutagénesis in vitro T7-Gen (USB, Cleveland, OH), mutagénesis dirigida a sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagénesis dirigida a sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis dirigida a sitio.

Derivados “Derivados” incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos que pueden, en comparación con la secuencia de aminoácidos de la forma natural de la proteína, tal como la proteína de interés, comprender sustituciones de aminoácidos con restos de aminoácido de origen no natural o adiciones de restos de aminoácido de origen no natural. Los “derivados” de una proteína también incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos que comprenden restos de aminoácido modificados de origen natural (glucosilados, acilados, preniladso, fosforilados, miristoilados, sulfatados, etc.) o modificados no origen no natural en comparación con la secuencia de aminoácidos de forma no natural del polipéptido. Un derivado también puede comprender uno o más sustituyentes o adiciones no aminoacídicas en comparación con la secuencia de aminoácidos de la que deriva, por ejemplo, una molécula indicadora u otro ligando, unido covalente o no covalentemente a la secuencia de aminoácidos, tal como una molécula indicadora que se une para facilitar su detección, y restos de aminoácido que no son de origen natural con respecto a la secuencia de aminoácidos de una proteína de origen natural.

Ortólogo(s) /Parálogo(s) Los ortólogos y parálogos incluyen conceptos evolutivos usados para describir las relaciones antecesoras de los genes. Los parálogos son genes dentro de la misma especie que se han originado a través de la duplicación de un gen antecesor y los ortólogos son genes de diferentes organismos que se han originado a través de especiación.

Dominio El término “dominio” se refiere a un conjunto de aminoácidos conservados en posiciones específicas a lo largo de un alineamiento de secuencias de las proteínas evolutivamente relacionadas. Aunque los aminoácidos en otras posiciones pueden variar entre los homólogos, los aminoácidos que están altamente conservados en posiciones específicas indican aminoácidos que son probablemente esenciales en la estructura, estabilidad o función de una proteína. Identificado por su alto grado de conservación en las secuencias alienadas de una familia de homólogos de proteínas, estas pueden utilizarse como identificadores para determinar si cualquier polipéptido en cuestión pertenece a una familia polipeptídica previamente identificada.

Motivo/Secuencia consenso/Firma El término “motivo” o “secuencia consenso” o “firma” se refiere a una región corta conservada en la secuencia de las proteínas evolutivamente relacionadas. Los motivos son partes de dominios frecuentemente muy conservadas, pero también pueden incluir solo parte del dominio, o se ubican fuera del dominio conservado (si todos los aminoácidos del motivo caen fuera de un dominio definido).

Hibridación El término “hibridación” como se define en el presente documento es un procedimiento en el que las secuencias de nucleótidos complementarias sustancialmente homólogas hibridan entre sí. El procedimiento de hibridación puede producirse completamente en la solución, es decir, ambos ácidos nucleicos complementarios están en la solución. El procedimiento de hibridación también puede producirse con uno de los ácidos nucleicos complementarias inmovilizada en una matriz tal como perlas magnéticas, perlas de Sefarosa o cualquier otra resina. El procedimiento de hibridación puede producirse adicionalmente con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizada en un soporte sólido, tal como una membrana de nitrocelulosa o de nailon, o inmovilizada mediante, por ejemplo, fotolitografía a, por ejemplo, un soporte vítreo silíceo (el último conocido como matrices o micromatrices de ácido nucleico o como microplacas de ácido nucleico). Con el fin de permitir que se produzca la hibridación, las moléculas de ácido nucleico de manera general se desnaturalizan térmica o químicamente para fundir una doble cadena en dos cadenas únicas y/o para retirar horquillas u otras estructuras secundarias de ácidos nucleicos de cadena sencilla.

El término “rigurosidad” se refiere a las condiciones bajo las cuales se produce la hibridación. La rigurosidad de la hibridación está influenciada por condiciones tales como temperatura, concentración de sales, fuerza iónica y composición del tampón de hibridación. Generalmente, se seleccionan condiciones de baja rigurosidad de aproximadamente 30 °C menor que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. Las condiciones de rigurosidad media son cuando la temperatura es 20 °C menor que la Tm, y las condiciones de alta rigurosidad son cuando la temperatura es 10 °C menor que la Tm. Las condiciones hibridación de rigurosidad alta se usan típicamente para aislar las secuencias de hibridación que tienen alta similitud de secuencia con la secuencia de ácido nucleico diana. Sin embargo, los ácidos nucleicos pueden desviarse en cuanto a la secuencia y aún codificar un polipéptido sustancialmente idéntico, debido a la degeneración del código genético. Por lo tanto, algunas veces pueden necesitarse condiciones de hibridación de rigurosidad media para identificar dichas moléculas de ácido nucleico.

La Tm es la temperatura a la fuerza iónica y el pH definidos, a la cual el 50 % de una secuencia diana hibrida con una sonda perfectamente apareada. La Tm depende de las condiciones de solución y de la composición base y la longitud de la sonda. Por ejemplo, las secuencias más largas hibridan específicamente a temperaturas más altas. El índice máximo de hibridación se obtiene de aproximadamente 16 ºC hasta 32 ºC por debajo de la Tm. La presencia de cationes monovalentes en la solución de hibridación reduce la repulsión electrostática entre las dos cadenas de ácido nucleico que promueven, por lo tanto, la formación del híbrido; este efecto es visible para concentraciones de sodio de hasta 0,4 M (para concentraciones más elevadas, este efecto puede ignorarse). La formamida reduce la temperatura de fusión de los dúplex ADN-ADN y ADN-ARN con 0,6 a 0,7 ºC para cada porcentaje de formamida y la adición de formamida al 50 % permite que se realice la hibridación a de 30 a 45 ºC, aunque se disminuirá el índice de hibridación. Los emparejamientos erróneos de los pares de bases reducen el índice de hibridación y la estabilidad térmica de los dúplex. De media y para sondas grandes, la Tm disminuye aproximadamente 1 ºC por % de emparejamiento erróneo de bases. La Tm puede calcularse utilizando las siguientes ecuaciones, dependiendo de los tipos de híbridos: 1) Híbridos de ADN-ADN (Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem., 138: 267–284, 1984): Tm= 81,5 °C + 16,6 x log10 [Na+]a + 0,41x % [G/Cb] – 500 x [Lc]–1 – 0,61 x % de formamida 2) Híbridos de ADN-ARN o ARN-ARN: Tm= 79,8 + 18,5 (log10[Na+]a) + 0,58 ( % G/Cb) + 11,8 ( % G/Cb)2 – 820/Lc 3) Híbridos de oligo-ADN u oligo ARNd: Para <20 nucleótidos: Tm = 2 (In) Para 20-35 nucleótidos: Tm = 22 + 1,46 (In) a o para otro catión monovalente, pero solo exacto en el intervalo 0,01–0,4 M.

b solo es exacto para % GC en el intervalo de 30 % a 75 %.

c L = longitud de dúplex en pares de bases.

d oligo, oligonucleótido; In = longitud eficaz del cebador = 2% (nº de G/C) + (nº de A/T).

La unión inespecífica puede controlarse usando uno cualquiera de un número de técnicas conocidas tal como, por ejemplo, bloqueo de la membrana con soluciones que contienen proteína, adiciones de ARN, ADN y SDS heterólogos al tampón de hibridación y tratamiento con Rnasa. Para sondas no homólogas, puede realizarse una serie de hibridaciones al variar uno de (i) disminuir progresivamente la temperatura de hibridación (por ejemplo, de 68 ºC a 42 ºC) o (ii) disminuir progresivamente la concentración de formamida (por ejemplo, de 50 % al 0 %). El experto en la materia conoce los diversos parámetros que pueden alterarse durante la hibridación y que, o bien mantener o cambiar las condiciones de rigurosidad.

Además de las condiciones de hibridación, la especificidad de la hibridación también depende típicamente de la función de lavados posthibridación. Para retirar el fondo resultante de la hibridación inespecífica, las muestras se lavan con soluciones salinas diluidas. Los factores críticos de dichos lavados incluyen la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final: cuanto menor es la concentración de sal y mayor es la temperatura de lavado, mayor es la rigurosidad del lavado. Las condiciones de lavado se realizan típicamente a o por debajo de la rigurosidad de hibridación. Una hibridación positiva proporciona una señal que es al menos dos veces la del fondo. Generalmente, las condiciones de rigurosidad adecuadas para los ensayos de hibridación de ácido nucleico o los procedimientos de detección de amplificación de genes son como se han establecido anteriormente. También pueden seleccionarse condiciones más o menos rigurosas. El experto en la materia conoce los diversos parámetros que pueden alterarse durante el lavado y que, o bien mantener o cambiar las condiciones de rigurosidad.

Por ejemplo, las condiciones de hibridación de alta rigurosidad típicas para híbridos de ADN mayores de 50 nucleótidos incluyen hibridación a 65 ºC en 1 x SSC o a 42 ºC en 1 x SSC y formamida al 50 %, seguido de lavado a 65 ºC en 0,3 x SSC. Ejemplos de de condiciones de hibridación de rigurosidad media para híbridos de ADN mayores de 50 nucleótidos incluyen hibridación a 50 ºC en 4 x SSC o a 40 ºC en 6 x SSC y formamida al 50 %, seguido de lavado a 50 ºC en 2 x SSC. La longitud del híbrido es la longitud prevista para la hibridación del ácido nucleico. Cuando los ácidos nucleicos de secuencia conocida se hibridan, la longitud del híbrido puede determinarse alineando las secuencias e identificando las regiones conservadas descritas en el presente documento. 1 x SSC es NaCl 0,15M y citrato sódico 15 mM; la solución de hibridación y las soluciones de lavado pueden incluir adicionalmente 5x reactivo de Denhard, SDS al 0,5-1,0 %, 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado, pirofosfato sódico al 0,5 %.

Con objeto de definir el nivel de rigurosidad, se puede hacer referencia a Sambrook y col., (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ª Edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York o a Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 y las actualizaciones anuales).

Variante de corte y empalme La expresión “variante de corte y empalme” como se usa en el presente documento incluye variantes de una secuencia de ácido nucleico en la que los intrones y/o exones seleccionados se han escindido, reemplazado, desplazado o añadido, o en la que los intrones se han acortado o alargado. Dichas variantes serán unas en las que la actividad biológica de la proteína se conserva sustancialmente; esto puede conseguirse conservando selectivamente los segmentos funcionales de la proteína. Dichas variantes de corte y empalme pueden encontrarse en la naturaleza o pueden ser fabricadas por el hombre. Los procedimientos para predecir y aislar dichas variantes de corte y empalme son bien conocidos en la técnica (véase por ejemplo, Foissac y Schiex, BMC Bioinformatics. 2005; 6: 25).

Variante alélica Los alelos o variantes alélicas son formas alternativas de un gen determinado, localizado en la misma posición cromosómica. Las variantes alélicas incluyen Polimorfismos de nucleótidos sencillos (SNP), así como Polimorfismos de Inserción/Deleción pequeños (INDEL). El tamaño de los INDEL es normalmente menor de 100 pb. Los SNP y los INDEL forman el grupo de variantes de secuencia más grande en las cepas polimórficas de origen natural de la mayoría de los organismos.

´Redistribución de genes/Evolución dirigida La redistribución de genes o evolución dirigida consiste en iteraciones de redistribución de ADN, seguidas de detección y/o selección apropiada para generar variantes de ácidos nucleicos o partes de las mismas que codifican proteínas que tienen una actividad biológica modificada (Castle y col., (2004) Science 304(5674): 1151–4; patentes de Estados Unidos Nº 5.811.238 ay 6.395.547).

Elemento regulador/Secuencia control/Promotor Las expresiones “elemento regulador”, “secuencia de control” y “promotor” se usan de forma intercambiable en el presente documento y se han tomado en un contexto amplio para hacer referencia a secuencias de ácido nucleico capaces de efectuar la expresión de las secuencias a las que están unidas. El término “promotor” típicamente se refiere a una secuencia de ácido nucleico control localizada en dirección 5’ del inicio transcripcional de un gen y que está implicada en el reconocimiento y unión de la ARN polimerasa y otras proteínas, dirigiendo de este modo la transcripción de un ácido nucleico unido operativamente. Incluidas en los términos mencionados anteriormente se encuentran las secuencias reguladoras de la transcripción derivadas de un gen genómico eucariota clásico (que incluye la caja TATA que es necesaria para el inicio adecuado de la transcripción, con o sin una secuencia de caja CCAAT) y elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias activadoras en dirección 5’, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión génica en respuesta a estímulos del desarrollo y/o externos, o en una forma específica de tejido. También se incluye dentro del término una secuencia reguladora de la transcripción de un gen procariota clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladoras transcripcionales de caja -10. La expresión “elemento regulador” también incluye una molécula de fusión sintética o un derivado que confiere, activa o potencia la expresión de una molécula de secuencia ácido nucleico en una célula, tejido u órgano.

Un “promotor vegetal” comprende elementos reguladores, que median en la expresión de un segmento de secuencia de codificación en células vegetales. Por consiguiente, un promotor vegetal no tiene que ser de origen vegetal, pero puede originarse a partir de virus o microorganismos, por ejemplo de virus que atacan a células vegetales. El “promotor vegetal” también puede originarse de una célula vegetal por ejemplo, de la planta que se transforma con la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar en el procedimiento de la invención y que se describe en el presente documento. Esto también se aplica a las otras señales reguladoras “vegetales”, tales como terminadores “vegetales”. Los promotores en la dirección 5’ de las secuencias de nucleótidos útiles en los procedimientos de la presente invención pueden modificarse mediante una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de nucleótidos sin interferir en la funcionalidad o actividad de cualquiera de promotores, marco de lectura abierta (ORF) o región reguladora en 3’, tales como terminadores u otras regiones reguladoras en 3’ que se localizan lejos del ORF. Además es posible que la actividad de los promotores aumente mediante la modificación de su secuencia o que se reemplacen completamente por más promotores activos, incluso promotores de organismos heterólogos. Para la expresión en plantas, la molécula de ácido nucleico debe, como se ha descrito anteriormente, estar unida operativamente a o comprender un promotor adecuado que exprese el gen de manera adecuada en el tiempo y con el patrón de expresión espacial requerido.

Para la identificación de promotores funcionalmente equivalentes, la fuerza del promotor y/o el patrón de expresión de un promotor candidato pueden analizarse, por ejemplo, uniendo operativamente el promotor a un gen indicador y evaluando el nivel de expresión y el patrón del gen indicador en diversos tejidos de la planta. Los genes indicadores bien conocidos adecuados incluyen, por ejemplo, beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa. La actividad del promotor se evalúa midiendo la actividad enzimática de la beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa. La fuerza del promotor y/o el patrón de expresión pueden después compararse con los de un promotor de referencia (tal como el utilizado en los procedimientos de la presente invención). Como alternativa, la fuerza del promotor puede evaluarse cuantificando los niveles de ARNm o comparando los niveles de ARNm del ácido nucleico utilizado en el procedimientos de la presente invención, con niveles de ARNm de los genes constitutivos, tal como ARNr 18S, utilizando procedimientos conocidos en la técnica, tal como transferencia de tipo Northern con análisis densitométrico de autorradiografías, PCR cuantitativa en tiempo real o RT-PCR (Heid y col., 1996 Genome Methods 6: 986–994). En general, con “promotor débil” se quiere decir un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificadora a un nivel bajo. Por “nivel bajo” se quiere decir niveles de aproximadamente 1/10.000 transcritos a aproximadamente 1/100.000 transcritos a aproximadamente 1/500.0000 transcritos. Por el contrario, un “promotor fuerte” dirige la expresión de una secuencia de codificación a alto nivel, o aproximadamente 1/10 transcritos a aproximadamente 1/100 transcritos a aproximadamente 1/1.000 transcritos por célula.

Unido operativamente La expresión “unido operablemente” como se usa en el presente documento se refiere a un enlace funcional entre la secuencia promotora y el gen de interés, de tal manera que la secuencia promotora es capaz de iniciar la transcripción del gen de interés.

Promotor constitutivo Un “promotor constitutivo” se refiere a un promotor que es transcripcionalmente activo durante la mayor parte, pero no necesariamente todas, de las fases de crecimiento y desarrollo y en condiciones más ambientales, en al menos una célula, tejido u órgano. La Tabla 2 siguiente proporciona ejemplos de promotores constitutivos.

Tabla 2: Ejemplos de promotores constitutivos Fuente del gen Referencia Actina McElroy et al, Plant Cell, 2: 163–171, 1990 HMGB Documento WO 2004/070039 CAMV 35S Odell et al, Nature, 313: 810–812, 1985 CaMV 19S Nilsson y col., Physiol. Plant. 100:456–462, 1997 GOS2 de Pater et al, Plant J Nov;2(6):837–44, 1992, WO 2004/065596 Ubiquitina Christensen et al, Plant Mol. Biol. 18: 675–689, 1992 Ciclofilina del arroz Buchholz et al, Plant Mol Biol. 25(5): 837–43, 1994 Histona H3 del maíz Lepetit et al, Mol. Gen. Genet. 231:276–285, 1992 Histona H3 de alfalfa Wu y col., Plant Mol. Biol. 11:641–649, 1988 Actina 2 An et al, Plant J. 10(1); 107–121, 1996 34S FMV Sanger y col., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433–443 Subunidad pequeña Rubisco Documento US 4.962.028 OCS Leisner (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(5): 2553 SAD1 Jain y col., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696 SAD2 Jain y col., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696 nos Shaw y col., (1984) Nucleic Acids Res. 12(20):7831–7846 V-ATPasa Documento WO 01/14572 Súper promotor Documento WO 95/14098 Proteínas de caja G Documento WO 94/12015 Promotor ubicuo Un promotor ubicuo es activo en sustancialmente todos los tejidos o células de un organismo.

Promotor regulado evolutivamente Un promotor regulador evolutivamente es activo durante ciertas etapas deL desarrollo o en partes de la planta que experimentan cambios evolutivos.

Promotor inducible Un promotor inducible ha inducido o aumentado el inicio de la transcripción en respuesta a un estímulo químico (para una revisión véase Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89–108), ambiental o físico, o puede ser “inducible por estrés”, es decir, activado cuando una planta está expuesta a diversas condiciones de estrés, o un “patógeno inducible”, es decir, activado cuando una planta está expuesta a la exposición de diversos patógenos.

Promotor específico de órgano/específico de tejido Un promotor específico de órgano o específico de tejido es uno que puede iniciar preferentemente la transcripción en determinados órganos o tejidos, tales como hojas, raíces, tejido de semilla, etc. Por ejemplo, un “promotor específico de raíz” es un promotor que es transcripcionalmente activo predominantemente en las raíces de las plantas, sustancialmente con la exclusión de cualquier otra parte de una planta, mientras que aún permite cualquier expresión parcial en estas otras partes de la planta. En el presente documento a los promotores que pueden iniciar la transcripción solo en determinadas células se les denomina “específicos de célula”.

Un promotor específico de tejido verde como se define en el presente documento es un promotor que es transcripcionalmente activo predominantemente en el tejido verde, sustancialmente con la exclusión de cualquiera otra parte de una planta, mientras que aún permite cualquier expresión parcial en estas otras partes de la planta.

Ejemplos de promotores específicos de tejido verde que pueden utilizarse para realizar los procedimientos de la invención se muestran en la Tabla 3 a continuación.

Tabla 3: Ejemplos de promotores específicos de tejido verde

Gen

Expresión

Referencia

Ortofosfato diquinasa de maíz Específica de Fukavama y col., 2001 hoja Fosfoenolpiruvato carboxilasa de maíz Específica de Kausch y col., 2001 hoja Fosfoenolpiruvato carboxilasa de arroz Específica de Liu y col., 2003 hoja Subunidad pequeña de Rubisco de arroz Específica de Nomura y col., 2000 hoja Beta expanslna EXBP9 de arroz Específica de Documento WO brote 2004/070039 Subunldad pequeña de Rubisco de frijol Específica de Panguluri y col., 2005 de palo hoja RBCS3A de guisante Específica de hoja Otro ejemplo de un promotor específico de tejido es un promotor específico de meristemo, que es transcripcionalmente activo predominantemente en tejido meristemático, sustancialmente con la exclusión de cualquier otra parte de una planta, mientras que aún permite cualquier expresión parcial en estas otras partes de la planta.

Terminador El término “terminador” incluye una secuencia de control que es una secuencia de ADN en el extremo de una unidad de transcripción que señaliza el procesamiento y la poliadenilación en 3’ de un transcrito primario y la terminación de la transcripción. El terminador puede derivar del gen natural, de una diversidad de otros genes de planta, o de ADN- T. El terminador a añadir puede derivar de, por ejemplo, los genes nopalina sintasa u octopina sintasa, o, como alternativa, de otro gen vegetal, o, menos preferentemente de cualquier otro gen eucariota Modulación El término “modulación” significa en relación a la expresión o expresión de gen, un procedimiento en el que el nivel de expresión se cambia mediante dicho gen de expresión en comparación con la planta control, preferentemente el nivel de expresión puede aumentarse. La expresión no modulada original puede ser de cualquier tipo de expresión de un ARN estructural (ARNr, ARNt) o ARNm con traducción posterior. La expresión “modulación de la actividad” significará cualquier cambio de la expresión de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención o las proteínas codificadas, que conduce a un rendimiento aumentado y/o a un crecimiento aumentado de las plantas.

Expresión aumentada/sobreexpresión El término “expresión aumentada” o “sobreexpresión” como se usa en el presente documento, significa cualquier forma de expresión que es adicional al nivel de expresión original de tipo silvestre.

Los procedimientos para aumentar la expresión de genes o productos génicos están bien documentados en la técnica e incluyen, por ejemplo, la sobreexpresión dirigida por promotores apropiados, el uso de potenciadores de la transcripción o potenciadores de traducción. Los ácidos nucleicos aislados que sirven como elementos promotores o potenciadores pueden introducirse en una posición adecuada (típicamente cadena arriba) de una forma no heteróloga de un polinucleótido para regular por aumento la expresión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés. Por ejemplo, los promotores endógenos pueden alterarse in vivo por mutación, deleción y/o sustitución (véase, Kmiec, patente de EE.UU. 5.565.350; Zarling y col., PCT/US93/03868), o pueden introducirse promotores aislados en una célula vegetal en la orientación y distancia apropiada de un gen de la presente invención de tal manera que se controle la expresión del gen.

Si se desea la expresión del polipéptido, generalmente es deseable incluir una región de poliadenilación en el extremo 3 'de una región codificante de polinucleótido. La región de poliadenilación puede derivar del gen natural, de una diversidad de otros genes de planta, o de ADN-T. La secuencia en el extremo 3’ a añadir puede derivar de, por ejemplo, los genes nopalina sintasa u octopina sintasa, o, como alternativa, de otro gen vegetal, o, menos preferentemente de cualquier otro gen eucariota También puede añadirse una secuencia intrónica a la región no traducida en 5’ (UTR) o la secuencia codificante de la secuencia de codificación parcial para aumentar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol. Se ha observado que la inclusión de un intrón de corte y empalme en la unidad de transcripción en construcciones de expresión tanto de plantas como de animales aumenta la expresión génica tanto a nivel de proteína como de ARNm hasta 1.000 veces (Buchman y Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395 – 4405; Callis y col., (1987) Genes Dev 1:1183– 1200). Dicha potenciación intrónica de la expresión génica es típicamente mayor cuando se pone cerca del extremo 5’ de la unidad de transcripción. En la técnica se conoce el uso de los intrones de maíz, el intrón Adh1-S, 1, 2 y 6, el intrón Bronze-1. Para una información general véase: The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling y Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).

Gen endógeno En el presente documento la referencia a un “gen endógeno”, no solo se refiere al gen en cuestión como se encuentra en una planta en su forma natural (es decir, sin existir ninguna intervención humana), sino también se refiere a aquel mismo gen (o un ácido nucleico/gen sustancialmente homólogo) en una forma aislada posteriormente (re)introducida en una planta (un transgén). Por ejemplo, una planta transgénica que contiene dicho transgén puede encontrar una reducción sustancial de la expresión transgénica y/o reducción sustancial de la expresión del gen endógeno.

Expresión disminuida En el presente documento, se toma que la referencia a “reducción o eliminación sustancial” significa una disminución en la expresión del gen endógeno y/o los niveles de polipéptido y/o actividad de polipéptido con respecto a las plantas control. La reducción o eliminación sustancial está en orden creciente de preferencia al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más reducido en comparación con el de las plantas control.

Para la reducción o eliminación sustancial de la expresión de un gen endógeno en una planta, se requiere una longitud suficiente de nucleótidos sustancialmente contiguos de una secuencia de ácidos nucleicos. Para realizar el silenciamiento génico, éste puede ser tan pequeño como 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o menos nucleótidos, como alternativa éste puede ser tanto como el gen completo (incluyendo la UTR 5' y/o 3' ya sea en parte o en su totalidad). El tramo de los nucleótidos sustancialmente contiguos puede proceder del ácido nucleico que codifica la proteína de interés (gen diana), o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo y homólogo de la proteína de interés. Preferentemente, el tramo de los nucleótidos sustancialmente contiguos es capaz de formar enlaces de hidrógeno con el gen diana (cadena en sentido o antisentido), más preferentemente, el tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos tiene, en orden creciente de preferencia, una identidad de secuencia de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 % con el gen diana (cadena en sentido o antisentido). Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido (funcional) no es un requisito para los diversos procedimientos analizados en el presente documento para la reducción o eliminación sustancial de la expresión de gen endógeno.

Esta reducción o eliminación sustancial de la expresión puede realizarse usando herramientas y técnicas rutinarias. Un procedimiento preferido para la reducción o eliminación sustancial de la expresión de un gen endógeno es introducir y expresar en una planta una construcción genética en la que el ácido nucleico (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos procedentes del gen de interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo y homólogo de cualquiera de las proteínas de interés) se clona como una repetición invertida (en parte o completamente), separado por un espaciador (ADN no codificante).

En dicho procedimiento preferido, la expresión del gen endógeno se reduce o elimina sustancialmente a través de silenciamiento mediado por ARN usando una repetición invertida de un ácido nucleico o una parte del mismo (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos procedentes del gen de interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés), preferentemente capaz de formar una estructura en horquilla. La repetición invertida se clona en un vector de expresión que comprende secuencias control. Una secuencia de ácido nucleico de ADN no codificante (un espaciador, por ejemplo un fragmento de la región de unión de matriz (MAR), un intrón, un polienlazador etc.) se localiza entre los dos ácidos nucleicos invertidos que forman la repetición invertida. Después de la transcripción de la repetición invertida, se forma un ARN quimérico con una estructura autocomplementaria (parcial o completa). Esta estructura de ARN bicatenario se denomina ARN en horquilla (ARNhp). El ARNhp se procesa en la planta en los ARNip que se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). El RISC escinde adicionalmente los transcritos de ARNm, reduciendo por lo tanto sustancialmente el número de transcriptos de ARNm que van a traducirse en los polipéptidos. Para detalles generales adicionales véase, por ejemplo, Grierson y col. (1998) documento WO 98/53083; Waterhouse y col., (1999) documento WO 99/53050).

La realización de los procedimientos de la Invención no se basa en introducir y expresar en una planta una construcción genética en la que se clona el ácido nucleico como una repetición invertida, sino que pueden utilizarse cualquiera de uno o más de los diversos procedimientos de “silenciamiento” génico bien conocidos para conseguir los mismos efectos.

Un procedimiento de este tipo para la reducción de la expresión del gen endógeno es el silenciamiento mediado por ARN de la expresión génica (regulación negativa). En este caso, el silenciamiento se activa en una planta mediante una secuencia de ARN bicatenario (ARNbc) que es sustancialmente similar al gen endógeno diana. Este ARNbc se procesa adicionalmente en la planta en aproximadamente 20 a aproximadamente 26 nucleótidos denominado ARN de interferencia pequeño (ARNip). Los ARNip se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) que escinde el transcrito de ARNm del gen endógeno diana, reduciendo por tanto sustancialmente el número de transcritos de ARNm que se traducen en un polipéptido. Preferentemente, la secuencia de ARN bicatenario corresponde a un gen diana. Otro ejemplo de un procedimiento de silenciamiento de ARN implica la introducción de secuencias de ácidos nucleicos o partes de las mismas (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos procedentes del gen de interés o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés) en una orientación en sentido en una planta. "Orientación en sentido” se refiere a una secuencia de ADN que es homologa a un trascrito de ARNm de la misma. Por lo tanto, en una planta se introduciría al menos una copia de la secuencia de ácido nucleico. La secuencia de ácido nucleico adicional reducirá la expresión del gen endógeno, dando lugar a un fenómeno conocido como cosupresión. La reducción de la expresión del gen sería más pronunciada si en una planta se introdujesen varias copias adicionales de una secuencia de ácido nucleico, cuando hay una correlación positiva entre altos niveles de trascrito y la activación de cosupresión.

Otro ejemplo de un procedimiento de silenciamiento de ARN implica el uso de secuencias de ácido nucleico antisentido. Una secuencia de ácido nucleico “antisentido” comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico “sentido” que codifica una proteína, es decir complementaria a la cadena que codifica una molécula de ADNc bicatenario o complementario a una secuencia de transcrito de ARNm. La secuencia de ácidos nucleicos antisentido es, preferentemente, complementaria a gen endógeno a silenciar. La complementariedad puede localizarse en la “región de codificación” y/o en la “región no codificante” de un gen. La expresión “región de codificación” se refiere a una región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen en restos de aminoácidos. La expresión “región no codificante” se refiere a las secuencias 5' y 3' que flanquean la región de codificación que se transcriben pero no se traducen en aminoácidos (también denominadas regiones no traducidas 5' y 3').

Las secuencias de ácido nucleico antisentido pueden diseñarse de acuerdo con las normas de emparejamiento de bases de Watson y Crick. La secuencia de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria a la secuencia de ácido nucleico completa (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos procedentes del gen de interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés), pero también puede ser un oligonucleótido que sea antisentido para solo una parte de la secuencia de ácido nucleico (incluyendo las UTR 5' y 3' del ARNm). Por ejemplo, la secuencia de oligonucleótidos antisentido puede ser complementaria a la región que rodea el sitio de inicio de la traducción de un transcrito de ARNm que codifica un polipéptido. La longitud de una secuencia de oligonucleótidos antisentido adecuada se conoce en la técnica y puede comenzar desde aproximadamente 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 o 10 nucleótidos de longitud o menos. Una secuencia de ácido nucleico antisentido de acuerdo con la Invención puede construirse usando síntesis química y reacciones de ligamiento enzimático usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico antisentido (por ejemplo, una secuencia de oligonucleótidos antisentido) puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos de origen natural o varios nucleótidos modificados diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre las secuencias de ácidos nucleicos antisentido y sentido, por ejemplo, pueden usarse derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos por acridina. En la técnica se conocen bien ejemplos de nucleótidos modificados que pueden usarse para generar las secuencias de ácidos nucleicos antisentido. Las modificaciones de nucleótidos conocidas incluyen metilación, ciclación y 'protecciones y sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo tal como inosina. En la técnica se conocen bien otras modificaciones de nucleótidos.

La secuencia de ácido nucleico antisentido puede producirse biológicamente usando un vector de expresión en el que se ha subclonado una secuencia de ácido nucleico en una orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito del ácido nucleico insertado tendrá una orientación antisentido con respecto a un ácido nucleico diana de interés). Preferentemente, la producción de las secuencias de ácido nucleico antisentido en plantas se produce mediante una construcción de ácido nucleico establemente integrada que comprende un promotor, un oligonucleótido antisentido unido operativamente y un terminador.

Las moléculas de ácido nucleico usadas para el silenciamiento en los procedimientos de la invención (tanto si se introducen en una planta como si se generan in situ) se hibridan con, o se unen a, los transcritos de ARNm y/o ADN genómico que codifica un polipéptido para inhibir así la expresión de la proteína, por ejemplo, mediante la inhibición de la transcripción y/o la traducción. La hibridación puede ser mediante complementariedad de nucleótidos convencional para formar un dúplex estable o, por ejemplo, en el caso de una secuencia de ácido nucleico antisentido que se une a los dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en el surco principal de la hélice doble. Las secuencias de ácido nucleico antisentido pueden introducirse en una planta mediante transformación o inyección directa en un sitio de tejido específico. Como alternativa, las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden modificarse para llegar a las células seleccionadas y después administrarse por vía sistémica. Por ejemplo, para la administración sistémica, las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden modificarse de tal manera que se unan específicamente a receptores o a antígenos expresados en una superficie de la célula seleccionada, por ejemplo, ligando la secuencia de ácido nucleico antisentido a los péptidos o anticuerpos que se unen a los receptores o antígenos de la superficie celular. Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido también pueden administrarse a las células usando los vectores descritos en el presente documento.

De acuerdo con un aspecto adicional, la secuencia de ácido nucleico antisentido es una secuencia de ácido nucleico a-anomérica. Una secuencia de ácido nucleico a-anomérica forma híbridos bicatenarios específicos con el ARN complementario en el que, al contrario que las unidades b habituales, las cadenas corren paralelas entre sí (Gaultier y col., (1987) Nucl Ac Res 15: 6625–6641). La secuencia de ácido nucleico antisentido también pueden comprender un 2'-o-metilrribonucleótido (Inoue y col., (1987) Nucl Ac Res 15, 6131–6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue y col., (1987) FEBS Lett. 215, 327–330).

La reducción o eliminación sustancial de la expresión del gen endógeno también puede realizarse usando ribozimas. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas con actividad de ribonucleasa que pueden escindir una secuencia de ácido nucleico monocatenaria, tal como ARNm, con la que tienen una región complementaria. Por tanto, las ribozimas (por ejemplo, las ribozimas de cabeza de martillo (descritas en Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334, 585-591) pueden usarse para escindir catalíticamente los transcritos de ARNm que codifican un polipéptido, lo que reduce sustancialmente el número de transcritos de ARNm que van a traducirse en un polipéptido. Puede diseñarse una ribozima que tenga especificidad por una secuencia de ácido nucleico (véase, por ejemplo: Cech y col., patente de Estados Unidos N° 4.987.071; y Cech y col., patente de Estados Unidos N° 5.116.742). Como alternativa, pueden usarse transcritos de ARNm correspondientes a una secuencia de ácido nucleico para seleccionar un ARN catalítico que tenga una actividad de ribonucleasa específica de un conjunto de moléculas de ARN (Bartel y Szostak (1993) Science 261, 1411–1418). El uso de ribozimas para el silenciamiento génico en plantas es conocido en la técnica (por ejemplo, Atkins y col., (1994) documento WO 94/00012; Lenne y col., (1995) documento WO 95/03404; Lutziger y col., (2000) documento WO 00/00619; Prinsen y col., (1997) WO 97/13865 y Scott y col., (1997) documento WO 97/38116).

El silenciamiento génico también puede producirse mediante mutagénesis de inserción (por ejemplo, inserción de ADN T o inserción de transposón) o mediante estrategias como las descritas, entre otros, por Angell y Baulcombe ((1999) Plant J 20(3): 357–62), (Amplicon VIGS documento WO 98/36083), o Baulcombe (documento WO 99/15682).

El silenciamiento génico también puede producirse si hay una mutación en un gen endógeno y/o una mutación en un gen aislado/ácido nucleico posteriormente introducido en una planta. La reducción de eliminación sustancial puede estar provocada por un polipéptido no funcional. Por ejemplo, un polipéptido puede unirse a diversas proteínas que interaccionan; por lo tanto, pueden proporcionarse una o más mutaciones y/o truncamientos para un polipéptido que sea aún capaz de unirse a las proteínas que interaccionan (tal como proteínas receptoras) pero que no pueden mostrar su función normal (tal como ligando de señalización).

Una estrategia adicional para silenciamiento génico es dirigir las secuencias de ácido nucleico complementarias a la región reguladora del gen (por ejemplo, el promotor y/o los potenciadores) para formar estructuras helicoidales triples que impiden la transcripción del gen en las células diana. Véase Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569–84, 1991; Helene y col., Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27–36 1992; y Maher, L.J. Bioassays 14, 807–15.1992.

Otros procedimientos, tales como el uso de anticuerpos dirigidos contra un polipéptido endógeno para inhibir su función en la planta, o la interferencia en la ruta de señalización en la que está implicada un polipéptido, serán muy conocidos por el experto. En particular, puede esperarse que las moléculas fabricadas por el hombre puedan ser útiles para inhibir la función biológica de un polipéptido diana o para interferir con la ruta de señalización en la que está implicada el polipéptido diana.

Como alternativa, puede establecerse un programa de detección selectiva para identificar en una población de plantas las variantes naturales de un gen, cuyas variantes codifican los polipéptidos con actividad reducida. Dichas variantes naturales también pueden usarse, por ejemplo, para realizar recombinación homologa.

Pueden usarse microARN (miARN) artificiales y/o naturales para desactivar la expresión génica y/o traducción del ARNm. Los miARN endógenos son ARN pequeños monocatenarios típicamente con una longitud de 19-24 nucleótidos. Actúan principalmente regulando la expresión génica y/o la traducción de ARNm. La mayoría de los microARN (miARN) vegetales tienen complementariedad perfecta o casi perfecta con sus secuencias diana. Sin embargo, hay dianas naturales con hasta cinco emparejamientos erróneos. Se procesan a partir de ARN no codificantes más largos con estructuras de plegamiento características mediante RNasas específicas bicatenarias de la familia Dicer. Después del procesamiento, se incorporan en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) mediante la unión a su componente principal, una proteína Argonauta. Los miARN sirven como componentes de especificidad del RISC, debido a que se emparejan con las bases a los ácidos nucleicos diana, principalmente ARNm, en el citoplasma. Los acontecimientos reguladores posteriores incluyen la escisión del ARNm diana y la destrucción y/o inhibición de la traducción. Por tanto, los efectos de la sobreexpresión de miARN a menudo reflejan en niveles de ARNm disminuidos de los genes diana.

Los microARN artificiales (miARNa), que tienen típicamente 21 nucleótidos de longitud, pueden modificarse por ingeniería genética específicamente para regular negativamente la expresión génica de un solo gen o de múltiples genes de interés. En la técnica se conocen bien los determinantes de la selección diana de microARN vegetales. Se han definido los parámetros empíricos para el reconocimiento de dianas y pueden usarse para ayudar a diseñar los miARNa específicos, Schwab R, 2005. Las herramientas convenientes para el diseño y generación de los miARNa y sus precursores también están disponibles para el público, Schwab y col., 2006.

Para un rendimiento óptimo, las técnicas de silenciamiento génico usadas para reducir la expresión en una planta de un gen endógeno requieren el uso de secuencias de ácidos nucleicos de plantas monocotiledóneas para la transformación de plantas monocotiledóneas, y de plantas dicotiledóneas para la transformación de plantas dicotiledóneas. Preferentemente, una secuencia de ácido nucleico de cualquier especie de planta determinada se introduce dentro de esta misma especie. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de arroz se transforma en una planta de arroz. Sin embargo, no es un requisito absoluto que la secuencia de ácido nucleico que se introduce se origine de la misma especie de planta que la planta en la que se introducirá. Basta con que haya una homología sustancial entre el gen diana endógeno y el ácido nucleico a introducir.

Anteriormente se han descrito ejemplos de diversos procedimientos para la reducción o eliminación sustancial de la expresión en una planta de un gen endógeno. Un experto en la técnica podrá adaptar fácilmente los procedimientos anteriormente mencionados para el silenciamiento para conseguir la reducción de la expresión de un gen endógeno en una planta completa o en partes de la misma usando un promotor apropiado, por ejemplo.

Marcador de selección (gen)/gen indicador Un "marcador de selección", "gen marcador de selección" o "gen indicador" incluye cualquier gen que confiere un fenotipo sobre una célula en la que se expresa para facilitar la identificación y / o selección de células que son transfectadas o transformadas con una construcción de ácido nucleico de la invención. Estos genes marcadores permiten la identificación de una transferencia satisfactoria de las moléculas de ácido nucleico mediante una serie de principios diferentes. Los marcadores adecuados se pueden seleccionar de marcadores que confieren resistencia a antibióticos o a herbicidas, que introducen un nuevo rasgo metabólico o que permiten selección visual. Los ejemplos de genes marcadores de selección incluyen genes que confieren resistencia a antibióticos (tales como nptlI que fosforila neomicina y kanamicina, o hpt, que fosforila higromicina, o genes que confieren resistencia a, por ejemplo, bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina o blasticidina), a herbicidas (por ejemplo bar, que proporciona resistencia a Basta®; aroA o gox que proporciona resistencia contra glifosato, o los genes que confieren resistencia a, por ejemplo, imidazolinona, fosfinotricina o sulfonilurea), o genes que proporcionan un rasgo metabólico (tal como manA que permite a las plantas usar manosa como única fuente de carbono o xilosa isomerasa para la utilización de xilosa, o marcadores antinutritivos tales como la resistencia a 2-desoxiglucosa). La expresión de genes marcadores visuales tiene como resultado la formación de color (por ejemplo β-glucuronidasa, GUS o β-galactosidasa con sus sustratos de color, por ejemplo X Gal), luminiscencia (tal como el sistema luciferina/luciferasa) o fluorescencia (Proteína Fluorescente Verde, GFP y derivados de los mismos). Esta lista solo representa una pequeña cantidad de marcadores posibles. El experto está familiarizado con dichos marcadores. Se prefieren diferentes marcadores dependiendo del organismo y del procedimiento de selección.

Se sabe que, después de la integración estable o transitoria de los ácidos nucleicos en células vegetales, solo una minoría de las células capta el ADN extraño y, si se desea, lo integra en su genoma, dependiendo del vector de expresión usado y de la técnica de transfección usada. Para identificar y seleccionar estos integrantes, normalmente se introduce un gen que codifica un marcador de selección (tal como los descritos anteriormente) en las células huésped junto con el gen de interés. Estos marcadores pueden usarse, por ejemplo, en mutantes en los que estos genes no son funcionales mediante, por ejemplo, deleción por procedimientos convencionales. Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican un marcador de selección pueden introducirse en una célula huésped en el mismo vector que comprende la secuencia que codifica los polipéptidos de la invención o usarse en los procedimientos de la invención, o incluso en un vector distinto. Las células que se han transfectado de manera estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse, por ejemplo, mediante selección (por ejemplo, las células que tienen integrado el marcador de selección sobreviven mientras que las otras mueren).

Dado que los genes marcadores, particularmente los genes para resistencia a antibióticos y herbicidas, ya no se requieren o no se desean en la célula huésped transgénica una vez que se han introducido satisfactoriamente los ácidos nucleicos, el procedimiento de acuerdo con la invención para introducir los ácidos nucleicos emplea ventajosamente técnicas que permiten la retirada o escisión de estos genes marcadores. Un procedimiento de este tipo es el que se conoce como cotransformación. El procedimiento de cotransformación emplea dos vectores simultáneamente para la transformación, un vector que lleva el ácido nucleico de acuerdo con la invención y un segundo que lleva el gen (o genes) marcador. Una proporción grande de transformantes recibe o, en el caso de las plantas, comprende (hasta el 40 % o más de los transformantes), ambos vectores. En el caso de transformación con Agrobacteria, los transformantes normalmente solo reciben una parte del vector, es decir, la secuencia flanqueada por el ADN-T, que normalmente representa el casete de expresión. Posteriormente, los genes marcadores pueden eliminarse de la planta transformada realizando cruzamientos. En otro procedimiento, se usan genes marcadores integrados en un transposón para la transformación junto con el ácido nucleico deseado (conocido como tecnología Ac/Ds). Los transformantes pueden cruzarse con una fuente de transposasa o los transformantes se transforman con una construcción de ácido nucleico que confiere expresión de una transposasa, de manera transitoria o estable. En algunos casos (aproximadamente 10 %), el transposón salta del genoma de la célula huésped una vez que se ha producido la transformación satisfactoriamente y se pierde. En una serie de casos adicionales, el transposón salta a una localización diferente. En estos casos, el gen marcador debe eliminarse realizando cruzamientos. En microbiología, se desarrollaron técnicas que hacen posible, o facilitan, la detección de dichos acontecimientos. Un procedimiento ventajoso adicional se basa en lo que se conoce como sistemas de recombinación; cuya ventaja es que la eliminación puede dispensarse por cruzamiento. El sistema mejor conocido de este tipo es lo que se conoce como sistema Cre/lox. Cre1 es una recombinasa que elimina las secuencias localizadas entre las secuencias loxP. el gen marcador se integra entre las secuencias loxP, éste se elimina una vez se ha producido la transformación satisfactoriamente, mediante expresión de la recombinasa. Otros sistemas de recombinación son el sistema HIN/HIX, FLP/FRT y REP/STB (Tribble y col., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255–22267; Velmurugan y col., J. Cell Biol., 149, 2000: 553–566). De acuerdo con la invención, es posible una integración específica de sitio en el genoma de la planta de la secuencia de ácido nucleico. Naturalmente, estos procedimientos también pueden aplicarse a microorganismos tales como levaduras, hongos o bacterias.

Transgénico/Transgén/Recombinante Para los fines de la invención, “transgénico”, “transgén” o “recombinante” significa con respecto a, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico, un casete de expresión, una construcción génica o un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico o un organismo transformado con las secuencias de ácido nucleico, casetes o vectores de expresión de acuerdo con la invención, todas estas construcciones realizadas por procedimientos recombinantes en los que (a) las secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas útiles en los procedimientos de la invención o (b) la secuencia (o secuencias) de control genético que se une operativamente a la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención, por ejemplo un promotor, o (c) a) y b) no se localizan en su ambiente genético natural o se han modificado mediante procedimientos recombinantes, siendo posible que la modificación tome la forma de, por ejemplo, una sustitución, adición, deleción, inversión o inserción de uno o más restos de nucleótido. Se entiende que ambiente genético natural significa el locus genómico o cromosómico natural en la planta original o la presencia en una genoteca. En el caso de una genoteca, el ambiente genético natural de la secuencia de ácido nucleico se conserva preferentemente, al menos en parte. El ambiente flanquea la secuencia de ácido nucleico al menos en un lado y tiene una longitud de secuencia de al menos 50 pb, preferentemente al menos 500 pb, en especial preferentemente al menos 1.000 pb, más preferentemente al menos 5.000 pb. Un casete de expresión de origen natural, por ejemplo la combinación de origen natural del promotor natural de las secuencias de ácido nucleico con la secuencia de ácido nucleico correspondiente que codifica un polipéptido útil en los procedimientos de la presente invención, como se ha definido anteriormente, llega a ser un casete de expresión transgénica cuando este casete de expresión se modifica mediante procedimientos sintéticos no naturales (“artificiales”) tal como, por ejemplo, tratamiento mutagénico. Se describen procedimientos adecuados, por ejemplo, en los documentos US 5.565.350 o WO 00/15815.

Por tanto, una planta transgénica, para los fines de la invención se entiende que significa, como se ha indicado anteriormente, que los ácidos nucleicos usados en el procedimiento de la invención no están en su locus natural en el genoma de dicha planta, siendo posible que los ácidos nucleicos se expresen de manera homologa o heteróloga. Sin embargo, como se ha mencionado, transgénico también significa que, aunque los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención o usados en el procedimiento de la invención están en su posición natural en el genoma de una planta, la secuencia se ha modificado con respecto a la secuencia natural y/o que las secuencias reguladoras de las secuencias naturales se han modificado. Por transgénico se entiende, preferentemente, que significa la expresión de los ácidos nucleicos de acuerdo con la Invención en un locus no natural en el genoma, es decir, se produce la expresión homóloga o, preferentemente, heteróloga de los ácidos nucleicos. En el presente documento se mencionan las plantas transgénicas preferidas.

Transformación El término “introducción” o "transformación" como se refiere en el presente documento abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del procedimiento utilizado para la transferencia. El tejido vegetal capaz de la propagación clonal posterior, ya sea por organogénesis o embriogénesis, puede transformarse con una construcción genética de la presente Invención y una planta entera regenerada a partir del mismo. El tejido particular escogido variará dependiendo de los sistemas de propagación clonal disponibles para, y más adecuados para, las especies particulares que se están transformado. Ejemplos de tejidos objetivo incluyen discos de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotilos, megagametofitos, tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristema apical, yemas axilares, y meristemos radiculares), y tejido meristemático inducido (por ejemplo, meristemo de cotiledón y meristemo del hipocotiledón). El polinucleótido puede introducirse transitoria o establemente en una célula huésped y puede mantenerse no integrado, por ejemplo, como un plásmido. Como alternativa, puede integrarse en el genoma huésped. La célula vegetal transformada resultante puede después utilizarse para regenerar una planta transformada de una manera conocida por los expertos en la técnica.

La transferencia de genes externos dentro del genoma de una planta se denomina transformación. La transformación de especies de plantas es actualmente una técnica bastante habitual. Ventajosamente, puede usarse cualquiera de los diversos procedimientos de transformación para introducir el gen de interés en una célula antecesora adecuada. Los procedimientos descritos para la transformación y regeneración de plantas de tejidos de plantas o células de plantas pueden utilizarse para la transformación transitoria o estable. Los procedimientos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, productos químicos que aumentan la captación de ADN libre, inyección del ADN directamente en la planta, pistola de bombardeo de partículas, transformación utilizando virus o polen y microproyección. Pueden seleccionarse procedimientos del procedimiento de calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens, F. A. y col., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I y col. (1987) Plant Mol Biol 8: 363 - -373); electroporación de protoplastos (Shillito R.D. y col., (1985) Bio/Technol 3, 1099 - -1102); microinyección en el material de planta (Crossway A y col., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179–185); bombardeo de partículas recubiertas con ADN o ARN (Klein TM y col., (1987) Nature 327: 70) infección con virus (no integrantes) y similares. Las plantas transgénicas, incluyendo plantas de cultivo transgénicas, se producen preferentemente mediante transformación mediada por Agrobacteríum. Un procedimiento de transformación ventajoso es la transformación en la planta. Para esta finalidad, es posible, por ejemplo, permitir que la agrobacterias actúen en las semillas de la planta o inocular las agrobacterias en el meristemo de la planta. Se ha demostrado de un modo particularmente conveniente, de acuerdo con la invención, permitir que una suspensión de agrobacterias transformadas actúe en la planta intacta o al menos en los primordios florales. Posteriormente, la planta crece hasta que se obtienen las semillas de la planta tratada (Clough y Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Los procedimientos para la transformación de arroz mediada por Agrobacteríum incluyen procedimientos bien conocidos para la transformación de arroz, tales como los descritos en cualquiera de las siguientes: la solicitud de Patente Europea EP 1198985 A1, Aldemita y Hodges (Planta 199: 612 - -617, 1996); Chan y col., (Plant Mol Biol 22 (3): 491–506, 1993), Hiei y col., (Plant J 6 (2): 271–282, 1994), ), cuyas divulgaciones se incorporan por referencia en el presente documento en su totalidad. En el caso de la transformación de maíz, el procedimiento preferido es como se describe en Ishida y col., (Nat. Biotechnol 14(6): 745–50, 1996) o Frame y col., (Plant Physiol 129(1): 13 – 22, 2002), cuyas divulgaciones se incorporan por referencia en el presente documento en su totalidad. Dichos procedimientos se describen adicionalmente, a modo de ejemplo, en B. Jenes y col., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung y R. Wu, Academic Press (1993) 128–143 y en Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205–225). Los ácidos nucleicos o la construcción a expresar se clona preferentemente en un vector que es adecuado para transformar Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo, pBin19 (Bevan y col., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Las agrobacterlas transformadas por dicho vector pueden después usarse de una manera conocida para la transformación de plantas, tales como plantas usadas como un modelo, como Arabidopsis (Arabidopsis thaliana que se encuentra dentro del ámbito de la presente invención no se considera como una planta de cultivo) o plantas de cultivo tales como, a modo de ejemplo, plantas de tabaco, por ejemplo, sumergiendo hojas laceradas o picadas en una solución agrobacteriana y después cultivarlas en un medio adecuado. La transformación de plantas mediante Agrobacterium tumefaciens la describen, por ejemplo, Höfgen y Willmitzer en Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 o se conoce, entre otros, de F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15–38.

Además de la transformación de células somáticas, que después deben regenerarse en plantas intactas, también es posible transformar las células de meristemos de planta y, en particular, las células que se desarrollan en gametos. En este caso, los gametos transformados siguen el desarrollo natural de la planta, dando lugar a plantas transgénicas. Por tanto, por ejemplo, semillas de Arabidopsis se tratan con agrobacterias y se obtienen semillas del desarrollo de plantas de las que se transforma una determinada proporción y por tanto transgénicas [Feldman, KA and Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208:274–289; Feldmann K (1992). En: C Koncz, N–H Chua y J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapore, pp. 274–289]. Los procedimientos alternativos se basan en la retirada repetida de las inflorescencias e incubación del sitio de escisión en el centro de la roseta con agrobacterias transformadas, por lo que las semillas transformadas pueden obtenerse de modo similar en un punto de tiempo final (Chang (1994). Plant J. 5: 551–558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363–370). Sin embargo, un procedimiento especialmente eficaz es el procedimiento de infiltración por vacío con sus modificaciones tal como el procedimiento de “inmersión floral”. En el caso de la infiltración por vacío de Arabidopsis, las plantas intactas bajo presión reducida se tratan con una suspensión agrobacteriana [Bechthold, N (1993). C R Acad Sci Paris Life Sci, 316: 1194–1199], mientras que en el caso del procedimiento de “inmersión floral”, el tejido floral en desarrollo se incuba brevemente con una suspensión agrobacteriana tratada con tensioactivo [Clough, SJ und Bent, AF (1998). The Plant J. 16, 735–743]. En ambos casos se recoge una determinada proporción de semillas transgénicas y estas semillas pueden diferenciarse de semillas no transgénicas al cultivar bajo las condiciones selectivas descritas anteriormente. Además, la transformación estable de los plástidos es ventajosa ya que los plástidos se heredan por vía materna en la mayor parte de los cultivos, reduciendo o eliminando el riesgo de flujo transgénico a través del polen. La transformación del genoma del cloroplasto generalmente se realiza mediante un procedimiento que han presentado esquemáticamente Klaus y col., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225–229]. En resumen, las secuencias a transforman se clonan junto con un gen marcador de selección entre las secuencias flanqueantes homólogas al genoma del cloroplasto. Estas secuencias flanqueantes homólogas dirigen la integración específica de sitio en el plastota. La transformación plastidial se ha descrito para muchas especies de plantas diferentes y se ofrece una revisión en Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 2001 Sep 21; 312 (3):425–38 o Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20–28. Recientemente se han descrito progresos biotecnológicos adicionales, en forma de transformantes plastidiales sin marcador, que pueden producirse mediante un gen marcador cointegrado transitorio (Klaus y col., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225–229).

Marcaje en activación de ADN T El marcaje en activación de ADN-T (Hayashi y col., Science (1992) 1350–1353), implica la inserción de T-DNA, que normalmente contiene un promotor (también puede ser un potenciador de la traducción o un intrón), en la región genómica del gen de interés o 10 kb aguas arriba o abajo de la región codificante de un gen en una configuración tal que el promotor dirige la expresión del gen diana. Típicamente, la regulación de la expresión del gen diana mediante su promotor natural se interrumpe y el gen cae bajo el control del promotor recién introducido. El promotor normalmente está embebido en un ADN–T. Este ADN–T se inserta al azar en el genoma de la planta, por ejemplo, a través de infección por infección con Agrobacterium y conduce a la expresión modificada de genes cerca al ADN–T insertado. Las plantas transgénicas resultantes muestran fenotipos dominantes debido a la expresión modificada de los genes cercanos al promotor introducido.

TILLING TILLING (Inducción Dirigida de Lesiones Locales en el Genoma) es una tecnología de mutagénesis útil para generar y/o identificar ácidos nucleicos que codifican proteínas con expresión y/o actividad modificadas. El TILLING también permite la selección de plantas que llevan dichas variantes mutantes. Estas variantes mutantes pueden presentar expresión modificada, en fuerza o en localización o en tiempo (si las mutaciones afectan, por ejemplo, al promotor).

Estas variantes mutantes pueden presentar mayor actividad que la exhibida por el gen en su forma natural. El TILLING combina mutagénesis de alta densidad con procedimientos de detección de alto rendimiento. Las etapas que típicamente se siguen en el TILLING son: (a) mutagénesis EMS (Redei GP y Koncz C (1992) En Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, eds. Singapore, World Scientific Publishing Co, pp. 16–82; Feldmann y col., (1994) en Meyerowitz EM, Somerville CR, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp 137 - -172; Lightner J y Caspar T (1998) en J Martinez–Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, pp 91 - -104); (b) preparación y agrupamiento de ADN en individuos; (c) amplificación por PCR de una región de interés; (d) desnaturalización e hibridación para permitir la formación de heterodúplex; (e) DHPLC, donde la presencia de un heterodúplex en un grupo se detecta como un pico adicional en el cromatograma; (f) identificación del mutante individual; y (g) secuenciación del producto PCR mutante. En la técnica se conocen bien procedimientos de TILLING (McCallum y col., (2000) Nat Biotechnol 18: 455–457; revisado por Stemple (2004) Nat Rev Genet 5 (2): 145-50) 145–50).

Recombinación homologa La recombinación homóloga permite la introducción en un genoma de un ácido nucleico seleccionado en una posición definida seleccionada. La recombinación homóloga es una tecnología convencional utilizada rutinariamente en ciencias biológicas para organismos inferiores tales como levaduras o el musgo Physcomitrella. Se han descrito procedimientos para realizar recombinación homóloga en plantas no solo para el modelo de plantas (Offringa y col., (1990) EMBO J 9(10): 3077 - -84) sino también para plantas de cultivo, por ejemplo arroz (Terada y col., (2002) Nat Biotech 20(10): 1030 - -4; lida y Terada (2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132–8).

Rendimiento El término “rendimiento” en general significa un producto medible de valor económico, típicamente relacionado con un cultivo, un área y un periodo de tiempo específicos. Las partes de planta individuales contribuyen directamente al rendimiento en base a su número, tamaño y/o peso, o el rendimiento real es el rendimiento por acre (4.046 m2) de un cultivo y año, que se determina dividiendo la producción total (incluyendo la producción tanto cosechada como valorada) por metros cuadrados plantado.

Vigor inicial El vigor inicial (crecimiento bien equilibrado saludable activo especialmente durante las etapas tempranas del crecimiento de la planta) puede ser el resultado del aumento de la idoneidad de la planta debido a, por ejemplo, plantas que están mejor adaptadas a su ambiente (es decir, optimizando el uso de fuentes de energía y repartiendo entre brotes y raíces). Las plantas que tienen vigor inicial también muestran supervivencia aumentada de la plántula y un mejor establecimiento del cultivo, que a menudo produce campos muy uniformes (creciendo el cultivo de una manera uniforme, es decir, alcanzando la mayoría de las plantas las diversas etapas de desarrollo a sustancialmente el mismo tiempo) y a menudo mejor y mayor rendimiento. Por lo tanto, el vigor inicial puede determinarse midiendo diversos factores, tales como, peso de mil granos, porcentaje de germinación, porcentaje de emergencia, crecimiento de la plántula, altura de la plántula, longitud de la raíz, biomasa del brote y de la raíz y muchos más.

Aumento/Mejora/Potenciación Los términos "aumento", "mejora" o "potenciación" son intercambiables y significan en el sentido de la solicitud un rendimiento y/o crecimiento de al menos 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 %, preferentemente al menos 15 % o 20 %, más preferentemente 25 %, 30 %, 35 % o 40 más en comparación con las plantas control como se define en el presente documento.

Rendimiento de semillas El rendimiento de semillas aumentado puede manifestarse por sí mismo como uno o más de los siguientes: a) un aumento en la biomasa de las semillas (peso total de las semillas) que puede establecerse sobre una semilla individual y/o por planta y/o por acre o hectárea; b) número de flores por planta aumentado; c) número de semillas (llenas) aumentado; d) tasa de llenado de semillas aumentado (que se expresa como la proporción entre el número de semillas llenas dividido entre el número total de semillas); e) índice de recolección aumentado, que se expresa como una proporción del rendimiento de partes cosechables, tales como semillas, dividido entre la biomasa total, y f) peso de mil granos (PMG) aumentado, que se extrapola a partir del número de semillas llenas contadas y su peso total. Un PMG aumentado puede ser el resultado de un tamaño y/o peso de semilla aumentado y también puede ser el resultado de un aumento en el tamaño del embrión y/o endospermo.

También puede manifestarse un aumento en el rendimiento de la semilla como un aumento del tamaño de la semilla y/o volumen de la semilla. Además, también puede manifestarse un aumento en el rendimiento de la semilla en sí mismo como un aumento en el área de semilla y/o longitud de semilla y/o anchura de semilla y/o un perímetro de semilla. Un aumento en el rendimiento también puede ser el resultado de una arquitectura modificada o puede producirse como un resultado de arquitectura modificada.

Plant El término “planta” como se usa en el presente documento incluye plantas completas, ancestros y progenie de las plantas y partes de las plantas, incluyendo semillas, brotes, tallos, hojas, raíces (incluidos tubérculos), flores y tejidos y órganos, donde cada uno de los elementos mencionados anteriormente comprende el gen/ácido nucleico de interés. El término “planta” también abarca células vegetales, cultivos en suspensión, tejido de callo, embriones, regiones meristemáticas, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas, de nuevo donde cada uno de los elementos mencionados anteriormente comprende el gen/ácido nucleico de interés.

Las plantas que son particularmente útiles en los procedimientos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas incluyendo forraje o leguminosas forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles o arbustos seleccionados de la lista que comprende Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera,

Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp,

Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (por ejemplo,. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (por ejemplo, Brassica napus, Brassica rapa ssp. [canola, colza, nabo]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa,

Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus Iongan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (e.g. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora,

Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (por ejemplo,. Glycine max, Soja hispida or Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (por ejemplo, Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (por ejemplo, Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (por ejemplo, Lycopersicon

esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (por ejemplo,Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea,

Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (por ejemplo, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium or Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp.,

Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por ejemplo, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum or Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palusfris, Ziziphus spp., entre otras.

Descripción detallada de la invención

Sorprendentemente, ahora se ha comprobado que el aumento de la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de transcripción SPL15 como se define en el presente documento produce plantas que tienen un mayor rendimiento en cuanto a las semillas y/o la biomasa aérea con respecto a las plantas control. Por tanto, la invención proporciona un procedimiento para aumentar el rendimiento de las semillas y/o la biomasa aérea con respecto a plantas de control, que comprende aumentar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de factor de transcripción SPL15 como se define en el presente documento.

Un procedimiento preferido para aumentar la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de factor de transcripción SPL15 es introduciendo y expresando en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de transcripción SPL15 como se define en el presente documento.

Como se define en el presente documento, un “polipéptido del factor de transcripción SPL15” se refiere a un polipéptido que comprende un de N-terminal a C-terminal: (i) el Motivo 1 como se representa en la SEC ID N°: 276; y (ii) en orden creciente de preferencia, una identidad de secuencia de al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 98 % con el DBP de SPL representado por la SEC ID Nº 277; y (iii) Motivo 2 como se representa en la SEC ID N°: 278. Los aminoácidos más conservados dentro del motivo 1 son XLXFGXXXYFX y dentro del motivo DSXXALSLLSX (donde X es un subconjunto de aminoácidos que difieren para cada posición, como se presenta en la SEC ID N°: 276 y la SEC ID Nº 277). Dentro del motivo 1 y el motivo 2 se permiten uno o más cambios conservadores en cualquier posición, y / o uno, dos o tres cambios no conservadore(s) en cualquier posición.

Además, el polipéptido factor de transcripción SPL15 puede comprender uno cualquiera o ambos de los siguientes: (a) un tramo rico en G / S que precede al DBD del SPL; y (b) el tripéptido W (S / T) L en el extremo C-terminal del polipéptido.

Un ejemplo de un polipéptido de transcripción SPL15 como se ha definido anteriormente en el presente documento que comprende de N-terminal a C-terminal: (i) el Motivo 1 como se representa en la SEC ID N°: 276; y (ii) en orden creciente de preferencia, una identidad de secuencia de al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 98 % con el DBP de SPL representado por la SEC ID Nº 277; y (iii) Motivo 2 como se representa en la SEC ID N°: 278; y, además, que comprende: (a) un tramo rico en G / S que precede al DBD del SPL; y (b) el tripéptido W (S / T) L en el extremo C-terminal del polipéptido, se representa como en la SEC ID Nº 235. Otros ejemplos de este tipo están representados por una cualquiera de las SEC ID Nº 237, SEC ID Nº 239, SEC ID Nº 241, SEC ID Nº 243, SEC ID Nº 245, SEC ID Nº 247, SEC ID Nº 249, SEC ID Nº 251, SEC ID Nº 253, SEC ID Nº 255, SEC ID Nº 257, SEC ID Nº 259, SEC ID Nº 261, SEC ID Nº 263, SEC ID Nº 283, SEC ID Nº 285, SEC ID Nº 287 U ortólogos o parálogos de cualquiera de las SEC ID Nº mencionadas anteriormente. La invención se ilustra mediante la transformación de plantas con la secuencia de Arabidopsis thaliana representada por la SEC ID Nº 234, que codifica el polipéptido de la SEC ID N°: 235. SEC ID Nº 237 de Arabidopsis thaliana (codificada por la SEC ID Nº: 236) es un parálogo del polipéptido de SEC ID Nº 235. SEC ID Nº 239 (codificada por la SEC ID Nº: 238, de Aquilegia formosa x Aquilegia pubescens), SEC ID Nº: 241 (codificada por la SEC ID Nº: 240, de Gossypium hirsutum), SEC ID Nº: 243 (codificada por la SEC ID Nº: 242, de Ipomoea nil), SEC ID Nº 245 (codificada por la SEC ID Nº: 244, de Lactuca sativa), SEC ID Nº: 247 (codificada por la SEC ID Nº: 246, de Malus domestica), SEQ ID NO: 249 (codificada por la SEC ID Nº: 248, de Medicago truncatula), SEC ID Nº 251 (codificada por la SEC ID Nº: 250, de Nicotiana bentamiana), SEC ID Nº: 253 (codificada por la SEC ID Nº: 252, de Oryza sativa), SEC ID Nº: 255 (codificada por la SEC ID Nº: 254, de Oryza sativa), SEC ID Nº: 257 (codificada por la SEC ID Nº: 256, de Solanum tuberosum SEC ID Nº: 259 (codificada por la SEC ID Nº: 258, de Vitis vinifera), SEC ID Nº: 261 (codificada por la SEC ID Nº: 260, de Zea mays), SEC ID Nº: 263 (codificada por la SEC ID Nº: 262, de Zea mays), SEC ID Nº: 283 (codificada por la SEC ID Nº: 282,

Brassica rapa), SEC ID Nº: 285 (codificada por la SEC ID Nº: 284, Glycine max), y SEC ID Nº 287 (codificada por la SEC ID Nº: 286, Populus tremuloides) son ortólogos del polipéptido de la SEC ID Nº 235.

Los ortólogos y parálogos pueden identificarse fácilmente realizando una búsqueda BLAST denominada reciproca. Esto se puede hacer mediante un primer BLAST que implica una secuencia de consulta BLASTing (por ejemplo, SEC ID Nº 234 o SEC ID Nº 235) contra cualquier base de datos de secuencias, tal como la base de datos NCBI públicamente disponible. BLASTN o TBLASTX (utilizando valores predeterminados convencionales) pueden usarse cuando se parte de una secuencia de nucleótidos y BLASTP o TBLASTN (usando valores predeterminados convencionales) pueden usarse cuando se parte de una secuencia polipeptídica. Los resultados BLAST pueden filtrarse opcionalmente. Las secuencias de longitud completa de los resultados filtrados o los resultados no filtrados vuelven después a buscarse con BLAST (segundo BLAST) contra las secuencias del organismo del cual deriva la secuencia de consulta (donde la secuencia de consulta es la SEC ID N°: 234 o SEC ID Nº 235, por lo que el segundo BLAST se realizaría contra las secuencias de Arabidopsis). Después se comparan los resultados del primer y segundo BLAST. Se identifican un parálogo si un acierto de alta clasificación del primer BLAST es de la misma especie de la que procede la secuencia de consulta, después, un BLAST posterior da como resultado idealmente la secuencia de consulta como el mayor acuerdo (además de la misma); un ortólogo se identifica si un acierto de alta clasificación en el primer BLAST no es de la misma especie de la que procede la secuencia de consulta, y preferentemente los resultados basados en un BLAST posterior en la secuencia de consulta se encuentran entre los mayores aciertos. Los aciertos de alta clasificación son aquellos que tienen un valor E bajo. Cuanto menor es el valor E, más significativa la puntuación (o en otras palabras menor es la probabilidad de que se encuentre el acierto casualmente). El cálculo del valor E es bien conocido en la técnica. Además de los valores E, las comparaciones también se puntúan mediante el porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se refiere al número de nucleótidos (o aminoácidos) idénticos entre las dos secuencias de ácidos nucleicos (o polipéptido) comparadas sobre una longitud particular. Un ejemplo que detalla la identificación de ortólogos y parálogos se da en el Ejemplo 1. En el caso de grandes familias, puede usarse ClustalW, seguido de la generación de un árbol de unión del vecino más próximo para ayudar a visualizar el agrupamiento de los genes relacionados y para identificar los ortólogos y parálogos. En la Figura 1, los parálogos y ortólogos de los polipéptidos del factor de transcripción SPL15 se agrupan juntos.

Los polipéptidos representados por una cualquiera de la SEC ID Nº 237, SEC ID Nº 239, SEC ID Nº 241, SEC ID Nº 243, SEC ID Nº 245, SEC ID Nº 247, SEC ID Nº 249, SEC ID Nº 251, SEC ID Nº 253, SEC ID Nº 255, SEC ID Nº 257, SEC ID Nº 259, SEC ID Nº 261, SEC ID Nº 263, SEC ID Nº 283, SEC ID Nº 285, SEC ID Nº 287, U ortólogos o parálogos de cualquiera de las SEC ID Nº mencionadas anteriormente, todos comprenden un DPB de SPL que tiene, en orden creciente de preferencia, una identidad de secuencia de al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 98 % con el DBP de SPL15 representado por la SEC ID Nº: 277.

Los DBP de SPL se conocen bien en la técnica y los expertos en la materia pueden identificarlo fácilmente. Un DBP de SPL puede identificarse utilizando procedimientos para la alineación de secuencias para comparar. Los procedimientos para el alineamiento de las secuencias para comparación son incluyen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443 - -453) para encontrar el alineamiento de las dos secuencias completas que maximizan el número de emparejamientos y minimiza el número de huecos. El algoritmo BLAST (Altschul y col., (1990) J Mol Biol 215: 403 - -10) calcula el porcentaje de identidad de secuencia y desarrolla un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. El software para realizar el análisis BLAST está públicamente disponible a través del National Centre for Biotechnology Information. Los homólogos pueden identificarse fácilmente usando, por ejemplo, el algoritmo de alineamiento de secuencia múltiple ClustalW (versión 1,83) disponible en el servicio de GenomeNet en el Kyoto University Bioinformatics Center, con los parámetros de alineamiento por pares predeterminados y un procedimiento de puntuación en porcentaje. Puede realizarse una edición manual menor para optimizar el alineamiento entre los motivos conservados, como sería obvio para un experto en la técnica. La alineación mostrada en las Figuras 2 y 3 destaca el DBP del SPL en los polipéptidos del factor de transcripción SPL15. Preferentemente, los polipéptidos del factor de transcripción SPL15 útiles en los procedimientos de la invención comprenden un DPB de SPL que tiene, en orden creciente de preferencia, una identidad de secuencia de al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 98 % con el DBP de SPL representado por la SEC ID Nº: 277.

En algunos casos, los parámetros por defecto se pueden ajustar para modificar la rigurosidad de la búsqueda. Por ejemplo utilizando BLAST, el umbral de significación estadística (denominado valor “previsto”) para indicar las coincidencias contra secuencias de bases de datos se puede aumentar para mostrar coincidencias menos estrictas.

De esta manera, se pueden identificar las coincidencias cortas casi exactas. El Motivo 1 como se representa en la SEC ID N°: 276; y el Motivo 2 como se representa en la SEC ID N°: 278 ambos comprendidos en los polipéptidos del factor de transcripción SPL15 útiles en los procedimientos de la invención pueden identificarse de esta manera (Figura 3). Dentro del motivo 1 y el motivo 2 se permiten uno o más cambios conservadores en cualquier posición, y / o uno, dos o tres cambios no conservadore(s) en cualquier posición. El tripéptido W (S / T) L en el extremo C- terminal del polipéptido podrá igualmente identificarse (Figura 3).

También existen bases de datos especializadas para la Identificación de dominios, El DBD de SPL en un polipéptido de factor de transcripción SPL15 puede identificarse utilizando, por ejemplo, SMART (Schultz y col., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic y col., (2002) Nucleic Acids Res 30, 242–244; alojado por el EMBL en Heidelberg, Alemania), InterPro (Mulder y col., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315–318; alojados por EMBL en el European Bioinformatics Institute (EBI) en el Reino Unido), Prosite (Bucher y Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (En) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp53–61, AAAIPress, Menlo Park; Hulo y col., Nucl. Acids. Res. 32: D134–D137, (2004), El servidor de proteomlcs ExPASy se proporciona como servicio para la comunidad científica (alojado por el Swlss Instltute of Blolnformatlcs (SIB) en Suiza) o Pfam (Bateman y col., Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002), alojado por el Sanger Institute en el Reino Unido). El DBD de SPL en la base de datos InterPro se designa IPR004333, PF03110 en la base de datos Pfam y PS51141 en la base de datos PROSITE.

Además, la presencia de tramo rico en G / S que precede al DBD de SPL puede también identificarse fácilmente (Figura 3). La composición primaria de aminoácidos (en %) para determinar si un dominio de polipéptido es rico en aminoácidos específicos se puede calcular usando programas de software del servidor ExPASy, en particular, la herramienta ProtParam (Gasteiger E y col., (2003) ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res 31:3784 - -3788). La composición de la proteína de interés puede compararse después con la composición de aminoácidos media (en %) en el banco de datos de secuencias de proteínas Swiss- Prot. Dentro de este banco de datos, el contenido promedio de Gly (G) y Ser (E) son ambos del 6,9 % (añadiendo hasta 13,8 %). Como ejemplo, el tramo rico en G / S que precede al DBD de SPL de la SEC ID Nº 235 contiene 14,5 % de G y 25,5 % de S (añadiendo hasta 40 %). Como se define en el presente documento, una tramo rico en G/S tiene un contenido combinado de G y S (en términos de %) por encima de lo que se encuentran en la composición promedio de aminoácidos (en términos de %) de las proteínas en la base de datos de secuencias proteicas Swiss- Prot. Tanto G como S pertenecen a la categoría de aminoácidos muy pequeños.

El ácido nucleico que codifica los polipéptidos representados por una cualquiera de las SEC ID Nº 235, SEC ID Nº 237, SEC ID Nº 239, SEC ID Nº 241, SEC ID Nº 243, SEC ID Nº 245, SEC ID Nº 247, SEC ID Nº 249, SEC ID Nº 251, SEC ID Nº 253, SEC ID Nº 255, SEC ID Nº 257, SEC ID Nº 259, SEC ID Nº 261, SEC ID Nº 263, SEC ID Nº 283, SEC ID Nº 285, SEC ID Nº 287, o ortólogos o parálogos de cualquiera de SEC ID Nº mencionadas anteriormente, no necesitan ser ácidos nucleicos de longitud completa, ya que el rendimiento de los métodos de la invención no se basa en el uso de secuencias de ácido nucleico de longitud completa. Además, los ejemplos de ácidos nucleicos adecuados para su uso en la realización de los procedimientos de la invención incluyen, pero no se limitan a, los representados por una cualquiera de: SEC ID Nº 234, SEC ID Nº 236, SEC ID Nº 238, SEC ID Nº 240, SEC ID Nº 242, SEC ID Nº 244, SEC ID Nº 246, SEC ID Nº 248, SEC ID Nº 250, SEC ID Nº 252, SEC ID Nº 254, SEC ID Nº 256, SEC ID Nº 258, SEC ID Nº 260, SEC ID Nº 262, SEC ID Nº 282, SEC ID Nº 284 y la SEC ID Nº 286. Variantes de ácidos nucleicos también pueden ser útiles en la práctica de los procedimientos de la invención. Los ejemplos de tales variantes incluyen porciones de ácidos nucleicos, variantes de corte y empalme, variantes alélicas de origen natural u obtenidas por manipulación del ADN. Una porción de un ácido nucleico puede prepararse, por ejemplo, realizando una o más deleciones en el ácido nucleico que codifica un polipéptido factor de transcripción SPL15 como se ha definido anteriormente en el presente documento. Las porciones pueden usarse en forma aislada o pueden fusionarse con otras secuencias codificantes (o no codificantes) para, por ejemplo, producir una proteína que combine varias actividades. Cuando se fusiona con otras secuencias codificantes, el polipéptido resultante producido después de la traducción puede ser más grande que el esperado para la porción del factor de transcripción SPL15. Las porciones útiles en los procedimientos de la invención codifican un polipéptido del factor de transcripción SPL15 (como se ha descrito anteriormente) y tiene sustancialmente la misma actividad biológica que el polipéptido del factor de transcripción SPL15 representado por cualquiera de las SEC ID Nº: 235, SEC ID Nº 237, SEC ID Nº 239, SEC ID Nº 241, SEC ID Nº 243, SEC ID Nº 245, SEC ID Nº 247, SEC ID Nº 249, SEC ID Nº 251, SEC ID Nº 253, SEC ID Nº 255, SEC ID Nº 257, SEC ID Nº 259, SEC ID Nº 261, SEC ID Nº 263, SEC ID Nº 283, SEC ID Nº 285, SEC ID Nº 287 u ortólogos o parálogos de cualquiera de las SEC ID Nº mencionadas anteriormente. Ejemplos de porciones pueden incluir los nucleótidos que codifican el motivo 1 como se representa por la SEC ID Nº: 276; en orden creciente de preferencia, una identidad de secuencia de al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 98 % con el DBP de SPL representado por la SEC ID Nº: 277; y el Motivo 2 como se representa en la SEC ID N°: 278. Las porciones pueden incluir, además, los nucleótidos que codifican el tramo rico en G / S o el tripéptido W(S/T)L (pero no necesariamente los nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos entre cualquiera de estos). La porción tiene típicamente al menos 250 nucleótidos de longitud, preferiblemente al menos 500 nucleótidos de longitud, más preferiblemente al menos 750 nucleótidos de longitud y más preferiblemente al menos 1.000 nucleótidos de longitud. Preferentemente, la porción es una porción de un ácido nucleico como se representa por una cualquiera de la SEC ID Nº 234, SEC ID Nº 236, SEC ID Nº 238, SEC ID Nº 240, SEC ID Nº 242, SEC ID Nº 244, SEC ID Nº 246, SEC ID Nº 248, SEC ID Nº 250, SEC ID Nº 252, SEC ID Nº 254, SEC ID Nº 256, SEC ID Nº 258, SEC ID Nº 260, SEC ID Nº 262, SEC ID Nº 282, SEC ID Nº 284 y la SEC ID Nº 286. Lo más preferentemente, la porción de un ácido nucleico como se representa en la SEC ID Nº 234.

Otra variante de ácido nucleico útil en los procedimientos de la invención es un ácido nucleico capaz de hibridarse, en condiciones de rigurosidad reducida, preferentemente en condiciones rigurosas, con un ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de transcripción SPL15 como se ha definido en el presente documento anteriormente o con un porción como se ha definido en el presente documento anteriormente.

Las secuencias de hibridación útiles en los procedimientos de la invención codifican un polipéptido que comprende de N-terminal a C-terminal: (i) el Motivo 1 como se representa en la SEC ID N°: 276; y (ii) en orden creciente de preferencia, una identidad de secuencia de al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 98 % con el DBP de SPL representado por la SEC ID Nº 277; y (iii) Motivo 2 como se representa en la SEC ID N°: 278, y que tiene sustancialmente la misma actividad biológica que los polipéptidos factor de transcripción SPL15 representados por la SEC ID Nº: 235, SEC ID Nº 237, SEC ID Nº 239, SEC ID Nº 241, SEC ID Nº 243, SEC ID Nº 245, SEC ID Nº 247, SEC ID Nº 249, SEC ID Nº 251, SEC ID Nº 253, SEC ID Nº 255, SEC ID Nº 257, SEC ID Nº 259, SEC ID Nº 261, SEC ID Nº 263, SEC ID Nº 283, SEC ID Nº 285, SEC ID Nº 287 u ortólogos o parálogos de cualquiera de las SEC ID Nº mencionadas anteriormente. La secuencia de hibridación tiene típicamente al menos 250 nucleótidos de longitud, preferiblemente al menos 500 nucleótidos de longitud, más preferiblemente al menos 750 nucleótidos de longitud y más preferiblemente al menos 1.000 nucleótidos de longitud. Preferentemente, la secuencia de hibridación es una que es capaz de hibridarse con cualquiera de los ácidos nucleicos representados por la SEC ID Nº 234, SEC ID Nº 236, SEC ID Nº 238, SEC ID Nº 240, SEC ID Nº 242, SEC ID Nº 244, SEC ID Nº 246, SEC ID Nº 248, SEC ID Nº 250, SEC ID Nº 252, SEC ID Nº 254, SEC ID Nº 256, SEC ID Nº 258, SEC ID Nº 260, SEC ID Nº 262, SEC ID Nº 282, SEC ID Nº 284 y la SEC ID Nº 286, o a una porción de cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente, siendo una porción como se ha definido anteriormente. Lo más preferiblemente, la secuencia de hibridación es capaz de hibridar con la SEC ID Nº 234, o porciones de la misma.

Otra variante de ácido nucleico útil en los procedimientos de la solicitud es una variante de corte y empalme que codifica un polipéptido de factor de transcripción SPL15 como se ha definido anteriormente en el presente documento.

Las variantes de corte y empalme preferidas son variantes de corte y empalme de un ácido nucleico que codifica el polipéptido del factor de trascripción SPL15 representado por cualquiera de las SEC ID Nº 235, SEC ID Nº 237, SEC ID Nº 239, SEC ID Nº 241, SEC ID Nº 243, SEC ID Nº 245, SEC ID Nº 247, SEC ID Nº 249, SEC ID Nº 251, SEC ID Nº 253, SEC ID Nº 255, SEC ID Nº 257, SEC ID Nº 259, SEC ID Nº 261, SEC ID Nº 263, SEC ID Nº 283, SEC ID Nº 285 o SEC ID Nº: 287 o variantes de corte y empalme que codifican ortólogos o parálogos de cualquiera de las SEC ID Nº: 234, SEC ID Nº 236, SEC ID Nº 238, SEC ID Nº 240, SEC ID Nº 242, SEC ID Nº 244, SEC ID Nº 246, SEC ID Nº 248, SEC ID Nº 250, SEC ID Nº 252, SEC ID Nº 254, SEC ID Nº 256, SEC ID Nº 258, SEC ID Nº 260, SEC ID Nº 262, SEC ID Nº 282, SEC ID Nº 284 y la SEC ID Nº 286 mencionadas anteriormente. La más preferida es una variante de corte y empalme de una secuencia de ácido nucleico como se representa en la SEC ID Nº 234.

Otra variante de ácido nucleico útil en la realización de los procedimientos de la invención es una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de factor de transcripción SPL15 como se ha definido anteriormente en el presente documento.

La variante alélica puede ser una variante alélica de un ácido nucleico que codifica el polipéptido del factor de trascripción SPL15 representado por cualquiera de las SEC ID Nº: 235, SEC ID Nº 237, SEC ID Nº 239, SEC ID Nº 241, SEC ID Nº 243, SEC ID Nº 245, SEC ID Nº 247, SEC ID Nº 249, SEC ID Nº 251, SEC ID Nº 253, SEC ID Nº 255, SEC ID Nº 257, SEC ID Nº 259, SEC ID Nº 261, SEC ID Nº 263, SEC ID Nº 283, SEC ID Nº 285 o SEC ID Nº: 287, o una variante alélica de un ácido nucleico que codifica ortólogos o parálogos de cualquiera de las SEC ID Nº. Más preferidas son las variantes alélicas de los ácidos nucleicos representados por una cualquiera de las SEC ID Nº: 234, SEC ID Nº 236, SEC ID Nº 238, SEC ID Nº 240, SEC ID Nº 242, SEC ID Nº 244, SEC ID Nº 246, SEC ID Nº 248, SEC ID Nº 250, SEC ID Nº 252, SEC ID Nº 254, SEC ID Nº 256, SEC ID Nº 258, SEC ID Nº 260, SEC ID Nº 262, SEC ID Nº 282, SEC ID Nº 284 y la SEC ID Nº 286. La más preferida es una variante alélica de un ácido nucleico como se representa en la SEC ID Nº 234.

Otra variante de ácido nucleico útil en los procedimientos de la invención es una variante de ácido nucleico que se obtiene por redistribución de genes. La redistribución de genes o evolución dirigida también puede usarse para generar variantes de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos del factor de transcripción SPL15 como se ha definido anteriormente en el presente documento.

Además, también pueden obtenerse variantes de ácido nucleico por mutagénesis dirigida a sitio. Se dispone de diversos procedimientos para realizar mutagénesis dirigida a sitio; siendo los más frecuentes los procedimientos basados en PCR (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley (Eds)).

También son útiles en los procedimientos de la invención los ácidos nucleicos que codifican homólogos de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC ID Nº: 235, SEC ID Nº 237, SEC ID Nº 239, SEC ID Nº 241, SEC ID Nº 243, SEC ID Nº 245, SEC ID Nº 247, SEC ID Nº 249, SEC ID Nº 251, SEC ID Nº 253, SEC ID Nº 255, SEC ID Nº 257, SEC ID Nº 259, SEC ID Nº 261, SEC ID Nº 263, SEC ID Nº 283, SEC ID Nº 285, SEC ID Nº 287 u ortólogos o parálogos de cualquiera de las SEC ID Nº mencionadas anteriormente.

También son útiles en los procedimientos de la invención los ácidos nucleicos que codifican derivados de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC ID Nº: 235, SEC ID Nº 237, SEC ID Nº 239, SEC ID Nº 241, SEC ID Nº 243, SEC ID Nº 245, SEC ID Nº 247, SEC ID Nº 249, SEC ID Nº 251, SEC ID Nº 253, SEC ID Nº 255, SEC ID Nº 257, SEC ID Nº 259, SEC ID Nº 261, SEC ID Nº: 263, SEC ID Nº 283, SEC ID Nº 285, SEC ID Nº 287 u ortólogos o parálogos de cualquiera de las SEC ID Nº mencionadas anteriormente. “Derivados” incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, que pueden, en comparación con la secuencia de aminoácidos de forma natural de la proteína, tal como la presentada en la SEC ID Nº 235, comprender sustituciones de aminoácidos con restos de aminoácido de origen no natural, o adiciones de restos de aminoácido de origen no natural.

Además, los polipéptidos deL factor de transcripción SPL15 (al menos en su forma nativa) normalmente tienen una actividad de unión a ADN y un dominio de activación. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente la presencia de un dominio de activación y la actividad de unión a ADN utilizando herramientas y técnicas de rutina.

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos del factor de transcripción SPL15 pueden proceder de cualquier fuente natural o artificial. El ácido nucleico puede modificarse con respecto a su forma nativa en composición y/o en medio genómico a través de manipulación humana deliberada. Preferentemente el ácido nucleico que codifica el polipéptido del factor de transcripción SPL15 es de una planta, adicionalmente de manera preferente, de una planta dicotiledónea, más preferentemente de la familia Brassicaceae, aún más preferentemente el ácido nucleico es de Arabidopsis thaliana.

Por tanto, cualquier referencia en este documento a un polipéptido del factor de transcripción SPL15 se considera que significa un péptido factor de transcripción SPL15 como se ha definido anteriormente. Cualquier ácido nucleico que codifica un polipéptido tal factor de transcripción SPL15 de este tipo es adecuado para su uso en la realización de los procedimientos de la invención.

La invención también proporciona construcciones génicas y vectores para facilitar la introducción y/o expresión en una planta de las secuencias de ácido nucleico útiles en los procedimientos de acuerdo con la invención.

Por tanto, se proporciona una construcción que comprende: (i) un ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de transcripción SPL15 como se ha definido anteriormente; (ii) una o más secuencias de control unidas operablemente al ácido nucleico de (i).

Las construcciones útiles en los procedimientos de acuerdo con la presente invención se pueden construir utilizando tecnología de ADN recombinante bien conocida por las personas expertas en la técnica. Las construcciones génicas se pueden insertar en vectores, que pueden estar comercialmente disponibles, adecuados para transformar en plantas y adecuados para la expresión del gen de interés en las células transformadas. La invención también proporciona el uso de una construcción génica como se ha definido anteriormente en el presente documento en los procedimientos de la invención.

Las plantas se transforman con un vector que comprende cualquiera la secuencia de interés (es decir, un ácido nucleico que codifica un polipéptido factor de transcripción SPL15 como se define en el presente documento). El experto en la técnica conocerá los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector para transformar, seleccionar y propagar satisfactoriamente células huésped que contengan la secuencia de interés. La secuencia de interés está unida operablemente a una o más secuencias de control (al menos a un promotor). Ventajosamente, cualquier tipo de promotor, ya sea natural o sintético, puede usarse para dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos. El promotor puede ser un promotor inducible, es decir, que ha inducido o incrementado el inicio de la transcripción en respuesta a un estímulo del desarrollo, químico, ambiental o físico. El promotor puede ser un promotor específico de tejido, es decir uno que es capaz de iniciar la transcripción preferentemente en ciertos tejidos, tales como las hojas, raíces, tejido de la semilla, etc.

De acuerdo con la invención, el ácido nucleico que codifica un polipéptido factor de transcripción SPL15 está unido operablemente a un promotor constitutivo. El promotor constitutivo es preferiblemente un promotor HMGB (grupo B de movilidad alta), más preferentemente el promotor constitutivo es un promotor HMGB de arroz, más preferentemente el promotor constitutivo está representado por una secuencia de ácido nucleico sustancialmente similar a la SEC ID Nº 279, lo más preferentemente, el promotor constitutivo es como se representa mediante la SEC ID Nº 279 o SEC ID Nº 294.

Debe aclararse que la aplicabilidad de la presente invención no está limitada al ácido nucleico que codifica el polipéptido del factor de transcripción SPL15 representado por la SEC ID N°: 234, ni la aplicabilidad de la invención está limitada a la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de transcripción SPL15 cuando se está dirigido por un promotor HMGB. Ejemplos de otros promotores constitutivos que también pueden utilizarse para realizar los procedimientos de la invención se muestran en la sección de definiciones.

Los elementos reguladores adicionales para aumentar la expresión de ácidos nucleicos o genes o productos génicos pueden incluir potenciadores transcripcionales así como traduccionales. Los expertos en la técnica conocerán las secuencias terminadoras de terminación y potenciadoras que pueden ser adecuados para su uso en la realización de la invención. Otras secuencias de control (además de las secuencias promotoras, potenciadoras, silenciadoras, intrónicas, regiones 3'UTR y/o 5'UTR ) pueden ser elementos estabilizadores de proteína y/o ARN. Tales secuencias serían conocidas o pueden obtenerlas fácilmente un experto en la técnica. Opcionalmente, una o más secuencias terminadoras (también una secuencia control) se pueden utilizar en la construcción introducida en una planta.

También puede añadirse una secuencia intrónica a la región no traducida en 5’ (UTR) o la secuencia codificante de la secuencia de codificación parcial para aumentar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol.

Las construcciones genéticas de la invención pueden incluir además una secuencia del origen de secuencia de replicación que se requiere para el mantenimiento y / o replicación en un tipo celular específico. Un ejemplo es cuando se requiere mantener una construcción genética para en una célula bacteriana como un elemento genético episomal (por ejemplo, una molécula de plásmido o de cósmido). Los orígenes preferidos de replicación incluyen, entre otros, el f1–ori y colE1.

La construcción genética puede comprender opcionalmente un gen marcador seleccionable.

Por tanto, la invención proporciona un procedimiento para la producción de plantas transgénicas que tienen rendimiento de semillas y/o de biomasa aérea aumentado con respecto a las plantas de control, que comprende introducir y expresar en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido de factor de transcripción SPL15 como se ha definido anteriormente en el presente documento.

Más específicamente, la presente invención proporciona un procedimiento para la producción de plantas transgénicas que tienen mayor rendimiento de semillas y/o de biomasa aérea con respecto a las plantas control, en el que el procedimiento comprende: i) introducir y expresar en una célula de planta un ácido nucleico que codifica polipéptido de factor de transcripción SPL15; y (ii) cultivar la célula vegetal en condiciones que estimulan el crecimiento y desarrollo de la planta.

El ácido nucleico puede introducirse directamente en una célula de planta o en la propia planta (incluyendo la introducción en un tejido, órgano o en cualquier otra parte de una planta). De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, el ácido nucleico se introduce preferentemente en una planta por transformación.

Generalmente después de la transformación, se seleccionan células vegetales o agrupaciones de células para determinar la presencia de uno o más marcadores que están codificados por genes expresables en plantas cotransferidos con el gen de interés, tras lo cual el material transformado se regenera en una planta entera.

Después de la transferencia de ADN y la regeneración, las plantas transformadas putativamente se pueden evaluar, por ejemplo utilizando análisis de tipo Southern, para detectar la presencia del gen de interés, el número de copias y / o la organización genómica. Alternativamente o adicionalmente, los niveles de expresión del ADN recién introducido pueden controlarse utilizando análisis de tipo Northern y/o Western, o PCR cuantitativa, siendo todas las técnicas bien conocidas por los expertos habituales en la técnica.

Las plantas transformadas generadas se pueden propagar mediante diversos medios, tales como por propagación clonal o técnicas de reproducción clásicas. Por ejemplo, una primera generación (o T1) de planta transformada puede autofecundarse para dar transformantes de la segunda generación homocigota (o T2) y las plantas T2 se propagan adicionalmente a través de técnicas clásicas de reproducción.

Los organismos transformados generados pueden adoptar diversas formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y de células no transformadas; transformantes clonales (por ejemplo, todas las células transformadas que contengan el casete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, una planta madre transformada injertada a un vástago no transformado).

La presente invención se extiende claramente a cualquier célula vegetal o planta producida mediante cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, y a todas las partes de plantas y propágulos de las mismas. La presente invención se extiende además se para incluir la progenie de una célula, tejido u órgano primario transformado o transfectado o la planta completa que se ha producido mediante cualquiera de los procedimientos anteriormente mencionados, siendo el único requisito que la progenie presente las mismas características genotípicas y/o fenotípicas que las producidas por el precursor en los procedimientos de acuerdo con la memoria descriptiva.

La invención también incluye células huésped que contienen un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido factor de transcripción SPL15 como se ha definido anteriormente en el presente documento. Las células huésped preferidas de acuerdo con la invención son células vegetales.

La invención también se extienden a partes cosechables de una planta, tales como, pero sin limitación, semillas, hojas, frutos, flores, tallos, raíces, rizomas, tubérculos y bulbos. La invención adicionalmente se refiere a productos derivados, preferentemente derivados directamente, de una parte cosechable de dicha planta, tales como gránulos secos o polvos, aceite, grasa y ácidos grasos, almidón o proteínas.

Como se ha mencionado anteriormente, un procedimiento preferido para aumentar la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido factor de transcripción SPL15 es introduciendo y expresando en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido factor de transcripción SPL15 ; sin embargo, también pueden obtenerse los efectos de la realización del procedimiento, es decir aumentar el rendimiento de semillas y/o la biomasa aérea, usando otras técnicas bien conocidas. A continuación se proporciona una descripción de estas técnicas.

Una de estas técnicas es el marcaje en activación de ADN-T. Las plantas transgénicas resultantes muestran fenotipos dominantes debido a la expresión modificada de los genes cercanos al promotor introducido.

Los efectos de la invención también pueden reproducirse usando la técnica de TILLING (Targeted Induced Local Lesions In Genomes).

Los efectos de la invención también pueden reproducirse usando recombinación homologa.

“Rendimiento aumentado” como se define en el presente documento se considera que significa un aumento en la biomasa (peso) de una o más partes de una planta, que puede incluir partes sobre la superficie (cosechables) y/o partes (cosechables) por debajo de la superficie.

En particular, dichas partes cosechables incluyen la biomasa vegetativa y / o las semillas y la realización de los procedimientos de la invención da como resultado plantas que tienen rendimiento aumentado (en la biomasa vegetativa y / o las semillas) con respecto al rendimiento de las plantas control.

Tomando el maíz como un ejemplo, un aumento en el rendimiento puede manifestarse como uno o más de los siguientes: aumento en el número de plantas establecido por hectárea o acre, un aumento en el número de espigas por planta, un aumento en el número de filas, número de granos por fila, peso de grano, peso de mil granos, longitud/diámetro de espiga, aumento en la tasa de llenado de semilla (que es el número de semillas llenas dividido entre el número total de semillas y multiplicado por 100), entre otros. Tomando el arroz como un ejemplo, un aumento en el rendimiento puede manifestarse como un aumento en uno o más de los siguientes: número de plantas por hectárea o acre, número de panículas por planta, número de espiguillas por panícula, número de flores (floretes) por panícula (que se expresa como una proporción del número de semillas llenas dividido entre el número de panículas primarias), aumento en la tasa de llenado de semilla (que es el número de semillas llenas dividido entre el número total de semillas y multiplicado por 100), aumento en peso de mil granos, entre otros.

Dado que las plantas transgénicas de acuerdo con la presente invención tienen un rendimiento de semillas y/o biomasa aérea aumentado, es probable que estas plantas presenten una tasa de crecimiento aumentada (durante al menos parte de su ciclo de vida), con respecto a la tasa de crecimiento de las correspondientes plantas de tipo silvestre en una etapa correspondiente en su ciclo de vida. La tasa de crecimiento aumentada puede ser específica de una o más partes de una planta (incluyendo semillas) o puede ser sustancialmente en toda la planta. Una planta que tiene una tasa de crecimiento aumentada puede incluso exhibir una floración temprana. El aumento en la tasa de crecimiento puede alterar el ciclo de la cosecha de una planta, lo que permite que las plantas se siembren más tarde y/o se cosechen más pronto de lo que de otra manera sería posible. Si la tasa de crecimiento se aumenta suficientemente, puede permitir la siembra adicional de semillas de la misma especie de la planta (por ejemplo siembra y cosecha de plantas de arroz, seguido de siembra y cosecha de plantas de arroz adicionales todas dentro de un periodo de crecimiento convencional). De manera similar, si la tasa de crecimiento se aumenta suficientemente, puede permitir la siembra adicional de semillas de diferentes especies de plantas (por ejemplo, la siembra y cosecha de plantas de maíz seguidas de, por ejemplo, la siembra y cosecha opcional de plantas de soja, patata o cualquier otra planta adecuada). Los tiempos de cosecha adicionales del mismo rizoma en el caso de algunas plantas de cultivo también pueden ser posible. Alterar el ciclo de cosecha de una planta puede conducir a un aumento en la producción de biomasa anual por acre (debido a un aumento en el número de tiempos (digamos en un año) que se puede cultivar y cosechar cualquier planta particular). Un aumento en la tasa de crecimiento también puede permitir el cultivo de plantas transgénicas en un área geográfica más amplia que sus homólogos de tipo silvestre, debido a que las limitaciones territoriales para cosechar un cultivo a menudo se determinan por condiciones ambientales adversas en el momento de plantar (estación temprana) o en el momento de la recolección (estación tardía). Dichas condiciones adversas pueden evitarse si se acorta el ciclo de cosecha. La tasa de crecimiento puede determinarse derivando diversos parámetros a partir de las curvas de crecimiento, dichos parámetros pueden ser: T-Medio (el tiempo que tarda una planta en alcanzar el 50 % de su tamaño máximo) y T-90 (el tiempo que tarda una planta en alcanzar el 90 % de su tamaño de máximo), entre otros.

En el presente documento se describe un procedimiento para incrementar la tasa de crecimiento de las plantas, cuyo procedimiento comprende incrementar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido factor de transcripción SPL15.

Un aumento en el rendimiento de semillas y/o la biomasa aérea y/o en la tasa de crecimiento se produce cuando la planta está en condiciones de cero estrés o cuando la planta está expuesta a diversos tipos de estrés en comparación con las plantas de control. Típicamente las plantas responden a exposición frente al estrés creciendo más lentamente. En condiciones de estrés intenso, la planta puede incluso detener por completo el crecimiento. Por otro lado, estrés leve se define en el presente documento como cualquier estrés al que se expone una planta que no da como resultado el cese total del crecimiento de la planta sin la capacidad de reanudar el crecimiento. El estrés leve, en el sentido de la invención, conduce a una reducción en el crecimiento de la planta sometida a estrés de menos de 40 %, 35 % o 30 %, preferentemente menos del 25 %, 20 % o 15 %, más preferentemente menos del 14 %, 13 %, 12 %, 11 % o 10% o menos en comparación con la planta de control en condiciones de estrés cero. Debido a los avances en las prácticas agrícolas (riego, fertilización, tratamientos con pesticidas), las formas de estrés intenso no se encuentran frecuentemente en plantas cultivadas. Como una consecuencia, el crecimiento comprometido inducido por estrés leve es a menudo una característica indeseable para la agricultura. El estrés leve es un estrés biótico y/o abiótico diario (ambiental) al cual está expuesto la planta. El estrés abiótico puede deberse a sequía o a exceso de agua, a estrés anaeróbico, estrés salino, toxicidad química, estrés oxidativo y a temperaturas altas, frías o heladas. El estrés abiótico puede ser un estrés osmótico provocado por estrés al agua (particularmente debido a sequía), estrés salino, estrés oxidativo y estrés iónico. El estrés biótico es típicamente aquel estrés provocado por patógenos, tales como bacterias, virus, hongos, e insectos.

En particular, los procedimientos descritos en el presente documento pueden realizarse en condiciones de cero estrés o en condiciones de sequía leve para dar plantas que tienen un rendimiento de semillas y/o biomasa aérea aumentado con relación a plantas de control. Como describen Wang y col., (Planta (2003) 218: 1–14), el estrés abiótico conduce a una serie de cambios morfológicos, fisiológicos, bioquímicos y moleculares que afectan adversamente al crecimiento de las plantas y a su productividad. Se sabe que la sequía, la salinidad, las temperaturas extremas y el estrés oxidativo se interconectan y que pueden inducir daño celular y en el crecimiento a través de mecanismos similares. Rabbani y col., (Plant Physiol (2003) 133: 1755–1767) describen un grado particularmente alto de “interferencia” entre estrés por sequía y estrés por alta salinidad. Por ejemplo, la sequía y/o salinización se manifiestan principalmente como estrés osmótico, que produce la interrupción de la homeostasis y la distribución de iones en la célula. El estrés oxidativo, que frecuentemente acompañada a estrés por temperaturas altas o bajas, por salinidad o por sequía, puede producir desnaturalización de las proteínas funcionales y estructurales. Como una consecuencia, este diverso estrés ambiental a menudo activa rutas de señalización celular y respuestas celulares similares, tales como la producción de proteínas de estrés, regulación por aumento de antioxidantes, acumulación de solutos compatibles y paralización del crecimiento. La expresión en condiciones de “estrés cero” como se usa en el presente documento son las condiciones ambientales que permiten el crecimiento de las plantas. Los expertos en la técnica saben cuáles son las condiciones normales en el suelo y las condiciones climáticas en una localización determinada.

La realización de los procedimientos de la invención da lugar a plantas cultivadas en condiciones de cero estrés o en condiciones de sequía leve de rendimiento de semillas y/o biomasa aérea aumentado con respecto a plantas de control que crecen en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento para aumentar el rendimiento de semillas y/o biomasa aérea en plantas que crecen en condiciones de cero estrés o en condiciones de sequía leve, cuyo procedimiento comprende aumentar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SPL15.

La realización de los procedimientos de la invención da lugar a plantas cultivadas en condiciones de déficit de nutrientes, particularmente en condiciones de déficit de nitrógeno, rendimiento de semillas y/o biomasa aérea aumentado con respecto a plantas de control que crecen en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento para aumentar el rendimiento de semillas y/o biomasa aérea en plantas que crecen en condiciones de condiciones de déficit de nutrientes, cuyo procedimiento comprende aumentar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SPL15. El déficit de nutrientes puede producirse por una carencia o un exceso de nutrientes tales como nitrógeno, fosfatos y otros compuestos que contienen fósforo, potasio, calcio, cadmio, magnesio, manganeso, hierro y boro entre otros.

Los procedimientos de la invención son ventajosamente aplicables a cualquier planta. Las plantas que son particularmente útiles en los procedimientos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas incluyendo forraje o leguminosas forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles o arbustos. De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, la planta es una planta de cultivo. Los ejemplos de plantas de cultivo incluyen soja, girasol, canola, alfalfa, colza, algodón, tomate, patata y tabaco. Adicionalmente de modo preferente, la planta es una planta monocotiledónea. Ejemplos de plantas monocotiledóneas incluyen caña de azúcar. Más preferentemente la planta es un cereal. Los ejemplos de cereales incluyen arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo y avena.

La presente invención también abarca plantas que pueden obtenerse mediante los procedimientos de acuerdo con la presente invención. Por consiguiente, la presente invención proporciona plantas, partes y células de dichas plantas obtenibles por los procedimientos de acuerdo con la presente invención, en los que las plantas o partes o células comprenden un transgén de ácido nucleico que codifica un polipéptido factor de transcripción SPL15 como se ha definido anteriormente.

La presente invención también abarca el uso de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de factor de transcripción SPL15 en el aumento de rendimiento de semillas y / o la biomasa aérea en una planta en comparación con el rendimiento de semillas y / o biomasa aérea en una planta de control.

En particular, el rendimiento de semillas puede incluir uno o más de los siguientes: aumento del número de flores por panícula, aumento del peso total de las semillas, aumento del número total de semillas, aumento del número de semillas (llenas), aumento en peso de mil granos (PMG) y aumento del índice de recolección.

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos del factor de transcripción SPL15 pueden encontrar uso en programas de reproducción en el que se identifica un marcador de ADN que puede estar genéticamente unido a un gen que codifica el polipéptido factor de transcripción SPL15. Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos factor de transcripción SPL15 pueden usarse para definir un marcador molecular. Este marcador de puede después usarse en programas de reproducción para seleccionar plantas que un rendimiento de semillas aumentado. Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos factor de transcripción SPL15 pueden ser, por ejemplo, un ácido nucleico como se representado por una cualquiera de las SEC ID Nº: 234, SEC ID Nº 236, SEC ID Nº 238, SEC ID Nº 240, SEC ID Nº 242, SEC ID Nº 244, SEC ID Nº 246, SEC ID Nº 248, SEC ID Nº 250, SEC ID Nº 252, SEC ID Nº 254, SEC ID Nº 256, SEC ID Nº 258, SEC ID Nº 260, SEC ID Nº 262, SEC ID Nº 282, SEC ID Nº 284 y la SEC ID Nº 286.

Las variantes alélicas de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de factor de transcripción SPL15 también pueden encontrar uso en programas de reproducción asistida mediante marcador. Dichos programas de reproducción a veces requieren la introducción de variación alélica por tratamiento mutagénico de las plantas, usando, por ejemplo, mutagénesis con EMS; como alternativa, el programa puede comenzar con una colección de variantes alélicas de origen denominado “natural” producida involuntariamente. A continuación, la identificación de variantes alélicas se realiza, por ejemplo, por PCR. A esto le sigue una etapa de selección de variantes alélicas superiores de la secuencia en cuestión y que dará un rendimiento de semillas aumentado. La selección se realiza típicamente supervisando el rendimiento del crecimiento de las plantas que contienen diferentes variantes alélicas de la secuencia en cuestión, por ejemplo variantes alélicas de una cualquiera de las SEC ID Nº: 234, SEC ID Nº 236, SEC ID Nº 238, SEC ID Nº 240, SEC ID Nº 242, SEC ID Nº 244, SEC ID Nº 246, SEC ID Nº 248, SEC ID Nº 250, SEC ID Nº 252, SEC ID Nº 254, SEC ID Nº 256, SEC ID Nº 258, SEC ID Nº 260, SEC ID Nº 262, SEC ID Nº 282, SEC ID Nº 284 y la SEC ID Nº 286. El rendimiento del crecimiento puede supervisarse en un invernadero o en el campo. Etapas opcionales adicionales incluyen cruzamiento de plantas, en el que se identifica la variante alélica superior, con otra planta. Esto podría usarse, por ejemplo, para realizar una combinación de características fenotípicas interesantes.

Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos del factor de transcripción SPL15 también pueden usarse como una sonda para mapear, genética y físicamente, genes que forman parte de, y como marcadores para rasgos ligados a estos genes. Dicha información puede ser útil en reproducción de plantas para desarrollar líneas con fenotipos deseados. Dicho uso de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos del factor de transcripción SPL15 requiere solo una secuencia de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos del factor de transcripción SPL15 pueden usarse como marcadores de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (PLFR). Las transferencias Southern (Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laborator y Manual) del ADN genómico de planta digerido con enzimas de restricción se pueden sondar con las secuencias de ácido nucleico del polipéptido del factor de transcripción SPL15. Los patrones de banda resultantes pueden después someterse a análisis genético usando programas informáticos tales como MapMaker (Lander y col., (1987) Genomics 1: 174–181) para construir un mapa genético. Además, el ácido nucleico puede usarse para sondar las transferencias de Southern que contienen ADN genómicos tratados con endonucleasas de restricción de un conjunto de individuos que representan a los padres y a la progenie de un cruce genético definido. La segregación de los polimorfismos de ADN se observa y se usa para calcular la posición del ácido nucleico codifica el polipéptido del factor de transcripción SPL15 en el mapa genético previamente obtenido usando esta población (Botstein y col., (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).

La producción y el uso de sondas derivadas de genes de plantas para su uso en mapeo genético se describen en Bernatzky y Tanksley (GENETICS 112 (4): 887–898, 1986). Numerosas publicaciones describen el mapeo genético de clones de ADNc específicos utilizando la metodología indicada anteriormente o variaciones de la misma. Por ejemplo, para el mapeo pueden utilizarse poblaciones de intercruzamiento F2, poblaciones de retrocruzamiento, poblaciones apareadas al azar, líneas isogénicas cercanas (LIC) y otros grupos de individuos. Dichas metodologías son bien conocidas por los expertos en la técnica.

Las sondas de ácido nucleico también pueden usarse para mapeo físico (es decir, colocación de secuencias en mapas físicos; véase Hoheisel y col., En: Non–mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, pp. 319–346 y referencias citadas en la misma).

En otra realización, las sondas de ácido nucleico pueden usarse en la hibridación in situ con fluorescencia (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7:149–154). Aunque los procedimientos actuales de mapeo con FISH favorecen el uso de clones grandes (de varios kb a varios cientos de kb; véase Laan y col., (1995) Genome Res. 5:13–20), mejoras en sensibilidad pueden permitir la realización de mapeo FISH usando sondas más cortas.

Usando los ácidos nucleicos pueden realizarse diversos procedimientos basados en amplificación de ácidos nucleicos para el mapeo genético y físico. Ejemplos incluyen amplificación específica de alelo (Kazazian (1989) J.

Lab. Clin. Med 11:95 - -96), polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield y col., (1993) Genomics 16:325 - -332), ligamiento específico de alelo (Landegren y col., (1988) Science 241:1077 - -1080), reacciones de extensión de nucleótidos (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18:3671), Mapeo Híbrido por Radiación (Walter y col., (1997) Nat. Genet. 7:22 - -28) y Mapeo Happy (Dear y Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17:6795–6807). Para estos procedimientos, se utiliza la secuencia de un ácido nucleico para diseñar y producir pares de cebadores para su uso en la reacción de amplificación o en reacciones de extensión con cebador. El diseño de dichos cebadores es bien conocido por los expertos en la técnica. En los procedimientos que emplean mapeo genético basado en PCR puede ser necesario identificar diferencias de secuencias de ADN entre los padres del cruce del mapeo en la región correspondiente a la secuencia de ácido nucleico instantánea. Sin embargo, generalmente esto no es necesario para procedimientos de mapeo.

Los procedimientos de acuerdo con la presente invención dan como resultado plantas que tienen rendimiento de semillas y/o biomasa aérea aumentado como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Estos rasgos también pueden combinarse con otros rasgos económicamente ventajosos, tales como rasgos de rendimiento aumentado, que, tolerancia a estrés abiótico y biótico, rasgos que modifican diversas características arquitectónicas y/o características bioquímicas y/o fisiológicas.

Descripción de las figuras

La presente invención se describirá ahora con referencia a las siguientes figuras en las que:

Fig. 1 árbol de unión de vecinos tras una alineación de secuencia múltiple de todos los polipéptidos del factor de transcripción de SPL de Arabidopsis thaliana y ortólogos del polipéptido del factor de transcripción de SPL15 usando CLUSTAL W (1.83) (en el GenomeNet service en la Kyoto University Bioinformatics Center), y parámetros predeterminados (Blosum 62 como matriz de ponderación, penalización por abertura de hueco de 10; penalización por extensión hueco de 0,05). Grupos polipéptidos factor de transcripción SPL15 de Arabidopsis thaliana con los otros ortólogos y parálogos de los polipéptidos factor de transcripción SPL15, como se muestra por el soporte rizado.

La Fig. 2 muestra un alineamiento del dominio de unión al ADN (DBD) de ortólogos y parálogos del polipéptido del factor de transcripción SPL15. Las secuencias se alinearon utilizando el programa AlignX de Vector NTI suite (InforMax, Bethesda, MD). El alineamiento múltiple se llevó a cabo con una penalización de apertura de hueco de 10 y una extensión de hueco de 0,01. Los restos de Cys e His conservados involucrados en la unión de los iones de cinc están en recuadros. La señal de localización nuclear bipartita (NLS) está subrayada.

La Fig. 3 es una alineación de los ortólogos y parálogos de polipéptidos del factor de transcripción SPL15. Las secuencias se alinearon utilizando el programa AlignX de Vector NTI suite (InforMax, Bethesda, MD). Se realizó alineación múltiple con una penalización por apertura de hueco de 10 y, una extensión de hueco de 0,01. También se realizó una edición manual menor cuando fue necesario para colocar mejor algunas regiones conservadas. Los tres principales dominios caracterizados, desde N-terminal a C-terminal, están recuadros y se identificaron como Motivo 1, el dominio de unión de ADN de SPL y Motivo 2. Además, el tramo rico en G / S que precede al DBP de SPL está marcado con Xs y el tripéptido W (S / T) L en el extremo C-terminal del polipéptido también en recuadros.

La Fig. 4 muestra un vector binario pHMGB :: SPL15, para el aumento de la expresión en Oryza sativa de un ácido nucleico de Arabidopsis thaliana que codifica un polipéptido factor de transcripción SPL15 bajo el control de un promotor de HMGB.

La Fig. 5 Detalla ejemplos de secuencias útiles en la realización de los procedimientos de acuerdo con la presente invención

Ejemplos

La presente invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos, que son solo a modo ilustrativo. Los siguientes ejemplos no pretenden definir completamente o de otra manera limitar el ámbito de la invención.

Manipulación de ADN: a menos que se indique lo contrario, las técnicas de ADN recombinante se realizan de acuerdo con protocolos estándar descritos en (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ª edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel y col., (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Materiales y procedimientos estándar para el trabajo molecular en plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfase (1993) deR.D.D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications (Reino Unido).

Ejemplo 1: Identificación de secuencias relacionadas con la secuencia de ácido nucleico usada en los procedimientos de la invención

Las secuencias (ADNc de longitud completa, EST o genómicas) relacionadas con la secuencia de ácido nucleico usadas en los procedimientos de la presente invención se identificaron entre las conservadas en la base de datos de nucleótidos Entrez en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) utilizando las herramientas de búsqueda de secuencia de bases de datos, tal como la Herramienta de Alineamiento Local Básica (BLAST) (Altschul y col., (1990) J. Mol. Biol. 215:403–410; y Altschul y col., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389–3402). El programa se utiliza para encontrar regiones de similitud local entre las secuencias comparando las secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos con las bases de datos de secuencia y calculando el significado estadístico de los emparejamientos. El polipéptido codificado por el ácido nucleico usado en la presente invención se usó para el algoritmo TBLASTN, con configuraciones predeterminadas y el filtro para ignorar la activación de secuencias de baja complejidad. El resultado de los análisis se observó por comparación apareadas y se clasificó de acuerdo con la puntuación de probabilidad (valor E), en el que la puntuación refleja la probabilidad de que se produzca un alineamiento particular por casualidad (cuanto menor sea el valor E, más significativa es la coincidencia). Además de valores E, también se puntuaron las comparaciones por porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se refiere al número de nucleótidos (o aminoácidos) idénticos entre las dos secuencias de ácidos nucleicos (o polipéptido) comparadas sobre una longitud particular. En algunos casos, los parámetros por defecto se pueden ajustar para modificar la rigurosidad de la búsqueda.

La Tabla N a continuación proporciona una lista de secuencias de ácidos nucleicos relacionadas con la secuencia de ácido nucleico usada en los procedimientos de la presente invención.

Tabla N: secuencias de ácido nucleico relacionadas con la secuencia de ácido nucleico (SEC ID Nº 234) utilizada en los procedimientos de la presente invención, y los correspondientes polipéptidos deducidos

Nombre

SEC ID Nº de SEC ID Nº Longitud de Número de acceso en Organismo fuente ácido nucleico del

secuencia

NCBI

polipéptido

Arath_SPL15 234 235 Longitud NM_115654.1

Arabidopsis thaliana

(At3g57920) completa Arath_SPL9 236 237 Longitud AY150378

Arabidopsis thaliana

(At2g42200) completa Aquf0_SPL 238 239 Longitud Contiguo de DR915312 Aquilegia formosa x

completa DR949057.1

Aquilegia pubescens

Goshi_SPL 240 241 Longitud DT566400

Gossypium hirsutum

completa Iponi_SPL 242 243 Longitud Contiguo de

Ipomoea nil

completa BJ576204.1 BJ556115 BJ567301 Lacsa_SPL 244 245 Longitud Contiguo de DY966949 Lactuca sativa

completa DW119178 Maldo_SPL 246 247 Longitud Contiguo de

Malus domestica

completa CN891102.1 CO868185.1 CV523507 Medtr_SPL 248 249 Longitud de corte y empalme de

Medicago truncatula

completa AC170989.2 Nicbe_SPL 250 251 Longitud Contiguo de

Nicotiana bentamiana

completa CK284078.1 CK294165 Orysa_SPL 252 253 Longitud XM_483285

Oryza sativa

completa Orysa_SPL II 254 255 Longitud de corte y empalme de Oryza sativa

completa AC108762 Soltu_SPL 256 257 Longitud contiguo de

Solanum tuberosum

completa CK246692.1

Nombre

SEC ID Nº de SEC ID Nº Longitud de Número de acceso en Organismo fuente ácido nucleico del

secuencia

NCBI

polipéptido

CK254420.1 Vitvi_SPL 258 259 Longitud contiguo de CV098277 Vitis vinifera

completa CV092812.1 Zeama_SPL 260 261 Longitud contiguo de EB160653 Zea mays

completa DY235599 DV029129 Zeama_SPL II 262 263 Longitud contiguo de AJ011619 Zea mays

completa DV033513.1 DY532686.1 Sorpr_SPL 264 265 Parcial BF422188

Sorghum propinquium

Allce_SPL 266 267 Parcial CF444518.1

Allium cepa

Antma_SPL 268 269 Parcial AMA011623

Antirrhinum majus

Brana_SPL 270 271 Parcial CX189447

Brassica napus

Sacof_SPL 272 273 Parcial contiguo de CA113070 Saccharum CA254724

officinarum

Fesar_SPL 274 275 Parcial DT706587.1

Festuca arundinacea

Brara_SPL 282 283 Longitud AC189445.1 Brassica rapa completa Glyma_SPL 284 285 Longitud CX708501.1 Glycine max completa BG651519.1 Poptr_SPL 286 287 Longitud scaff_XVI.416 Populus tremuloides completa Citcl_SPL 288 289 Parcial DY293795 Citrus clementina Betvu_SPL 290 291 Parcial BQ594361.1 Beta vulgaris Hevbr_SPL 292 293 Parcial EC604947 Hevea brasiliensis

Ejemplo 2: Determinación de la similitud y la identidad global entre los factores de transcripción SPL15 y su DBP de SPL

Los porcentajes de similitud e identidad globales entre los factores de transcripción SPL15 se determinaron usando uno de los procedimientos disponibles en la técnica, el programa informático MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) (BMC Bioinformatics. 2003 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; software de Ledion Bitincka). El software MatGAT genera matrices de similitud / identidad de secuencias de ADN o de proteína sin necesidad de pre-alineación de los datos. El programa realiza una serie de alineaciones apareadas utilizando el algoritmo de alineación global de Myers y Miller (con una penalización por apertura de hueco de 12, y una penalización de extensión de hueco de 2), calcula la similitud y la identidad utilizando, por ejemplo Blosum 62 (para los polipéptidos), y luego coloca los resultados en una matriz de distancia. La similitud de secuencia se muestra en la mitad inferior de la línea divisoria y la identidad de secuencia se muestra en la mitad superior de la línea divisoria diagonal. La secuencia de la SEC ID Nº: 235 se indica como el número 5 en la matriz.

Los parámetros utilizados en la comparación fueron: Matriz de puntuación: Blosum62 Primer hueco: 12 Extensión de hueco: 2 Los resultados del análisis Informático se muestran en la Tabla O para la similitud e Identidad globales sobre la longitud completa de los polipéptidos del factor de transcripción SPL15. El porcentaje de identidad se proporciona encima de la diagonal y el porcentaje de similitud se proporciona por debajo de la diagonal. El porcentaje de identidad los parálogos y ortólogos del factor de transcripción SPL15 varía entre 30 y 70 %, reflejando la conservación de identidad de secuencia relativamente baja entre ellos fuera del DBD del SPL.

Los resultados del análisis Informático se muestran en la Tabla P para la similitud e Identidad globales sobre el DBD del SPL de los polipéptidos del factor de transcripción SPL15. El porcentaje de identidad se proporciona encima de la diagonal y el porcentaje de similitud se proporciona por debajo de la diagonal. El porcentaje de identidad entre los parálogos y ortólogos del DBD de SPL del factor de transcripción de SPL15 oscila entre el 70 % y el 100 %.

Ejemplo 3: Clonación de la secuencia de ácido nucleico usada en los procedimientos de la invención

Manipulación de ADN: a menos que se indique lo contrario, las técnicas de ADN recombinante se realizan de acuerdo con protocolos estándar descritos en (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ª edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel y col., (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Materiales y procedimientos estándar para el trabajo molecular en plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfase (1993) deR.D.D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications (Reino Unido).

La secuencia de ácido nucleico usada en los procedimientos de la invención se amplificó por PCR usando como molde una biblioteca de ADNc de plántulas de Arabidopsis thaliana hecha a medida (en pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, RU). La PCR se realizó usando la Taq ADN polimerasa Hifi en condiciones estándar, usando 200 ng de molde en una mezcla PCR de 50 pl. Los cebadores utilizados fueron prm07277 (SEC ID Nº: 280; sentido, codón de iniciación en negrita, sitio AttB1 en minúsculas: 5'–

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaATGGAGTTGTTAATGTGTTCG 3') y prm07278 (SEC ID Nº: 281; inverso, complementario, sitio AttB2 en minúsculas: 5' ggggaccactttgtacaagaaagctgggtTGATGAAGATCTTAAAAGGTGA 3'), que incluyen los sitios AttB para recombinación Gateway. El fragmento de PCR amplificado se purificó también usando procedimientos convencionales. Después, se realizó la primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP, durante la cual el fragmento de PCR se recombina in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología Gateway, un “clon de entrada”, pSPL15. El plásmido pDONR201 se adquirió en Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.

Ejemplo 4: Construcción del vector de expresión

El clon de entrada p13075 se usó posteriormente en una reacción LR con p06659, un vector destinatario utilizado para la transformación de Oryza sativa. Este vector contiene como elementos funcionales dentro de los límites de ADN-T: un marcador de selección de plantas; un casete de expresión marcador detectable; y un casete Gateway diseñado para recombinación LR in vivo con la secuencia de ácido nucleico de interés ya clonada en el clon de entrada. Un promotor HMGB de arroz (SEC ID Nº 294) para la expresión específica se localizó cadena arriba de este casete Gateway. Una construcción similar se fabricó con la secuencia de codificación de SPL15 bajo el control del promotor GOS2 constitutivo (SEC ID Nº: 295).

Después de la etapa de recombinación LR, los vectores de expresión resultantes pHMGB::SPL15 (Figura 4), o pGOS2::SPL15, (Figura 5) se transformaron en la cepa LBA4044 de Agrobacterium y posteriormente en las plantas de Oryza sativa.

Ejemplo 5: Transformación de plantas

Transformación de arroz El Agrobacterium que contenía el vector de expresión se usó para transformar plantas de Oryza sativa. Semillas secas maduras de la variedad de cultivo japonesa de arroz Nipponbare se descascarillaron. La esterilización se realizó incubando durante un minuto en etanol al 70 %, seguido de 30 minutos en HgCl2 al 0,2 %, seguido de un lavado de 6 veces durante 15 minutos con agua destilada estéril. Las semillas estériles germinaron después en un medio que contenía 2,4–D (medio de inducción de callo). Después de la incubación en la oscuridad durante cuatro semanas, los callos embriogénicos derivados de escutelo se cortaron y se propagaron en el mismo medio. Después de dos semanas, los callos se multiplicaron o se propagaron mediante subcultivo en el mismo medio durante otras 2 semanas. Piezas de callos embriogénico se subcultivaron en medio reciente 3 días antes de cocultivo (para reforzar la actividad de la división celular).

La cepa LBA4404 de Agrobacterium que contenía el vector de expresión se utilizó para el cocultivo. Se inoculó Agrobacterium en medio AB con los antibióticos apropiados y se cultivó durante 3 días a 28 ºC. Después las bacterias se recogieron y se suspendieron en medio de cocultivo líquido a una densidad (DO600) de aproximadamente 1. Después, la suspensión se transfirió a una placa de Petri y los callos se sumergieron en la suspensión durante 15 minutos. A continuación, los tejidos de callo se secaron por transferencia a un papel de filtro y se transfirieron a medio de cocultivo solidificado y se incubaron durante 3 días en la oscuridad a 25 ºC. Los callos cocultivados crecieron sobre un medio que contenía 2,4–D durante 4 semanas en la oscuridad a 28 ºC en presencia de un agente de selección. Durante este periodo, rápidamente se desarrollaron islas de callos resistentes a crecimiento. Después de la transferencia de este material a un medio de regeneración e incubación a la luz, el potencial embriogénico se liberó y se desarrollaron brotes las siguientes cuatro a cinco semanas. Los brotes se extirparon de los callos y se incubaron durante 2 a 3 semanas en un medio que contenía auxina desde el cual se transfirieron al suelo. Los brotes endurecidos se cultivaron a alta humedad y días cortos en un invernadero.

Se generaron aproximadamente 35 transformantes de arroz T0 independientes para una construcción. Los transformantes primarios se transfirieron desde una cámara de cultivo tisular a un invernadero. Después de un análisis PCR cuantitativo para verificar el número de copias del inserto de ADN-T, solo una única copia de plantas transgénicas que presentaban tolerancia al agente de selección se mantuvieron para cosecha de la semilla T1.

Después las semillas se cosecharon de tres a cinco meses después del trasplante. El procedimiento produjo transformantes de sitio único a una tasa de alrededor de 50 % (Aldemita and Hodges1996, Chan y col., 1993, Hiei y col., 1994).

Transformación de maíz La transformación de maíz (Zea mays) se realizó con una modificación del procedimiento descrito por Ishida y col., (1996) Nature Biotech 14(6): 745–50. La transformación es dependiente del genotipo en maíz y solo son genotipos específicos susceptibles a transformación y regeneración. Como progenitores, la línea endogámica A188 (Universidad de Minnesota) o híbridos con A188, son buenas fuentes de material donante para la transformación, pero también pueden usarse otros genotipos satisfactoriamente. Se cosecharon espigas de plantas de maíz aproximadamente 11 días después de la polinización (DDP) cuando la longitud del embrión inmaduro era de aproximadamente 1 a 1, 2 mm. Los embriones inmaduros se co-cultivaron con Agrobacterium tumefaciens que contenía el vector de expresión y las plantas transgénicas se recuperaron a través organogénesis. Los embriones cortados se cultivaron en medio de inducción de callo y después en medio de regeneración de maíz que contenía el agente de selección (por ejemplo imidazolinona, pero pueden usarse diversos marcadores de selección). Las placas de Petri se incubaron a la luz a 25 ºC durante 2-3 semanas, o hasta que se desarrollasen los brotes. Los brotes verdes se transfirieron desde cada embrión al medio de enraizamiento de maíz y se incubaron a 25 ºC durante 2-3 semanas, hasta el desarrollo de las raíces. Los brotes enraizados se trasplantaron al suelo en el invernadero. Se produjeron semillas T1 de plantas que presentaban tolerancia al agente de selección y que contenían una sola copia del inserto de ADN-T.

Transformación de trigo La transformación de trigo se realizó con el procedimiento descrito por Ishida y col., (1996) Nature Biotech 14(6): 745–50. La variedad de cultivo Bobwhite (disponible de CIMMYT, México) se utiliza normalmente para transformación. Embriones inmaduros se co-cultivaron con Agrobacterium tumefaciens que contenía el vector de expresión y las plantas transgénicas se recuperaron a través de organogénesis. Después de la incubación con

Agrobacterium, los embriones cortados se cultivan in vitro en medio de inducción de callo y después en medio de regeneración que contenía el agente de selección (por ejemplo imidazolinona, pero pueden usarse diversos marcadores de selección). Las placas de Petri se incubaron a la luz a 25 ºC durante 2-3 semanas, o hasta que se desarrollasen los brotes. Los brotes verdes se transfirieron desde cada embrión al medio de enraizamiento y se incubaron a 25 ºC durante 2-3 semanas, hasta el desarrollo de las raíces. Los brotes enraizados se trasplantaron al suelo en el invernadero. Se produjeron semillas T1 de plantas que presentaban tolerancia al agente de selección y que contenían una sola copia del inserto de ADN-T.

Transformación de soja La transformación de soja se realiza de acuerdo con una modificación del procedimiento descrito en el Texas A&M patente de Estados Unidos 5.164.310. Diversas variedades comerciales de soja son susceptibles a transformación mediante este procedimiento La variedad de cultivo Jack (disponible de la fundación Illinois Seed) se utiliza normalmente para transformación. Las semillas de soja se esterilizan para siembra in vitro. El hipocotilo, el radículo y un cotiledón se extirpan de plántulas jóvenes de siete días de vida. El epicótilo y el cotiledón restante se cultivan adicionalmente para desarrollar nodos axilares. Estos nodos axilares se extirpan y se incuban con Agrobacterium tumefaciens que contenía el vector de expresión. Después de tratamiento de co-cultivo, los explantes se lavan y se transfieren al medio de selección. Los brotes regenerados se extirpan y se colocan en un medio de elongación de brote. Los brotes no mayores de 1 cm se colocaron se colocan en medio de enraizamiento hasta que se desarrollaron raíces. Los brotes enraizados se trasplantaron al suelo en el invernadero. Se produjeron semillas T1 de plantas que presentaban tolerancia al agente de selección y que contenían una sola copia del inserto de ADN-T.

Transformación colza/canola Peciolos cotiledonarios e hipocótilos de plántulas jóvenes de 5–6 días de vida se utilizan como explantes para el cultivo tisular y se transforman de acuerdo con Babic y col., (1998, Plant Cell Rep 17: 183–188). La variedad de cultivo comercial Westar (Agriculture Canada) es la variedad convencional usada para la transformación, pero también pueden usarse otras variedades. Las semillas de canola se esterilizan en la superficie para la siembra in vitro. Explantes de peciolos cotiledonarios con el cotiledón unido se extirpan de plántulas in vitro y se inoculan con Agrobacterium (que contenía el vector de expresión) sumergiendo el extremo cortado del explante del peciolo en la suspensión bacteriana. Después los explantes se cultivan durante 2 días en medio MSBAP-3 que contenía BAP 3 mg/l, sacarosa al 3 %, Fitagar al 0,7 % a 23 ºC, 16 h de luz. Después de dos días de co-cultivo con Agrobacterium, los explantes de peciolo se transfieren a medio MSBAP-3 que contenía BAP 3 mg/l, cefotaxima, carbenicilina o timentina (300 mg/l) durante 7 días y después se cultivan en medio MSBAP-3 con cefotaxima, carbenicilina o timentina y agente de selección hasta la regeneración del brote. Cuando los brotes tenían una longitud de 5 – 10 mm, se cortaron y se transfirieron al medio de elongación de brote (MSBAP-0,5 que contenía BAP 0,5 mg/l). Los brotes de aproximadamente 2 cm de longitud se transfieren al medio de enraizamiento (MS0) para la inducción de raíces. Los brotes enraizados se trasplantaron al suelo en el invernadero. Se produjeron semillas T1 de plantas que presentaban tolerancia al agente de selección y que contenían una sola copia del inserto de ADN-T.

Transformación de alfalfa Un clon de regeneración de alfalfa (Medicago sativa) se transforma utilizando el procedimiento de (McKersie y col., 1999 Plant Physiol 119: ) 839–847). La regeneración y transformación de la alfalfa es dependiente del genotipo y por lo tanto se requiere una planta regenerada. Se han descrito procedimientos para obtener plantas regeneradas. Por ejemplo, éstas pueden seleccionarse de variedades de cultivo Rangelander (Agriculture Canada) o de cualquier otra variedad comercial de alfalfa como describen Brown DCW y A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112). Como alternativa, la variedad RA3 (Universidad de Wisconsin) se ha seleccionado para su uso en cultivo tisular (Walker y col., 1978 Am J Bot 65:654–659). Explantes de peciolo se co-cultivan con un cultivo durante una noche de Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie y col., 1999 839–847) o LBA4404 que contiene el vector de expresión. Los explantes se co-cultivan durante 3 días en la oscuridad en un medio de inducción SH que contenía Pro 288 mg/l, tioprolina 53 mg/l, K2SO4 4, 35 g/l y 100 µm de acetositinginona. Los explantes se lavan en medio Murashige-Skoog de fuerza media (Murashige y Skoog, 1962) y se siembran en placas en el mismo medio de inducción SH con acetosiringinona pero con un agente de selección adecuado y un antibiótico adecuado para inhibir el crecimiento de Agrobacterium. Después de varias semanas, los embriones somáticos se transfirieron al medio de desarrollo BOi2Y que no contenía reguladores de crecimiento, sin antibióticos, y sacarosa 50 g/l. Posteriormente, los embriones somáticos germinaron en medio Murashige-Skoog de fuerza media. Las plántulas enraizadas se trasplantaron en macetas y se cultivaron en un invernadero. Se produjeron semillas T1 de plantas que presentaban tolerancia al agente de selección y que contenían una sola copia del inserto de ADN-T.

Ejemplo 6: Procedimiento de evaluación

6.1 Configuración de Evaluación

Se generaron aproximadamente 35 transformantes independientes de arroz T0. Los transformantes primarios se transfirieron de una cámara de cultivo de tejido a un invernadero para el cultivo y la cosecha de las semillas T1. Siete eventos, de los cuales la progenie T1 segrega 3: 1 para la presencia / ausencia del transgen, se retuvieron. Para cada uno de estos eventos, aproximadamente 10 plántulas T1 que contienen el transgén (hetero y homocigotos) y aproximadamente 10 plántulas T1 que carecen del transgén (nulicigotos) fueron seleccionados mediante el control de la expresión del marcador visual. Las plantas transgénicas y los nulicigotos correspondientes se hicieron crecer lado a lado en posiciones aleatorias. Condiciones de invernadero fueron días cortos (12 horas de luz), 28 °C en la luz y 22 °C en la oscuridad, y una humedad relativa de 70 %.

Cinco eventos T1 se evaluaron después en la generación T2 siguiendo el mismo procedimiento de evaluación como para la generación T1 pero con más Individuos por acontecimiento. Desde la etapa de siembra hasta la etapa de madurez se pasaron las plantas varias veces a través de un gabinete de imágenes digitales. En cada punto de tiempo, se tomaron imágenes digitales (2048x1536 píxeles, 16 millones de colores) de cada planta desde por lo menos 6 ángulos diferentes.

El vigor inicial es el área sobre el suelo de la planta (plántulas) tres semanas después de la germinación. El aumento de la biomasa de la raíz se expresa como un incremento en la biomasa total de las raíces (medida como máximo biomasa de raíces observadas durante la vida útil de una planta); o como un aumento en el índice de la raíz / tallo (medido como la relación entre la masa de raíces y disparar masa en el período de crecimiento activo de la raíz y brote).

6.2 Análisis estadístico: Prueba F Un ANOVA de dos factores (análisis de variantes) se utilizó como un modelo estadístico para la evaluación global de las características fenotípicas de la planta. Se llevó a cabo una prueba F en todos los parámetros medidos de todas las plantas de todos los eventos transformados con el gen de la presente invención. La prueba F se llevó a cabo para comprobar si el efecto del gen sobre todos los eventos de transformación y para verificar un efecto general del gen, también conocido como un efecto de gen global. El umbral de significación para un verdadero efecto génico global se fijó en un nivel de probabilidad del 5 % para la prueba F. Un valor significativo de la prueba F apunta a un efecto génico, lo que significa que no es sólo la mera presencia o la posición del gen que causa las diferencias en el fenotipo.

Para comprobar si hay un efecto de los genes dentro de un acontecimiento, es decir, para un efecto específico de línea, se realizó una prueba t dentro de cada acontecimiento utilizando conjuntos de datos de las plantas transgénicas y las correspondientes plantas nulas. "Plantas nulas" o "segregantes nulos" o "nulicigotos" son las plantas tratadas de la misma forma que la planta transgénica, pero de la que el transgén ha segregado. Las plantas nulas también se pueden describir como las plantas transformadas negativas homocigotas. El umbral de significación para la prueba t se establece en nivel de probabilidad del 10 %. Los resultados para algunos acontecimientos pueden estar por encima o por debajo de este umbral. Esto se basa en la hipótesis de que un gen solamente podría tener un efecto en ciertas posiciones en el genoma y que la aparición de este efecto dependiente de la posición no es infrecuente. Este tipo de efecto génico también se denomina en el presente documento un "efecto de línea del gen". El valor p se obtiene comparando el valor t de la distribución t o, como alternativa, mediante la comparación del valor F con la distribución F. El valor p da después la probabilidad de que la hipótesis nula (es decir, que no hay ningún efecto del transgén) sea correcta.

Ejemplo 7: Resultados de la evaluación

El área por encima del suelo de la planta (o biomasa foliar) se determinó contando el número total de píxeles en las imágenes digitales de partes de la planta sobre el suelo discriminadas desde el fondo. Este valor se promedió para las fotografías tomadas en el mismo punto de tiempo desde los diferentes ángulos y se convierte en un valor superficie física expresada en mm cuadrados por calibración. Los experimentos muestran que el área de la planta por encima del suelo medida de esta manera se correlaciona con la biomasa de las partes de la planta por encima del suelo. El área por encima del suelo es el punto de tiempo en el que la planta había alcanzado su máxima biomasa foliar.

Las panículas primarias maduras se cosecharon, contaron, embolsaron, marcaron con código de barras y después se secaron durante tres días en un horno a 37 °C. Las panículas se trillaron y todas las semillas se recogieron y se contaron. Las cáscaras llenas se separan de las vacías utilizando un dispositivo de soplado de aire. Las cáscaras vacías se desecharon y la fracción restante se contó de nuevo. Las vainas llenas se pesaron en una balanza analítica. El número de semillas llenas se determinó contando el número de vainas llenas que quedaron después de la etapa de separación. El rendimiento total de semillas se midió pesando todas las vainas llenas cosechadas de una planta. Número total de semillas por planta se midió contando el número de cáscaras cosechadas de una planta. El peso de mil granos (PMG) se extrapola a partir del número de semillas llenas contadas y su peso total. El índice de recolección (IR) en la presente invención es la relación entre el rendimiento de semilla total y el área por encima del suelo (mm2), multiplicado por un factor de 106. El número total de flores por panícula es la relación entre el número total de semillas y el número de maduro panículas primarias. La tasa de llenado de semillas, como se define en la presente invención, es la proporción (expresado en %) del número de semillas llenas sobre el número total de semillas (o floretes).

Tal como se presenta en las tablas Q a W, la biomasa aérea, el número de flores por panícula, el rendimiento de semillas, el número total de semillas, el número de semillas llenas, el peso de mil granos (PMG) y el índice de recolección incrementan en las plantas transgénicas con una mayor expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de transcripción SPL15, en comparación con las plantas de control adecuadas. Se muestran los resultados del las generaciones T1 y T2.

La Tabla Q muestra el número de acontecimientos transgénicos con un aumento en la biomasa aérea, el porcentaje de este aumento, así como la relevancia estadística de este incremento de acuerdo con la prueba F.

Tabla Q: Número de acontecimientos transgénicos con un aumento en la biomasa aérea, el porcentaje de aumento, y el valor P de la prueba F en la generación T1 y T2 de arroz transgénico con aumento de la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de transcripción SPL15.

Biomasa aérea

Número de

%

de Valor P de la

acontecimientos que

diferencia

prueba F

muestran un aumento

Generación T1 5 de 7 0,0773 Generación T2 4 de 5 7 0,0172 La Tabla R muestra el número de acontecimientos transgénicos con un aumento en el número total de flores por panícula, el porcentaje de este aumento, así como la relevancia estadística de este incremento de acuerdo con la prueba F.

Tabla R: Número de acontecimientos transgénicos con un aumento en las flores por panícula, el porcentaje de aumento, y el valor P de la prueba F en la generación T1 y T2 de arroz transgénico con aumento de la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de transcripción SPL15.

Flores por panícula

Número

de

%

de Valor P de la

acontecimientos

que diferencia

prueba F

muestran un aumento

Generación T1 6 de 7 4 0,0447 Generación T2 4 de 5 0,0013 La Tabla S muestra el número de acontecimientos transgénicos con un aumento en el rendimiento de semilla total (peso total de la semilla), el porcentaje de este aumento, así como la relevancia estadística de este incremento de acuerdo con la prueba F.

Tabla S: Número de acontecimientos transgénicos con un aumento en el rendimiento de semillas, el porcentaje de aumento, y el valor P de la prueba F en la generación T1 y T2 de arroz transgénico con aumento de la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de transcripción SPL15.

Rendimiento de semillas

Número de

% de

Valor p de la

acontecimientos que

diferencia

prueba F

muestran un

aumento

Generación T1 7 de 7 0,0019 Generación T2 5 de 5 21 0,0001 La Tabla T muestra el número de acontecimientos transgénicos con un aumento en el número total de semillas, el porcentaje de este aumento, así como la relevancia estadística de este incremento de acuerdo con la prueba F.

Tabla T: Número de acontecimientos transgénicos con un aumento en el número total de semillas, el porcentaje de aumento, y el valor P de la prueba F en la generación T1 y T2 de arroz transgénico con aumento de la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de transcripción SPL15.

Número total de semillas

Número de

% de

Valor p de la

acontecimientos que

diferencia

prueba F

muestran un aumento

Generación T1 6 de 7 6 0,07 Generación T2 4 de 5 13 0,0023 La Tabla U muestra el número de acontecimientos transgénicos con un aumento en el número de semillas llenas, el porcentaje de este aumento, así como la relevancia estadística de este incremento de acuerdo con la prueba F.

Tabla U: Número de acontecimientos transgénicos con un aumento en el número total de semillas llenas, el porcentaje de aumento, y el valor P de la prueba F en la generación T1 y T2 de arroz transgénico con aumento de la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de transcripción SPL15.

Número de semillas llenas

Número de

% de

Valor p de la

acontecimientos que

diferencia

prueba F

muestran un

aumento

Generación T1 6 de 7 14 0,0031 Generación T2 4 de 5 19 0,0003 La Tabla V muestra el número de acontecimientos transgénicos con un aumento en el índice de recolección, el porcentaje de este aumento, así como la relevancia estadística de este incremento de acuerdo con la prueba F.

Tabla V Número de acontecimientos transgénicos con un aumento en el índice de recolección, el porcentaje de aumento, y el valor P de la prueba F en la generación T1 y T2 de arroz transgénico con aumento de la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de transcripción SPL15.

índice de recolección

Número de

% de diferencia

Valor p de la

acontecimientos que

prueba F

muestran un

aumento

Generación T1 7 de 7 12 0,0003 Generación T2 4 de 5 0,0001 La Tabla W muestra el número de acontecimientos transgénicos con un aumento en el peso de mil granos (PMG), el porcentaje de este aumento, así como la relevancia estadística de este incremento de acuerdo con la prueba F.

Tabla W: Número de acontecimientos transgénicos con un aumento en el peso de mil granos (PMG), el porcentaje de aumento, y el valor P de la prueba F en la generación T1 y T2 de arroz transgénico con aumento de la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de transcripción SPL15.

Peso de mil granos

Número de

% de

Valor p de la

acontecimientos que

diferencia

prueba F

muestran un aumento

Generación T1 4 de 7 2 0,0041 Generación T2 4 de 5 1 0,0259

Ejemplo 8: Resultados de la evaluación fenotípica de las plantas transgénicas que expresan la SEC ID Nº 234 bajo el control de un promotor constitutivo

Los resultados de la evaluación de plantas de arroz transgénicas que expresan la secuencia de ácido nucleico útil en la realización de los procedimientos de la invención bajo el control del promotor GOS2 constitutivo se presentan en la Tabla x. También se muestra la diferencia porcentual entre los transgénicos y los nulicigotos correspondientes.

Las plantas transgénicas que expresan la secuencia de ácido nucleico útil en la realización de los procedimientos de la invención tienen un mayor vigor inicial y un mayor PMG en comparación con las plantas control (en este caso, las nulicigotas).

Tabla X: Resultados de la evaluación de plantas de arroz transgénicas de generación T1 que expresan la

secuencia de ácido nucleico útil en la realización de los procedimientos de la invención, bajo el control de

un promotor GOS2 constitutivo fuerte

Rasgo

%

de

incremento

de

los

mejores

acontecimientos en la generación T1

Aumento de vigor inicial 17 % Rendimiento de semillas totales (por 18 % planta) Número total de semillas llenas 19 % Aumento del índice de llenado de las 10 % semillas Aumento del índice de recolección 15 %

Listado de secuencias

<110> CropDesign N.V.

<120> Plantas que tienen rasgos potenciados relacionados con el rendimiento y un procedimiento de producción de las mismas <130> PF58328 <160> 61 <170> PatentIn versión 3.3 <210> 234 <211> 1065 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana <400> 234 <210> 235 <211> 354 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 235 <210> 236 <211> 1128 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana <400> 236 <210> 237 <211> 375 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 237 <210> 238 <211> 1149 <212> ADN <213> Aquilegia formosa x Aquilegia pubescens <400> 238 <210> 239 <211> 382 <212> PRT <213> Aquilegia formosa x Aquilegia pubescens <400> 239 <210> 240 <211> 1170 <212> ADN <213> Gossypium hirsutum <400> 240 <210> 241 <211> 389 <212> PRT <213> Gossypium hirsutum <400> 241 <210> 242 <211> 1017 <212> ADN <213> Ipomoea nil <400> 242 <210> 243 <211> 338 <212> PRT <213> Ipomoea nil <400> 243 <210> 244 <211> 1035 <212> ADN <213> Lactuca sativa <400> 244 <210> 245 <211> 344 <212> PRT <213> Lactuca sativa <400> 245 <210> 246 <211> 1137 <212> ADN <213> Malus domestica <400> 246 <210> 247 <211> 378 <212> PRT <213> Malus domestica <400> 247 <210> 248 <211> 1014 <212> ADN <213> Medicago trunculata <400> 248 <210> 249 <211> 337 <212> PRT <213> Medicago trunculata <400> 249 <210> 250 <211> 1143 <212> ADN <213> Nicotiana bentamiana <400> 250 <210> 251 <211> 380 <212> PRT <213> Nicotiana bentamiana <400> 251 <210> 252 <211> 1254 <212> ADN <213> Oryza sativa <400> 252 <210> 253 <211> 417 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 253

ES 2 553 384 T3   <210> 254 <211> 1182 <212> ADN <213> Oryza sativa <400> 254

ES 2 553 384 T3   <210> 255 <211> 393 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 255

ES 2 553 384 T3   <210> 256 <211> 1119 <212> ADN <213> Solanum tuberosum

ES 2 553 384 T3   <400> 256 <210> 257 <211> 372 <212> PRT <213> Solanum tuberosum <400> 257

ES 2 553 384 T3  

ES 2 553 384 T3   <210> 258 <211> 1140 <212> ADN <213> Vitis vinifera <400> 258 <210> 259 <211> 379

ES 2 553 384 T3   <212> PRT <213> Vitis vinifera <400> 259

ES 2 553 384 T3   <210> 260 <211> 1209 <212> ADN <213> Zea mays <400> 260

ES 2 553 384 T3   <210> 261 <211> 402 <212> PRT <213> Zea mays <400> 261

ES 2 553 384 T3   <210> 262 <211> 1137 <212> ADN <213> Zea mays

ES 2 553 384 T3   <400> 262 <210> 263 <211> 378 <212> PRT <213> Zea mays <400> 263

ES 2 553 384 T3  

ES 2 553 384 T3   <210> 264 <211> 403 <212> ADN <213> Sorghum propinquum <400> 264 <210> 265 <211> 134 <212> PRT <213> Sorghum propinquum <400> 265

ES 2 553 384 T3   <210> 266 <211> 732 <212> ADN <213> Allium cepa <400> 266 <210> 267 <211> 244 <212> PRT <213> Allium cepa <400> 267

ES 2 553 384 T3   <210> 268 <211> 969 <212> ADN <213> Antirrhinum majus <400> 268

ES 2 553 384 T3   <210> 269 <211> 323 <212> PRT <213> Antirrhinum majus <400> 269

ES 2 553 384 T3   <210> 270 <211> 633 <212> ADN <213> Brassica napus <400> 270

ES 2 553 384 T3   <210> 271 <211> 211 <212> PRT <213> Brassica napus <400> 271

ES 2 553 384 T3   <210> 272 <211> 852 <212> ADN <213> Saccharum officinarum <400> 272 <210> 273 <211> 283 <212> PRT <213> Saccharum officinarum <400> 273

ES 2 553 384 T3   <210> 274 <211> 647 <212> ADN

ES 2 553 384 T3   <213> Festuca arundinacea <400> 274 <210> 275 <211> 215 <212> PRT <213> Festuca arundinacea <400> 275

ES 2 553 384 T3   <210> 276 <211> 11 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> motivo1 <220> <221> VARIANTE <222> (1)..(1) <223> /sustituir = "Thr" <220> <221> VARIANTE <222> (3)..(3) <223> /sustituir = "Arg" /sustituir = "Met" /sustituir = "Gln" <220> <221> VARIANTE <222> (6)..(6) <223> /sustituir = "Gln" /sustituir = "Arg" <220> <221> VARIANTE <222> (7)..(7) <223> /sustituir = "Arg" /sustituir = "Glu"

ES 2 553 384 T3   <220> <221> VARIANTE <222> (8)..(8) <223> /sustituir = "Val" <220> <221> VARIANTE <222> (11)..(11) <223> /sustituir = "Gly" <400> 276 <210> 277 <211> 78 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Dominio de unión a ADN (DBD) de SPL del factor de transcripción Arath_SPL15 <400> 277 <210> 278 <211> 11 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> motivo2 <220> <221> VARIANTE <222> (3)..(3) <223> /sustituir = "Asn" /sustituir = "Thr" <220> <221> VARIANTE <222> (4)..(4) <223> /sustituir = "Gly" /sustituir = "Arg" <220> <221> VARIANTE <222> (11)..(11) <223> /sustituir = "Thr"

ES 2 553 384 T3   <400> 278 <210> 279 <211> 1130 <212> ADN <213> Oryza sativa <400> 279 <210> 280 <211> 56 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> cebador: prm07277 <400> 280 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt aaacaatgga gttgttaatg tgttcg 56 <210> 281 <211> 51 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220>

ES 2 553 384 T3   <223> cebador: prm07278 <400> 281 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt gatgaagatc ttaaaaggtg a 51 <210> 282 <211> 1110 <212> ADN <213> Brassica rapa <400> 282 <210> 283 <211> 369 <212> PRT <213> Brassica rapa <400> 283

ES 2 553 384 T3  

ES 2 553 384 T3   <210> 284 <211> 1080 <212> ADN <213> Glycine max <400> 284

ES 2 553 384 T3   <210> 285 <211> 359 <212> PRT <213> Glycine max <400> 285

ES 2 553 384 T3   <210> 286 <211> 1128 <212> ADN <213> Populus tremuloides <400> 286

ES 2 553 384 T3   <210> 287 <211> 375 <212> PRT <213> Populus tremuloides <400> 287

ES 2 553 384 T3   <210> 288 <211> 1059 <212> ADN <213> Citrus clementina <400> 288

ES 2 553 384 T3   <210> 289 <211> 352 <212> PRT <213> Citrus clementina <400> 289

ES 2 553 384 T3  

ES 2 553 384 T3   <210> 290 <211> 565 <212> ADN <213> Beta vulgaris <400> 290 <210> 291 <211> 188 <212> PRT <213> Beta vulgaris <400> 291

ES 2 553 384 T3   <210> 292 <211> 536 <212> ADN <213> Hevea brasiliensis <400> 292 <210> 293 <211> 177 <212> PRT <213> Hevea brasiliensis <400> 293

ES 2 553 384 T3   <210> 294 <211> 1130 <212> ADN <213> Oryza sativa <400> 294

ES 2 553 384 T3   <210> 295 <211> 2194 <212> ADN <213> Oryza sativa <400> 295

ES 2 553 384 T3  

ES 2 553 384 T3  

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para incrementar el rendimiento en semillas y/o la biomasa aérea en plantas en relación con plantas control adecuadas, que comprende incrementar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de transcripción que comprende del extremo N-terminal al extremo C-terminal: (i) el Motivo 1 como se representa en la SEC ID N°: 276; y (ii) al menos 65 % de identidad de secuencia con el DBD de SPL representado por la SEC ID Nº 277; y el Motivo 2 como se representa en la SEC ID N°: 278, en el que el motivo 1 y el motivo 2 tienen permitidos uno o más cambios conservadores en cualquier posición y / o uno, dos o tres cambio(s) no conservadore(s) en cualquier posición y, opcionalmente, la selección de plantas que tienen mayor rendimiento de semillas y / o biomasa aérea.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polipéptido del factor de transcripción comprende además uno o ambos de lo siguiente: (a) un tramo rico en G / S que precede al DBD del SPL; y (b) el tripéptido W (S / T) L en el extremo C-terminal del polipéptido, 3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicha expresión aumentada es efectuada por uno o más de: activación de ADN-T, TILLING, mutagénesis dirigida a sitio.

4. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2 o 3, en el que dicha expresión aumentada es efectuada mediante la introducción y expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido del factor de transcripción.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho ácido nucleico que codifica dicho factor de transcripción es uno cualquiera de las SEC ID Nº de ácido nucleico proporcionadas en la Tabla N o una porción del mismo, o una secuencia capaz de hibridarse con una cualquiera de las SEC ID Nº de los ácidos nucleicos proporcionadas en la Tabla N; y / o en el que dicho ácido nucleico que codifica un factor de transcripción codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las SEC ID Nº de ácido nucleico proporcionadas en la Tabla N, teniendo dicho ortólogo o parálogo una función equivalente a dicho factor de transcripción en relación con el rendimiento de la planta.

6. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho rendimiento de semillas aumentado comprende uno o más de: a) aumento del número de flores por planta; c) aumento del peso total de las semillas; d) aumento en el número de semillas (llenas); e) aumento del peso de mil granos (PMG); and f) aumento del índice de recolección.

7. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que en el que dicho ácido nucleico está unido operativamente a un promotor constitutivo, preferiblemente a un promotor HMGB (grupo B de alta movilidad) o un promotor GOS2, aún más preferiblemente a un promotor HMGB de arroz o a un promotor GOS2 de arroz.

8. Procedimiento acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de transcripción es de origen vegetal, preferiblemente de una planta dicotiledónea, aún más preferiblemente de la familia Brassicaceae, más preferiblemente de Arabidopsis thaliana.

9. Planta o parte de la misma, incluyendo semillas, obtenible por un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha planta o parte de la misma comprende un ácido nucleico recombinante que codifica un factor de transcripción unido operativamente a un promotor de HMGP o a un promotor GOS2, comprendiendo el polipéptido del factor de transcripción del extremo N-terminal al extemo C-terminal: (i) el Motivo 1 como se representa en la SEC ID N°: 276; y (ii) al menos 65 % de identidad de secuencia con el DBD de SPL representado por la SEC ID Nº 277; y el Motivo 2 como se representa en la SEC ID N°: 278, en el que el motivo 1 y el motivo 2 se permiten uno o más cambios conservadores en cualquier posición, y / o uno, dos o tres cambios no conservadore(s) en cualquier posición.

10. Construcción que comprende: (a) un ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de transcripción, comprendiendo el polipéptido del factor de transcripción del extremo N-terminal al extremo C-terminal: (i) el Motivo 1 como se representa en la SEC ID N°: 276; y (ii) al menos 65 % de identidad de secuencia con el DBD de SPL representado por la SEC ID Nº 277; y el Motivo 2 como se representa en la SEC ID N°: 278, en el que el motivo 1 y el motivo 2 se permiten uno o más cambios conservadores en cualquier posición, y / o uno, dos o tres cambios no conservadore(s) en cualquier posición; (b) un promotor GOS2 o HMGP unido operativamente a, y capaz de dirigir, la expresión de la secuencia de ácido nucleico de (a); y opcionalmente (c) una secuencia de terminación de la transcripción.

11. Planta, parte de planta o célula vegetal transformada con una construcción de acuerdo con la reivindicación 10.

ES 2 553 384 T3   12. Procedimiento para la producción de una planta transgénica que tiene un mayor rendimiento de semillas y / o de la biomasa aérea con relación a las plantas de control, en el que el procedimiento comprende: (a) introducir y expresar un ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de transcripción en una célula vegetal, comprendiendo el polipéptido del factor de transcripción del extremo N-terminal al extremo C-terminal: (i) el Motivo 1 como se representa en la SEC ID N°: 276; y (ii) al menos 65 % de identidad de secuencia con el DBD de SPL representado por la SEC ID Nº 277; y el Motivo 2 como se representa en la SEC ID N°: 278, en el que el motivo 1 y el motivo 2 se permiten uno o más cambios conservadores en cualquier posición, y / o uno, dos o tres cambios no conservadore(s) en cualquier posición; y (b) cultivar la célula vegetal en condiciones que estimulan el crecimiento y desarrollo de la planta.

13. Planta transgénica que tiene mayor rendimiento de semillas y / o de la biomasa aérea con relación a las plantas control, resultando dicho aumento en el rendimiento de semillas de una mayor expresión de un ácido nucleico que codifica un factor de transcripción unido operativamente a un promotor de HMGP o a un promotor GOS2, comprendiendo el polipéptido factor de transcripción de N -terminal a C-terminal: (i) el Motivo 1 como se representa en la SEC ID N°: 276; y (ii) al menos 65 % de identidad de secuencia con el DBD de SPL representado por la SEC ID Nº 277; y el Motivo 2 como se representa en la SEC ID N°: 278, en el que el motivo 1 y el motivo 2 se permiten uno o más cambios conservadores en cualquier posición, y / o uno, dos o tres cambios no conservadore(s) en cualquier posición.

14. Planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 9, 11 o 13, en la que dicha planta es una planta de cultivo o una monocotiledónea o un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo y avena, o una célula de planta transgénica derivada de dicha planta transgénica; y / o partes cosechables de dicha planta, en la que dichas partes cosechables son preferiblemente semillas; y / o productos derivados de dicha planta y / o a partir de dicha partes cosechables.

15. Uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de transcripción que comprende del extremo N- terminal al extremo C-terminal: (i) el Motivo 1 como se representa en la SEC ID N°: 276; y (ii) al menos 65 % de identidad de secuencia con el DBD de SPL representado por la SEC ID Nº 277; y el Motivo 2 como se representa en la SEC ID N°: 278, en el que el motivo 1 y el motivo 2 se permiten uno o más cambios conservadores en cualquier posición y / o uno, dos o tres cambios no conservadores en cualquier posición, para aumentar el rendimiento de semillas y / o la biomasa aérea en una planta con relación a las plantas de control; y / o el uso de una construcción de acuerdo con la reivindicación 10 u 11 para la fabricación de plantas que tienen mayor rendimiento de semillas y / o biomasa aérea, en relación con las plantas de control.

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