Método y aparato para aplicar fluidos a una muestra biológica.

Un método automatizado que pone en contacto una muestra biológica situada en un portaobjetos para microscopio con una solución que contiene una biomolécula conjugada

, que consiste en desplazar una superficie curvada humedecida con la solución cerca de dicha muestra biológica de manera que la distancia que separa dicha superficie curvada humedecida y dicha muestra biológica sea suficiente para formar una capa de menisco líquida que se desplaza entre las dos.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2005/026014.

Solicitante: VENTANA MEDICAL SYSTEMS, INC..

Inventor/es: REINHARDT,KURT, LEMME,Charles,D. .

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/543 (con un soporte insoluble para la inmovilización de compuestos inmunoquímicos)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/53 (Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Muestreo; Preparación de muestras para la investigación... > G01N1/31 (Aparatos a este efecto)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Muestreo; Preparación de muestras para la investigación... > G01N1/30 (Tintura; Impregnación)

PDF original: ES-2505253_T3.pdf

 

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Ilustración 1 de Método y aparato para aplicar fluidos a una muestra biológica.
Ilustración 2 de Método y aparato para aplicar fluidos a una muestra biológica.
Ilustración 3 de Método y aparato para aplicar fluidos a una muestra biológica.
Ilustración 4 de Método y aparato para aplicar fluidos a una muestra biológica.
Ilustración 5 de Método y aparato para aplicar fluidos a una muestra biológica.
Ilustración 6 de Método y aparato para aplicar fluidos a una muestra biológica.
Método y aparato para aplicar fluidos a una muestra biológica.

Fragmento de la descripción:

Método y aparato para aplicar fluidos a una muestra biológica Fundamento

1. Campo de la invención

La Invención va dirigida generalmente a la automación del tratamiento de muestras biológicas, y en particular a un método y aparato para la tinción automatizada de muestras biológicas usando un método a base de un volumen mínimo de fluido tangencial.

2. Descripción de métodos relacionados

La tinción de preparados celulares o piezas de biopsia para la visualización morfológica es un método antiguo de hace más de cien años frente a los estándares modernos. Recientemente se han hecho esfuerzos por automatizar el procedimiento de aplicar diferentes tipos de colorantes químicos y moléculas de conjugado biológico a las secciones tlsulares. Los Instrumentos que se han diseñado para dicho fin incluyen la línea de Ventana Medical Systems de Instrumentos a base de un carrusel dual como la 32/ES®, NexES®, BENCHMARK® y la BENCHMARK® ST. Las patentes que describen estos sistemas Incluyen la US 559577, 5654199, 693574 y 629689. Otro tipo de pigmento o coloración automatizada es la línea de pigmentos TechMate® descrita en US 5355439 y 5737499.

La velocidad de tinción ¡nmunohlstoquímlca y de hibridación in situ del tejido fijado seccionado sobre un portaobjetos de microscopio se encuentra limitada por la velocidad a la cual las biomoléculas conjugadas se pueden difundir por el tejido fijado desde una solución acuosa situada en contacto directo con la sección de tejido. Normalmente, el tejido se fija Inmediatamente después de su escisión colocándolo en una solución de formaldehído del 1%, que Impide que el tejido sea destruido autocatalítlcamente por la reticulación de las proteínas a través de los puentes de metlleno. Este tejido retlculado presenta muchas barreras adicionales a la difusión que incluyen las membranas blcapa llpídlcas que envuelven cada una de las células y orgánulos, y los efectos antes mencionados de la reticulación que genera el proceso de fijación. Las biomoléculas conjugadas (anticuerpos o moléculas de muestra ADN) son relativamente grandes, y su tamaño oscila entre unos kilodaltons y varios cientos de kilodaltons, lo que les obliga a difundirse lentamente en el tejido sólido durante un tiempo determinado, es decir entre varios minutos y unas pocas horas. Las condiciones de incubación típicas son de treinta minutos a 37°C.

La velocidad de difusión viene dada por un gradiente de concentración de manera que la velocidad se puede incrementar aumentando la concentración del conjugado en el reactivo. Sin embargo, esto tiene dos efectos perjudiciales. En primer lugar, los conjugados son a menudo muy caros, por lo que aumentar su concentración no vale la pena y tampoco es viable desde el punto de vista económico. En segundo lugar, la cantidad excesiva de conjugado que entra en el tejido queda atrapada en el tejido si se usan grandes concentraciones, y es difícil eliminarla además de provocar unos niveles elevados de color de base no específico. Esta tinción no específica es únicamente ruido. Para reducir el ruido y aumentar la señal de tinción específica, la práctica habitual aconseja utilizar concentraciones bajas de conjugado con largos tiempos de incubación para permitir que el conjugado se encuentre y una solamente a las zonas específicas.

La automación de los procesos previamente manuales de la tinción accionada por difusión únicamente ha incrementado estos problemas debido a las acumulaciones necesariamente grandes de reactivos. Los actuales instrumentos de tinción de histología utilizan volúmenes relativamente grandes de reactivo (1 pl) en unos 3 pl de tampón, tal como revelan las patentes americanas publicadas 6.352.861, 6.296.89 y otras. Esto da lugar a una concentración relativamente baja del reactivo conjugado en el líquido que queda sobre el tejido. Los instrumentos actuales miden el reactivo alternando los chorros de aire tangencial sobre una capa de aceite sobrenadante que gira y contragira cuando entra en contacto debido a los chorros de aire, haciendo que se desplace la capa acuosa que se encuentra debajo. La mezcla es lenta y no especialmente Intensa y crea la evaporación de los tejidos que deberá ser contrarrestada. La capa de aceite minimiza la evaporación del lodo acuoso cubriéndolo con una capa de aceite a baja presión de vapor. Finalmente, los Instrumentos actuales utilizan grandes volúmenes de líquido para desplazar físicamente los grandes charcos de reactivo de reactivos de baja concentración que están cubiertos con aceite. Este método de lavado produce grandes volúmenes de líquido desechable que se puede clasificar como residuo peligroso, y en cualquier caso puede físicamente romper el tejido por la vigorosa acción del lavado.

Sigue existiendo la necesidad de una Introducción más rápida de biomoléculas en las secciones de tejido para un procesamiento más rápido y el uso de menor volumen de reactivo.

Resumen de la Invención

La configuración se dirige a un método de contacto de una muestra biológica con una solución que comprenda la etapa de desplazamiento de una superficie curvada humedecida con una solución cerca de dicha muestra biológica,

de tal manera que la distancia que separe dicha superficie curvada humedecida y dicha muestra biológica sea suficiente para formar una capa de menisco líquida entre las dos.

La invención también va dirigida a un aparato para contactar una muestra biológica que se sospecha contiene un biomarcador con una solución que contiene una biomolécula conjugada, que comprende una plataforma para soportar un portaobjetos de microscopio en el que se encuentra una muestra biológica; una tapa deslizante que tiene una superficie inferior curvada situada sobre la plataforma, estando la superficie inferior curvada cerca de una muestra biológica cuando está en funcionamiento; un medio para desplazar la tapa deslizante hacia delante y hacia detrás de la muestra biológica; y un medio para aplicar y retirar la solución líquida que contenga las biomoléculas conjugadas de la tapa.

Breve descripción de las figuras

Figura 1 es una vista en alzado del lado derecho

Figura 2 es una vista en alzado alternativa del lado izquierdo, parcialmente seccionada por el centro de la tapa.

Figura 3 es una visión transversal del lado izquierdo, de nuevo parcialmente seccionada por la tapa,

Figura 4 es un detalle de la zona seccionada de la tapa deslizante, el reactivo retenido y su menisco,

Figura 5 es una vista en alzado de una configuración alternativa que muestra una tapa oscilante sobre un portaobjetos,

Figura 6 es una vista en alzado de una configuración alternativa que muestra un mecanismo de contacto a base de una membrana que incluye un tambor de almacenamiento, un tambor rebobinador y una tapa giratoria.

Descripción de las configuraciones preferidas

La invención va dirigida a un método para poner en contacto una muestra biológica que se sospecha contiene un biomarcador con una solución, que comprende la etapa de desplazar una superficie curvada humedecida con una solución que contiene la biomolécula conjugada cerca de la muestra biológica de manera que la distancia que separa la superficie curvada humedecida y la muestra biológica sea suficiente para formar una capa de menisco líquido que se desplace entre las dos.

El concepto de la invención es relativamente simple, incluso elegante. Con respecto a las figuras en general se coloca sobre el portaobjetos del microscopio 6 una superficie curvada 3 próxima a unas 1-1 mieras, de la superficie del portaobjetos. Puesto que la sección más gruesa del tejido o de la muestra biológica 5 es normalmente de 4 a 6 mieras, y como máximo de 32 mieras, esto permite que... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método automatizado que pone en contacto una muestra biológica situada en un portaobjetos para microscopio con una solución que contiene una biomolécula conjugada, que consiste en desplazar una superficie curvada humedecida con la solución cerca de dicha muestra biológica de manera que la distancia que separa dicha superficie curvada humedecida y dicha muestra biológica sea suficiente para formar una capa de menisco líquida que se desplaza entre las dos.

2. El método de la reivindicación 1 en el que dicha solución contiene una biomolécula conjugada que se elige del grupo formado por un anticuerpo, una muestra de ARN/ADN, o bien un colorante químico o una sustancia química utilizada en la detección.

3. El método de la reivindicación 1 en el que dicha muestra biológica es una sección tisular, un preparado celular o una secuencia de ARN/ADN, tejido, proteína o péptido.

4. El método de la reivindicación 1 en el que dicho tejido contiene un biomarcador elegido del grupo formado por un antígeno, un epítopo, una proteína celular o una secuencia de ADN/ARN.

5. El método de la reivindicación 1 en el que dicha superficie curvada se ha fabricado a base de metal, plástico o cerámica.

6. El método de la reivindicación 1 en el que dicha superficie curvada es convexa con respecto a la superficie del portaobjetos del microscopio.

7. El método de la reivindicación 1 en el que dicha superficie curvada se desplaza de un modo rectilíneo básicamente paralelo a la superficie superior del portaobjetos del microscopio y sobre la superficie de la muestra biológica.

8. El método de la reivindicación 1 en el que la distancia que separa dicha superficie curvada humedecida y dicha muestra biológica equivale a unas 1 mieras hasta 1 mieras.

9. El método de la reivindicación 1 en el que la etapa de desplazamiento de la superficie curvada es controlada por ordenador.

1. Aparato para poner en contacto una muestra biológica (5) que se sospecha contiene un biomarcador con una solución que contiene una biomolécula conjugada (4), que comprende:

(a) Una plataforma para soportar un portaobjetos para microscopio (6) en el que se encuentra dicha muestra

biológica (5);

(b) Una tapa deslizante (1) que tiene una superficie inferior curvada (3) que está cerca de dicha muestra biológica (5) cuando está en marcha;

(c) Un medio para mover dicha tapa deslizante (1) hacia delante y hacia detrás de dicha muestra biológica (5) y

(d) Un medio para aplicar y retirar el líquido de dicha tapa (1)

11. El aparato o dispositivo de la reivindicación 1 en el que dicha plataforma es capaz de calentar un

portaobjetos (6) situado en la misma.

12. El aparato de la reivindicación 1 en el que dicha tapa (1) cubre básicamente el ancho de dicho portaobjetos para microscopio (6).

13. El aparato de la reivindicación 1 en el que dicha tapa (1) es de plástico o de cerámica.

14. El aparato de la reivindicación 1 en el que dicha tapa (1) tiene una superficie inferior curvada (3) capaz

de soportar un menisco de líquido (4) formado entre dicha superficie inferior curvada (3) y la superficie superior del portaobjetos.

15. El aparato de la reivindicación 1 en el que dicha superficie inferior curvada (3) tiene un radio de aproximadamente 25 mm.

16. El aparato de la reivindicación 1 en el que la parte inferior de la zona de la tapa (1) que forma el menisco es de ,1 a aproximadamente ,1 mm que sobresalen de la superficie del portaobjetos.

17. El aparato de la reivindicación 1 en el que dicho medio para desplazar dicha tapa deslizante (1) hacia delante y hacia detrás consta de una varilla (12) conectada a dicha tapa (1) por un extremo, y de un mecanismo para impartir movimiento a dicha tapa (1) en el otro extremo.

18. El aparato de la reivindicación 17 en el que dicha varilla (12) consta además de un elemento verticalmente flexible (14) conectado a dicha tapa (1) en un primer extremo y a dicha varilla (12) en su segundo extremo.

19. El aparato de la reivindicación 1 en el que dicho medio para aplicar y retirar el líquido a y de dicha tapa

(1) consta de una almohadilla (11) que se adapta para aplicar el líquido a dicha tapa (1) cuando la tapa se acerca

a dicha almohadilla (11).

2. El aparato de la reivindicación 1 en el que dicho medio para aplicar el líquido a dicha tapa (1) consta de un dispositivo pipeteador para aplicar los líquidos a dicha tapa (1).

21. Aparato automático para introducir una biomolécula conjugada en una muestra biológica (5) que se sospecha contiene un biomarcador, que comprende

(a) Una plataforma para sujetar un portaobjetos de microscopio (6) que tiene una muestra biológica (5);

(b) Una tapa deslizante (1) que tiene una superficie inferior curvada (3) situada sobre dicha plataforma,

estando dicha superficie curvada (3) cerca de dicha muestra biológica (5) cuando está en funcionamiento;

(c) Medio para desplazar dicha tapa deslizante (1) hacia delante y hacia detrás sobre la muestra biológica (5);

(d) Medio para aplicar y retirar el líquido (4) de dicha tapa (1); y

(e) Medio para controlar electrónicamente todas las acciones de dicho aparato