METODO PARA LA IDENTIFICACION DE PEPTIDOS ANTIGENICOS.

Un método para aislar péptidos antigénicos en cantidades femtomolares,

cuyo método consiste en

(a)proporcionar complejos de moléculas de MHC II con péptidos antigénicos aislados a partir de células, muestras de tejido o fluido corporal de un organismo mamífero en una cantidad de 0,2 a 3 µg y

(b)secuestrar los complejos mediante inmunoprecipitación, en el que los complejos están acoplados con anticuerpos específicos MHCII a cuentas,

c)lavar los complejos unidos de moléculas MHCII con péptidos antigénicos con agua o tampón bajo en sal, donde el tampón bajo en sal es un tampón Tris, fosfato o acetato en un rango de concentración de 0,5 a 10 mM y

d)eluir los péptidos antigénicos asociados de las moléculas MHC II

Método para la identificación de péptidos antigénicos.

La presente invención está relacionada con un método útil para aislar péptidos antigénicos de una cantidad limitada de células o fluidos corporales de un organismo mamífero en una cantidad suficiente para determinar su secuencia e identidad. Por tanto, esta invención está relacionada con métodos para identificar nuevos antígenos asociados a enfermedades, por ejemplo, antígenos tumorales y antígenos implicados en enfermedades autoinmunes, para ser usados con fines diagnósticos o terapéuticos. Los métodos de la presente invención también pueden ser utilizados para controlar la calidad de las vacunas. Más concretamente, los métodos de la invención pueden ser utilizados para determinar la secuencia de péptidos antigénicos presentados a través de los receptores peptídicos de las células dendríticas que son las células presentadoras de antígenos más importantes del cuerpo y herramientas valiosas para la vacunación.

Condiciones patológicas, tales como enfermedades infecciosas, trastornos autoinmunes o cáncer, se pueden distinguir de las condiciones sanas por la expresión de moléculas específicas de la enfermedad. En particular, las proteínas que son expresadas de novo, mutadas o expresadas aberrantemente, pueden ser utilizadas como marcadores de la correspondiente enfermedad.

Una clase potente de marcadores que sirve como herramientas diagnósticas y terapéuticas son los fragmentos de proteínas o péptidos unidos a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (del inglés, major histocompatibility complex, MHC). En humanos, las moléculas del MHC se denominan antígenos leucocitarios humanos (del inglés, human leukocyte antigens, HLA). Los péptidos asociados a HLA son cortos, abarcando 9-25 aminoácidos (Kropshofer, H. & Vogt, AB, Immunol Today 18 (1997) 77-82). Por un lado, estos péptidos derivan de las proteínas propias para establecer autotolerancia. Por otro lado, los péptidos asociados a HLA derivan de proteínas extrañas de origen viral, fúngico o bacteriano para luchar contra invasores externos. A través de la activación de células inmunes especializadas, llamadas linfocitos T (abreviado: células T), los complejos péptido-HLA son indispensables para organizar una respuesta inmune celular o humoral. Los auto-péptidos particulares, denominados péptidos autoantigénicos, son reconocidos erróneamente por células T autoagresivas dando lugar a enfermedades autoinmunes. Por el contrario, la falta de reconocimiento por células T de autopéptidos derivados de antígenos específicos de tumores, contribuye a la evasión inmune y al crecimiento progresivo de los tumores (Boon, T. et al., Ann Rev Immunol. 12 (1994) 337-265). Por lo tanto, sería de considerable importancia en la inmunología tumoral y en la autoinmunidad aumentar nuestro conocimiento sobre los péptidos marcadores asociados a una enfermedad.

Respecto a su función, se pueden distinguir dos clases de complejos péptido-MHC (Germain, R., Cell 76 (1994) 287-299): (i) complejos péptido-MHC de clase I, que pueden ser expresados por casi todas las células nucleadas para atraer a células T citotóxicas CD8+ que lisan células infectadas o células tumorales, (ii) complejos péptido-MHC de clase II, expresados constitutivamente sólo en las llamadas células presentadoras de antígeno (CPA), tales como linfocitos B, macrófagos o células dendríticas (CD). En particular, las CD tienen la capacidad de cebar a las células T ayudantes CD4+ (Banchereau, J. & Steinman, R.M., Nature 392 (1998) 245-254). Por otra parte, las CD pueden estar autorizadas para activar de manera óptima células T citotóxicas CD8+: esto se logra a través de la interacción previa de sus complejos péptido-MHC de clase II con las células T ayudantes CD4+ (Ridge, T. et al., Nature 393 (1998) 474-478). Por lo tanto, los péptidos presentados por las moléculas del MHC de clase II en las CD juegan un papel superior en la patogénesis de enfermedades que implican respuestas inmunes mediadas por células T.

El aparente papel de las CD en iniciar las respuestas inmunes ha estimulado los intentos para aprovechar las CD como vacunas, en particular contra el cáncer (Dallal, R.M. & Lotze, M.T., Curr Opinion Immunol 12 (2000) 583-588). Un avance clave fue la invención de técnicas para la diferenciación de CD in vitro de diferentes fuentes incluyendo sangre periférica, por ejemplo, monocitos adherentes, o células madre precursoras CD34+ derivadas de la médula ósea. Las CD diferenciadas y activadas in vitro pueden utilizarse para la vacunación de pacientes de cáncer después de co-cultivar con antígenos derivados de las células tumorales o mediante el empleo de técnicas análogas. Estudios piloto de vacunación con células dendríticas han inducido satisfactoriamente respuestas específicas contra el cáncer, incluidas respuestas clínicas (Timmermann, J.M. & Levy, R., Ann Rev Medicine 50 (1999) 507-529; Nestle, F.O., et al., Nature Medicine 7 (2001) 761-765).

Las vacunas contra el cáncer de células basadas en CD comprenden CD cometidas a pulsos con células cancerosas normales o modificadas genéticamente, lisados de células cancerosas, células cancerosas fusionadas a CD o complejos peptídicos de proteínas de choque térmico (Hsp-) derivadas de células cancerosas. El fundamento de esta última técnica es que las Hsp derivadas de células tumorales tienen péptidos específicos de tumores que son transferidos eficientemente a las moléculas del MHC de las CD. Estas CD finalmente preparan a las células T citotóxicas con reactividad antitumoral que conducen a la erradicación de tumores en ratones (Srivastava, P.K., et al., PNAS 83 (1986) 3407-3411; Suto, R., et al., Science 269 (1995) 1585-1588; Binder, R.J. et al, Nature Immunol. 1 (2000) 151-162).

La ventaja de todos estos enfoques es que no es necesario ningún conocimiento sobre la identidad de los antígenos tumorales. El inconveniente es que la identidad de los marcadores tumorales se desconoce y el número de copias de cada uno de los péptidos tumorales unidos a HLA es a menudo demasiado bajo para inducir respuestas de células T antitumorales a largo plazo.

Las vacunas basadas en la identificación de antígenos cancerosos incluyen CD preparadas con DNA desnudo, adenovirus o virus de la vacuna recombinantes, proteínas naturales o recombinantes purificadas de las correspondientes células tumorales o análogos sintéticos de péptidos tumorales. La ventaja de someter a pulsos a las CD con péptidos antigénicos tumorales en lugar de con los precursores genéticos o proteicos, es que los péptidos se pueden cargar directamente en las moléculas del MHC de las CD sin un posterior procesamiento.

Durante la última década, se han identificado numerosos péptidos derivados de proteínas de marcadores tumorales y restringidos por moléculas del MHC de clase I. Se agrupan en cuatro categorías: antígenos del cáncer de testículos, antígenos de diferenciación melanocito-melanoma, antígenos mutados y antígenos compartidos no mutados sobreexpresados en tumores. En varios estudios piloto de vacunación clínica, las CD de pacientes con melanoma se sometieron a pulsos con un cóctel de péptidos de melanoma que, hasta ahora, estaba exclusivamente restringido a HLA de clase I (Nestle, F.O. et al., Nature Medicine 4 (1998) 328-332; Thurner, B. et al., J Exp Med 190 (1999) 1669-1678). Sin embargo, existe una evidencia creciente de que la eficacia y la duración de las respuestas de las células T citotóxicas contra tumores pueden incrementarse por la implicación de las células T ayudantes limitadas al MHC de clase II. Por lo tanto, un método de vacunación mejorado podría prever el uso combinado de péptidos tumorales asociados a MHC de clase II además de los antígenos MHC de clase I.

El conocimiento de los antígenos cancerosos restringidos a MHC de clase II reconocidos por células T ayudantes CD4+ está por detrás de la identificación de los antígenos limitados a la clase I (Wang, R.-F., Trends in Immunol 22 (2001) 269-276). Una razón es que la transfección de librerías de cDNA de células tumorales a células diana y el uso posterior de las células T antitumorales para identificar los transfectantes adecuados y los epítopos antigénicos - un método usado satisfactoriamente con moléculas del MHC de clase I - no es efectiva porque las proteínas codificadas no viajan a la vía MHC de clase II en CPA.

Una alternativa innovadora es usar CD autólogas pulsadas con células tumorales o proteínas marcadoras...

1. Un método para aislar péptidos antigénicos en cantidades femtomolares, cuyo método consiste en

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las células aisladas de un organismo mamífero son células dendríticas.

3. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que los complejos secuestrados de moléculas MHC II con péptidos antigénicos se lavan con agua en un tubo de ultrafiltración antes de eluir los péptidos.

4. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en el que los péptidos antigénicos se eluyen de las moléculas MHC II utilizando ácido diluido.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los péptidos antigénicos se eluyen de las moléculas MHC II a 37ºC con ácido trifluoroacético diluido.

6. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, en el que los péptidos antigénicos aislados se fraccionan, se secuencian y se identifican.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que los péptidos antigénicos aislados se fraccionan, se secuencian y se identifican por métodos que comprenden cromatografía líquida y espectrometría de masas.

8. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, en el que los péptidos antigénicos son péptidos antigénicos procesados de manera natural o péptidos antigénicos procesados de manera no natural administrados al organismo.

9. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, en el que las células son células que expresan moléculas MHC II.

10. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9 donde el organismo mamífero es un organismo huma- no.

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, en el que las células del paso a) son células que expresan MHC II en un número que proporciona de 0,2 a 3 µg de moléculas MHC II y en el que las células que expresan MHC II están en contacto con una fuente de antígeno potencial previamente al aislamiento de los complejos peptídicos antígeno- molécula MHC II.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que las células que expresan MHC II son células dendríticas y en el que las células dendríticas están expuestas a una fuente potencial de antígeno como células dendríticas inmaduras al mismo tiempo que son inducidas a células dendríticas maduras.

13. El método de acuerdo con las reivindicaciones 11 a 12, en el que la fuente de antígeno potencial pertenece al grupo que comprende células tumorales, líneas de células tumorales, patógenos, antígenos virales, bacterianos o parasíticos, autoantígenos, fluidos corporales por ejemplo suero, fluido sinovial, ascitis.

14. El método de acuerdo con las reivindicaciones 11 a 13, en el que los péptidos antigénicos aislados se fraccionan, se secuencian y se identifican y los péptidos antigénicos derivados de la fuente del antígeno potencial se identifican comparando a los péptidos identificados de las células que han estado en contacto con un fuente del antígeno potencial con aquellos que se han identificado de células que no han estado en contacto con la fuente del antígeno potencial.

15. El uso de los métodos de las reivindicaciones 11 a 14 para el control de calidad de las vacunas.

16. El uso de los métodos de las reivindicaciones 1 a 14 para la monitorización inmunológica de las enfermedades.

17. El uso de los métodos de las reivindicaciones 1 a 14 para el control de la eficacia de un tratamiento terapéutico.

18. El uso de los métodos de las reivindicaciones 1 a 14 para el diseño de vacunas peptídicas individualizadas para el tratamiento de enfermedades.