Método para mejorar la resistencia al estrés en plantas y materiales para el mismo.

Un método para obtener una planta con una mayor resistencia al estrés con respecto a una planta de tipo salvaje,

donde dicha resistencia al estés se selecciona entre resistencia a la sequía y resistencia a estreses asociados con rutas mediadas por especies de oxígeno reactivo, comprendiendo dicho método:

(a) introducir al menos una mutación o un ácido nucleico exógeno en el genoma de una o más células vegetales, lo que da como resultado una reducción de la actividad asociada con SAL1 o uno de sus homólogos en dichas una o más células vegetales;

(b) regenerar una o más plantas a partir de dichas una o más células vegetales; y

(c)seleccionar una o más plantas que tienen una mayor resistencia a la sequía y/o resistencia asociada a estreses asociados con rutas mediadas por especies reactivas de oxígeno con respecto a una planta de tipo salvaje.

Método para mejorar la resistencia al estrés en plantas y materiales para el mismo.

Solicitudes relacionadas Esta solicitud reivindica prioridad sobre la solicitud de patente provisional Australiana Núm. 2007903309, presentada el 20 de Junio de 2007, y la solicitud de patente provisional Australiana Núm. 2008901466, presentada el 26 de Marzo de 2008.

Campo de la invención La presente invención hace referencia a la resistencia al estrés en plantas, tales como la resistencia a la sequía, la resistencia a la sal, la resistencia al calor o al frío, la resistencia a la luz y la resistencia al pH, y a los métodos y materiales para incrementar la resistencia al estrés en plantas, y para escrutar en las plantas mutaciones que están asociadas con un incremento en la resistencia al estrés. La invención también se refiere a los métodos y materiales para retrasar el comienzo de la floración en las plantas y para alterar la forma de las hojas de las plantas.

Antecedentes de la invención El mayor efecto limitante en los rendimientos de cultivos en todo el mundo es el estrés abiótico, que causa una pérdida media de más de 50% del rendimiento potencial (Boyer, J. S. (1982) , "Plant Productivity and Environment" Science 218 (4571) : 443-448) . Los estreses abióticos incluyen temperaturas extremas, salinidad, suelos ácidos, altas intensidades de luz, sequía y combinaciones de los mismos.

Puesto que las plantas son sésiles y no pueden escapar de estas condiciones, responden cambiando su compostura, morfología y fisiología de proteínas y metabolitos. Estos cambios permiten a la planta limitar el daño adaptándose a las condiciones de estrés y también reparar el daño causado por el estrés.

Estos cambios están mediados por procedimientos que detectan el estrés y/o sus efectos sobre la planta y activan múltiples rutas de señalización complejas. Las diferentes rutas son activadas dependiendo del tipo de condiciones de estrés experimentadas por la planta pero a menudo hay un solapamiento y una interacción entre las rutas. Este solapamiento puede conducir a una tolerancia cruzada, que es la tolerancia a múltiples tipos de estrés a pesar de la exposición a un estrés solamente. Esto es importante ya que los estreses raramente se producen de manera aislada. Por ejemplo el estrés por frío ocasionará también un estrés por exceso de luz ya que el frío hace que el metabolismo de la planta se ralentice y aún así todavía es capaz de recoger tanta energía lumínica como antes. Del mismo modo la sequía puede ocasionar estrés por calor ya que los estomas se cierran para conservar el agua pero como resultado pierden el efecto refrigerante de la transpiración, dando como resultado estrés por calor. Además en la naturaleza raramente existen condiciones de estrés aisladas. En Australia sería posible que un cultivo experimentara estés por sequía y exceso de luz al mismo tiempo.

Aunque algunos componentes de las rutas de señalización de estrés han sido estudiadas, debido a la complejidad de las rutas de respuesta al estrés, la posición de estos componentes en las rutas y sus interacciones con otros componentes son escasamente comprendidas y por consiguiente los métodos existentes para mejorar la resistencia al estrés de las plantas son limitados.

De este modo, existe la necesidad de nuevos métodos para producir plantas con un incremento en la tolerancia al estrés.

Compendio de la invención Las presentes investigaciones han mostrado sorprendentemente que las mutaciones en el gen SAL1 que dan como resultado una actividad reducida o nula asociada con la proteína SAL1, producen una resistencia al estrés de las plantas mutantes.

De este modo, de acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un método para obtener una planta con un incremento en la resistencia al estrés con respecto a una planta de tipo salvaje, en donde dicha resistencia al estrés se selecciona entre la resistencia a la sequía y la resistencia a estreses asociados con rutas mediadas por especies reactivas del oxígeno, comprendiendo dicho método:

(a) introducir al menos una mutación o ácido nucleico exógeno en el genoma de una o más células vegetales lo que da como resultado una reducción de la actividad asociada con SAL1 o un homólogo de la misma en dichas una o más células vegetales;

(b) regenerar una o más plantas a partir de dichas una o más células vegetales; y

(c) seleccionar una o más plantas que tienen un incremento en la resistencia a la sequía y/o resistencia a estreses asociados con las rutas mediadas por especies reactivas del oxígeno con respecto a una planta de tipo salvaje.

Se puede introducir al menos una mutación o ácido nucleico exógeno por medio de cualquier método apropiado conocido en la técnica. Por ejemplo, se pueden introducir mutaciones mediante técnicas mutagénicas químicas o físicas, o utilizando métodos de mutación insercional tales como transposones o ADN-T, y se puede introducir ácido nucleico exógeno mediante métodos recombinantes empleando, por ejemplo, penetración celular ayudada por agentes químicos (utilizando, por ejemplo, calcio, litio, PEG) , electroporación, microinyección, transfección mediada por liposomas, bombardeo con micropartículas (biolística) , transformación mediada por Agrobacterium, infección con virus, fusión de protoplastos o cualquier otro método apropiado conocido en la técnica.

De acuerdo con una realización de la invención, el método comprende la introducción de al menos una mutación en el gen SAL1 o un homólogo del mismo, o la inhibición o supresión de la expresión del gen SAL1 o un homólogo del mismo.

Se puede introducir al menos una mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica SAL1 o un homólogo de la misma en dichas una o más células vegetales, y puede comprender una inserción, deleción o sustitución de uno o más nucleótidos.

De acuerdo con otra realización, la mutación puede comprender una inserción, deleción o sustitución de uno o más nucleótidos en la región de los nucleótidos 731 a 745, 1226, 1518, 1519, y 1690 del SEQ ID NO: 1, o una posición equivalentes en un homólogo de al menos los nucleótidos 191-1991 del SEQ ID NO: 1.

De acuerdo con otra realización, la mutación puede comprender una mutación de guanina a adenina en la en la posición 1226 del SEQ ID NO: 1, o una posición equivalente en un homólogo de al menos los nucleótidos 191-1991 del SEQ ID NO: 1. La mutación resultante puede dar como resultado un cambio de aminoácido de glicina a ácido aspártico en la posición 217 del SEQ ID NO: 2.

De acuerdo con otra realización, la mutación puede comprender una mutación de citosina a timina en la posición 731 del SEQ ID NO: 1, o una posición equivalente en un homólogo de al menos los nucleótidos 191-1991 del SEQ ID NO: 1. La mutación resultante puede dar como resultado un cambio de aminoácido de alanina a valina en la posición 124 del SEQ ID NO: 2.

De acuerdo con otra realización, la mutación puede comprender una mutación de guanina a adenina en la posición 736 del SEQ ID NO: 1, o una posición equivalente en un homólogo de al menos los nucleótidos 191-1991 del SEQ ID NO: 1. La mutación resultante puede dar como resultado un cambio de aminoácido de ácido glutámico a lisina en la posición 126 del SEQ ID NO: 2.

De acuerdo con otra realización, la mutación puede comprender una mutación de guanina a adenina en la posición 1690 del SEQ ID NO: 1, o una posición equivalente en un homólogo de al menos los nucleótidos 191-1991 del SEQ ID NO: 1.

De acuerdo con otra realización, la mutación puede comprender la inserción de uno o más nucleótidos entre las posiciones 734 y 735 del SEQ ID NO: 1, o una posición equivalente en un homólogo de al menos los nucleótidos 191-1991 del SEQ ID NO: 1, o la mutación puede comprender la sustitución de los nucleótidos 735-745 del SEQ ID NO: 1, o nucleótidos equivalentes en un homólogo de al menos los nucleótidos 191-1991 del SEQ ID NO: 1 con uno o más nucleótidos.

De acuerdo con otra realización, la mutación puede comprender la inserción de uno o más nucleótidos entre o incluyendo las posiciones 1518 y 1519 del SEQ ID NO: 1, o una posición equivalente en un homólogo de al menos los nucleótidos 191-1991 del SEQ ID NO: 1.

De acuerdo con una realización, la mutación puede ser una mutación nula de SAL1.

De acuerdo con otra realización más, un método de la invención puede comprender la introducción en dichas una o más células vegetales de un ácido nucleico que inhibe la expresión de SAL1 endógena o un homólogo de la misma,

o que remplaza la expresión de... [Seguir leyendo]

1. Un método para obtener una planta con una mayor resistencia al estrés con respecto a una planta de tipo salvaje, donde dicha resistencia al estés se selecciona entre resistencia a la sequía y resistencia a estreses asociados con rutas mediadas por especies de oxígeno reactivo, comprendiendo dicho método:

(a) introducir al menos una mutación o un ácido nucleico exógeno en el genoma de una o más células vegetales, lo que da como resultado una reducción de la actividad asociada con SAL1 o uno de sus homólogos en dichas una o más células vegetales;

(b) regenerar una o más plantas a partir de dichas una o más células vegetales; y

(c) seleccionar una o más plantas que tienen una mayor resistencia a la sequía y/o resistencia asociada a estreses asociados con rutas mediadas por especies reactivas de oxígeno con respecto a una planta de tipo salvaje.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el método comprende introducir una mutación en el gen SAL1 o uno de sus homólogos, o inhibir o suprimir la expresión del gen SAL1 o uno de sus homólogos.

3. El método de la reivindicación 2, que comprende introducir una mutación en el gen SAL1 que comprende una inserción, deleción o sustitución de uno o más nucleótidos en la región de nucleótidos 731 a 745, 1226, 1518, 1519, y 1690 del SEQ ID NO: 1, o una posición equivalente un homólogo de al menos los nucleótido.

19. 1991 del SEQ ID NO: 1.

4. El método de la reivindicación 3, en donde dicha mutación:

i) comprende una mutación de guanina a adenina en la posición 1226 del SEQ ID NO: 1, o una posición equivalente en un homólogo de al menos los nucleótido.

19. 1991 del SEC ID NO: 1;

ii) da como resultado un cambio de aminoácido de glicina a ácido aspártico en la posición 217 del SEQ ID NO: 2;

iii) comprende una mutación de citosina a timina en la posición 731 del SEQ ID NO: 1, o una posición equivalente en un homólogo de al menos los nucleótido.

19. 1991 del SEC ID NO: 1;

iv) comprende una mutación de guanina a adenina en la posición 736 del SEC ID NO: 1, o una posición equivalente de un homólogo de al menos los nucleótido.

19. 1991 del SEC ID NO: 1;

v) comprende una mutación de guanina a adenina en la posición 1690 del SEC ID NO: 1, o una posición equivalente en un homólogo de al menos los nucleótido.

19. 1991 del SEC ID NO: 1;

vi) comprende la inserción de uno o más nucleótidos entre las posiciones 734 y 735 del SEC ID NO: 1, o una posición equivalente en un homólogo de al menos los nucleótido.

19. 1991 del SEC ID NO: 1;

vii) comprende la sustitución de los nucleótido.

73. 745 del SEC ID NO: 1, o nucleótidos equivalentes en un homólogo de al menos los nucleótido.

19. 1991 de SEQ ID NO: 1 por uno o más nucleótidos, o viii) comprende la inserción de uno o más nucleótidos entre o incluyendo las posiciones 1518 y 1519 del SEC ID NO: 1, o una posición equivalente en un homólogo de al menos los nucleótido.

19. 1991 del SEC ID NO: 1.

5. El método de la reivindicación 4, en donde dichos uno o más nucleótidos insertados o sustituidos comprenden una inserción de ADN-T.

6. El método de la reivindicación 2 o 3, en el que dicha mutación es una mutación nula para SAL1.

7. El método de la reivindicación 2, que comprende introducir en dichas una o más células vegetales ácido nucleico exógeno que suprime la expresión de la proteína SAL1 endógena o uno de sus homólogos.

8. El método de la reivindicación 7, en donde dicho ácido nucleico exógeno comprende una secuencia de ácido nucleico homóloga a, o complementaria a al menos una porción de la secuencia codificante de SAL1 endógena o uno de sus homólogos.

9. El método de la reivindicación 7 u 8, en donde dicho ácido nucleico exógeno está conectado operablemente a un promotor inducible por estrés.

10. El método de la reivindicación 2, que comprende introducir en dichas una o más células vegetales ácido nucleico exógeno que remplaza la expresión de la proteína SAL1 endógena o uno de sus homólogos por la expresión de una proteína exógena.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la planta resultante tiene un incremento de la resistencia a la sequía, o al estrés por luz, o resistencia a la sequía y a la luz, con respecto a una planta de tipo salvaje.

12. El método de la reivindicación 11, en donde la planta resultante tiene un incremento de resistencia a la sequía con respecto a una planta de tipo salvaje.

13. El método de la reivindicación 12, en donde dicha planta es un miembro de la familia Brassicaceae.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde la planta resultante tiene un tiempo de floración retardado.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la planta resultante tiene un fenotipo foliar alterado, y en donde dicho fenotipo foliar alterado comprende una hoja más gruesa, una hoja más corta, un peciolo más corto, una hoja más redonda, una hoja con bordes más lobulados , o una hoja con dos o más de las alteraciones fenotípicas alteradas seleccionadas entre hoja más gruesa, hoja más corta, pecíolo más corto, hoja más redondeada, y bordes lobulados.

16. Un método para escrutar una planta para determinar el aumento de su resistencia al estrés con respecto a una planta de tipo silvestre, comprendiendo dicho método analizar el ADN de la planta para determinar la presencia de al menos un alelo mutante de una secuencia de nucleótidos que codifica SAL1 o uno de sus homólogos utilizando al menos una molécula de ácido nucleico adecuada como sonda o cebador que es capaz de hibridar con un gen SAL1

o uno de sus homólogos en condiciones restrictivas.

17. El método de la reivindicación 16, que comprende el uso de al menos un par de cebadores oligonucleotídicos adecuados para la amplificación de una región del gen SAL1 o uno de sus homólogos, comprendiendo dicho par de cebadores un cebador directo y un cebador inverso para detectar la presencia o ausencia de una mutación en dicha región.

18. Una planta con un incremento de resistencia al estrés con respecto a una planta de tipo salvaje, obtenida mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, con la condición de que dicha planta no sea un mutante alx8, fr y 1-1, fr y 1-2, fr y 1-3, salk_02882, o hos2 de Arabidopsis thaliana.

19. Una planta con un incremento de resistencia al estrés con respecto a una planta de tipo salvaje, obtenida mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde dicha planta se selecciona entre Apiaceae, Asteraceae, ChenopodiaceaelAmaranthaceae, Compositae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Gramineae, Leguminosae, Poaceae, Rosaceae o Solanaceae.