MÉTODOS PARA DETECTAR POXVIRUS.

Un método para determinar si el poxvirus está presente en una muestra,

comprendiendo los pasos de:

(a) poner en contacto la muestra con células huésped capaces de ser infectadas por poxvirus;

(b) transfectar transitoriamente las células huésped con un constructo indicador comprendiendo una secuencia indicadora operativamente unida a una secuencia promotora especifica de poxvirus; y

(c) determinar un nivel de expresión de la secuencia indicadora en las células huésped, determinando por ello si el poxvirus esta presente en la muestra.

ANTECEDENTES [0001] Se necesitan métodos rápidos y precisos para detectar agentes que podrían ser usados en un ataque bioterrorista, en particular los agentes de "Categoria A". Los agentes de Categoria A, como se definen por los Centros estadounidenses para el Control y Prevención de Enfermedad (CCD) incluyen organismos que representan un riesgo de salud pública porque pueden ser fácilmente diseminados o transmitidos de persona a persona y resultan en elevados índices de mortalidad. La viruela, un agente de Categoría A, es considerado como una amenaza particularmente peligrosa puesto que los índices de mortalidad podrían elevarse hasta un 25% a partir de la exposición al virus de la viruela. [0002] Métodos anteriores para detectar virus como el virus de la viruela implican el proceso lento de cría de partículas de virus viables a partir de una muestra que contiene potencialmente el virus. Métodos más recientes basados en PCR o anticuerpos son potencialmente más veloces y sensibles, y pueden ser incorporados posiblemente dentro de dispositivos portátiles. Sin embargo, es necesario saber lo suficiente sobre el agente vírico de interés para diseñar cebadores adecuados o generar anticuerpos con el fin de usar tales métodos. Esto significa que un agente vírico puede ser creado por ingeniería genética, o puede mutar de modo natural, de modo que su genoma o proteínas no serían detectados por medio de esos métodos. Además, ensayos basados en anticuerpos y PCR no distinguen entre agentes infecciosos, viables y agentes no viables o inactivados.

RESUMEN [0003] La presente invención es solamente definida por las reivindicaciones. Los presentes métodos permiten la detección de poxvirus infecciosos viables en una muestra. Los presentes métodos determinan si un poxvirus esta presente en una muestra al contactar la muestra con un primer grupo de células huésped capaces de ser infectadas por poxvirus y transfectando transitoriamente las células huésped con un constructo indicador. El constructo indicador comprende una secuencia indicadora unida operativamente a una secuencia promotora específica de virus que aumenta la transcripción de la secuencia indicadora cuando la célula huésped sea infectada por el poxvirus. El presente método además incluye el paso de determinar un nivel de expresión de la secuencia indicadora en las células huésped, determinando de ese modo si el poxvirus está presente o no en la muestra. La transfección fugaz puede ser llevada a cabo por transducción, electroporación, choque térmico, o lipofección.

[0004] Los presentes métodos son particularmente ventajosos para detectar virus de ADN replicante citoplasmático, incluyendo aquellos de la familia Poxviridae tales como la vaccinia y la variola (viruela) en cuyo caso la secuencia promotora puede ser la secuencia de SEC Nº ID. 1. Tales virus pueden ser detectados, por ejemplo, en muestras comprendiendo tejido de un sujeto animal humano o no humano, tal como sangre, plasma, fluido fibroespinal, o saliva. De manera alternativa, la muestra puede estar derivada de un sujeto tratado con un constructo vírico terapéutico. [0005] El promotor de virus específico usado en los presentes métodos aumenta la transcripción de la secuencia indicadora en presencia de una pluralidad de virus de ADN, generalmente virus de la misma familia. Esto es ventajoso cuando se realiza un ensayo de control positivo junto con los presentes métodos. El ensayo de control positivo incluye los pasos de transfectar de forma transitoria un segundo grupo de células huésped con el constructo indicador, infectar el segundo grupo de células huésped con un segundo virus de ADN, y entonces determinar un nivel de expresión de la secuencia indicadora en el segundo grupo de células huésped, de ese modo determinando que puede ser detectada la presencia del virus de ADN de interés en la muestra.

[0006] En una realización, los presentes métodos determinan si un poxvirus esta presente en una muestra o no. En esta realización, células huésped capaces de ser infectadas por un poxvirus son contactadas con una muestra transfectada de forma transitoria con un constructo indicador. El constructo indicador comprende una secuencia indicadora operativamente unida a una secuencia promotora específica de poxvirus. El nivel de expresión de la secuencia indicadora en las células huésped es determinada entonces, de ese modo determinando si el poxvirus esta presente en la muestra o no. La secuencia indicadora usada en esta realización puede ser, por ejemplo, cualquiera de la SEC ID Nº 1. ID, SEC ID Nº.2, SEC ID Nº. 3, o SEC ID Nº. 4. Esta realización puede además comprender el paso de comparar el nivel de expresión de la secuencia indicadora a una curva de calibración con el fin de determinar cuantitativamente la cantidad de poxvirus en una muestra, donde los puntos de datos sobre la curva de calibración están determinados contactando muestras teniendo un título conocido de poxvirus con grupos respectivos de células huésped capaces de ser infectadas por el poxvirus, transfectando de forma transitoria las células huésped con un constructo indicador comprendiendo una secuencia indicadora operativamente unida a una secuencia promotora especifica de poxvirus, y determinando un nivel de expresión de la secuencia indicadora en cada uno de los grupos de las células huésped.

DIBUJOS [0007] Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente invención se entenderán mejor a la vista de la siguiente descripción, reivindicaciones adjuntas, y figuras anexas donde:

La Figura 1 es un gráfico describiendo los resultados de un experimento en que diferentes títulos de virus de vaccinia fueron detectados empleando el presente método.

Todas las dimensiones especificadas en esta revelación son a modo de ejemplo únicamente y no tienen intención de ser limitativas. Además, las proporciones mostradas en estas figuras no están necesariamente a escala. Como será entendido por aquellos con conocimiento en la materia con referencia a esta revelación, las dimensiones reales de cualquier dispositivo o parte de un dispositivo revelado en esta revelación será determinado por su uso pretendido.

DESCRIPCIÓN Definiciones [0009] Tal como se usan aquí, los siguientes términos tienen los significados dados abajo, a menos que se tenga intención clara de darles un significado distinto por el contexto en que tal termino es usado. [0010] "Virus de ADN citoplasmático-replicante" se refiere a un virus que almacena información genética al menos de manera parcial en ácido desoxirribonucleico (ADN) y que transcribe tal información genética fuera del núcleo de una célula huésped que lo infecta, por ejemplo, en el citoplasma de una célula huésped. Virus de ADN citoplasmático replicante incluyen virus de la familia Poxviridae. [0011] " Promotor E/L " se refiere a un promotor de poxvirus temprano-tardío sintético descrito en Chakrabarti, S., Sisler, J. R., y Moss, B., "Promotor temprano/tardío de virus de vaccinia, sintético, compacto para la expresión de proteína, " BioTechniques, 23:1094-1097 (1997) y teniendo la secuencia AAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATA (SEC ID Nº. 1) . [0012] "Expresión" de una secuencia nucleótida se refiere a la transcripción de la secuencia y su subsecuente traducción en un polipéptido. [0013] "Nivel de expresión, " con referencia a una secuencia indicadora (como se define abajo) se refiere a la abundancia de la secuencia indicadora. La abundancia de un indicador correspondiente a la secuencia indicadora es detectada normalmente en los presentes métodos como un proxy para el nivel de expresión de la secuencia indicadora, y determinar el nivel de expresión de una secuencia indicadora puede comprender determinar la abundancia del indicador correspondiente en una célula huésped o grupo de células huésped. [0014] Un "vector de expresión" es un constructo de ácido nucleico generado de forma recombinante o sintética comprendiendo ADN u otros ácidos nucleicos capaces de ser reconocidos y transcritos por factores de transcripción viral y celular en una célula huésped, en particular los factores de transcripción de un virus para ser detectado por los presentes métodos. El vector de expresión puede ser, por ejemplo, parte de un plásmido o virus. [0015] "Célula huésped" se refiere a una célula eucariota capaz de ser infectada con un virus en un ensayo de acuerdo a los presentes métodos. [0016] "Secuencia nucleótida" se refiere a una cadena de desoxiribonucleótidos o ribonucleótidos, por ejemplo. oligonucleótidos o polinucleotidos, en forma de cadena sencilla o doble.

El término " operativamente ligado" se refiere... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar si el poxvirus está presente en una muestra, comprendiendo los pasos de:

(a) poner en contacto la muestra con células huésped capaces de ser infectadas por poxvirus;

(b) transfectar transitoriamente las células huésped con un constructo indicador comprendiendo una secuencia indicadora operativamente unida a una secuencia promotora especifica de poxvirus; y

(c) determinar un nivel de expresión de la secuencia indicadora en las células huésped, determinando por ello si el poxvirus esta presente en la muestra.

2. El método de la Reivindicación 1, en donde la secuencia promotora comprende una secuencia seleccionada del grupo consistiendo de SEC ID Nº. 1, SEC ID Nº. 2, SEC ID Nº. 3, y SEC ID Nº. 4.

3. El método de la Reivindicación 1, que comprende además el paso de comparar el nivel de expresión de la secuencia indicadora con una curva de calibración a fin de determinar cuantitativamente la cantidad de poxvirus en la muestra, en donde los puntos de datos sobre la curva de calibración están determinados:

(i) contactando una muestra teniendo un titulo conocido del poxvirus con células huésped capaces de ser infectadas por el poxvirus;

(ii) transfectando transitoriamente las células huésped con un constructo indicador comprendiendo una secuencia indicadora operativamente unida a una secuencia promotora especifica de poxvirus; y

(iii) determinando un nivel de expresión de la secuencia indicadora en las células huésped.

4. El método de la Reivindicación 1, en donde el paso (b) es realizado por un método seleccionado del grupo consistiendo de transducción, electroporación, choque térmico, y lipofección.

5. El método de la Reivindicación 1, en donde la muestra comprende tejido de un animal humano o no humano.

6. El método de la Reivindicación 5, en donde la muestra es seleccionada del grupo consistiendo de sangre, plasma, fluido cerebroespinal, y saliva.

7. El método de la Reivindicación 5, en donde la muestra es derivada de un animal tratado con un constructo viral terapéutico.

8. El método de la Reivindicación 1, en donde el paso de determinar un nivel de expresión de la secuencia indicadora es realizado determinando la abundancia de un indicador, en donde el indicador es el producto de traslación de la secuencia indicadora.

9. El método de la Reivindicación 8, en donde el indicador es seleccionado del grupo consistiendo de Proteína Fluorescente Verde Aumentada (PFVA) , Proteína Fluorescente Verde (PFV) , luciferasa, beta-galactosidasa, y fosfatasa alcalina segregada (FASE) .