Derivados estables de NAD/NADH.

Elemento de ensayo para la determinación de glucosa, que comprende (i) una glucosa-deshidrogenasa

(EC 1.1.1.47) y (ii) como coenzima un compuesto de la siguiente fórmula general (I):**Fórmula**

en el cual

A ≥ adenina o un análogo de ella,

T ≥ O, S respectivamente independientes,

U ≥ OH, SH, BH3

-, BCNH2

- respectivamente independientes,

V ≥ OH respectivamente independiente o un grupo fosfato, de modo que en caso de que un radical V sea un grupo OH y el segundo radical V un grupo fostato, el grupo OH y el grupo fostato pueden formar un anillo con los átomos de carbono a los que están unidos;

W ≥ COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2, donde R ≥ H o alquilo C1-C2 respectivamente independientes, X1, X2 ≥ O, CH2, CHCH3, C(CH3)2, NH, NCH3 respectivamente independientes,

Y ≥ NH, S, O, CH2,

Z ≥ un radical, incluyendo un grupo cíclico de 5 átomos de C que puede llevar un heteroátomo escogido entre O, S y N, así como uno o más sustituyentes, y un radical CR42 unido al grupo cíclico y a X2, donde

R4 ≥ H, F, Cl, CH3 respectivamente independientes,

con la condición de que Z y el radical piridino no estén unidos por un enlace glicosídico, o una sal o, dado el caso, una forma reducida del mismo.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2006/007493.

Solicitante: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG.

Nacionalidad solicitante: Suiza.

Dirección: GRENZACHERSTRASSE, 124 4070 BASEL SUIZA.

Inventor/es: HEINDL, DIETER, HOENES, JOACHIM, DR., HORN, CARINA, GAESSLER-DIETSCHE,CLAUDIA.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS;... > C07H21/00 (Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS;... > Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido... > C07H21/02 (con ribosilo como radical sacárido)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/32 (una deshidrogenosa)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS;... > Compuestos que contienen un heterociclo que comparten... > C07H19/207 (siendo los ácidos fosfóricos o polifosfóricos esterificados por otro compuesto hidroxílico, p. ej. los dinucleótidos de la flavina-adeína o de la nicotinamida-adenina)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS;... > C07H23/00 (Compuestos que contienen boro, silicio o un metal, p. ej. quelatos, vitamina B 12 (ésteres de ácidos inorgánicos C07H 11/00; sales metálicas, ver los compuestos principales))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS;... > Compuestos que contienen un heterociclo que comparten... > C07H19/213 (que contienen un fosfato cíclico)

PDF original: ES-2461266_T3.pdf

 

google+ twitter facebook

Fragmento de la descripción:

Derivados estables de NAD/NADH

La presente invención se refiere a derivados estables del nicotinamida-adenina-dinucleótido (NAD/NADH) o del nicotinamida-adenina-dinucleótido fosfato (NADP/NADPH) , a complejos enzimáticos de estos derivados y a su uso en métodos de detección bioquímicos y en kits de reactivos.

Los sistemas bioquímicos de medición son componentes importantes de métodos analíticos clínicamente relevantes. En primer plano figura la medición de analitos, p.ej. de metabolitos o substratos, los cuales se determinan directa o indirectamente con la ayuda de un enzima. En este caso los analitos se hacen reaccionar con un complejo enzimacoenzima y a continuación se cuantifican. Para ello, el analito determinado se pone en contacto con un enzima y un coenzima adecuados, empleando en la mayoría de los casos cantidades catalíticas del enzima. Como resultado de la reacción enzimática el coenzima se modifica, p.ej. se oxida o se reduce. Este proceso se puede registrar mediante métodos electroquímicos o fotométricos, bien directamente o a través de un mediador. Mediante una calibración se obtiene una relación directa entre el valor medido y la concentración del analito buscado.

Los coenzimas son moléculas orgánicas unidas a un enzima por enlace covalente o no covalente que se modifican por la reacción del analito. Son ejemplos importantes de coenzimas el nicotinamida-adenina-dinucleótido (NAD) y el nicotinamida-adenina-dinucleótido fosfato (NADP) , de los cuales se forma por reducción NADH y NADPH.

Los sistemas de medición conocidos del estado técnico se caracterizan por un tiempo de estabilidad limitado y por especiales requerimientos ambientales, como refrigeración o almacenamiento en lugar seco, para conseguir esta estabilidad. Por tanto en determinadas formas de aplicación, p.ej. en pruebas realizadas por el usuario final, tales como el autocontrol de glucosa en sangre, pueden aparecer resultados erróneos debido a un mal almacenamiento inadvertido. En particular el agotamiento de los desecantes por una apertura demasiado prolongada de los envases primarios puede dar lugar a mediciones erróneas, que en algunos sistemas apenas son reconocibles por el usuario.

Una medida conocida que se aplica para aumentar la estabilidad de los sistemas bioquímicos de medición es el uso de enzimas más estables, p.ej. de enzimas procedentes de organismos termófilos. También cabe la posibilidad de estabilizar los enzimas por modificación química, p.ej. mediante reticulación o mutagénesis. Asimismo se pueden añadir estabilizantes de enzimas como p.ej. trehalosa, polivinilpirrolidona y albúmina sérica o incluir los enzimas en matrices poliméricas, p.ej. por fotopolimerización.

Además se intenta mejorar la estabilidad de los sistemas bioquímicos de medición utilizando mediadores estables. Así, el uso de mediadores con el menor potencial redox posible aumenta la especificidad de los ensayos y elimina interferencias durante la reacción. Los potenciales redox de los complejos enzima/coenzima constituyen un límite inferior para el potencial redox de los mediadores. Por debajo de dichos potenciales la reacción con los mediadores se frena o incluso se inhibe.

Como alternativa también se pueden emplear sistemas bioquímicos de medición sin mediadores, con los cuales se detectan directamente los coenzimas, p.ej. el coenzima NADH. Sin embargo estos sistemas de medición tienen el inconveniente de que los coenzimas como NAD y NADP son inestables.

El NAD y el NADP son moléculas sensibles a los álcalis, cuyas vías de degradación están descritas en la literatura (N.J. Oppenheimer in The Pyridine Nucleotide Coenzyms Academic Press New York, London 1982, editado por J. Everese, B. Anderson, K. You, capítulo 3, páginas 56-65) . Al descomponerse el NAD y el NADP se forma sobre todo ADP-ribosa por disociación de los enlaces de glicosilo entre la ribosa y la unidad de piridina. En cambio las formas reducidas NADH y NADPH son sensibles a los ácidos: p.ej. la epimerización es una vía de degradación conocida. En ambos casos la inestabilidad de NAD/NADP y NADH/NADPH es debida a la labilidad del enlace glicosilo entre la ribosa y la unidad de piridina. No obstante, en condiciones menos drásticas, como p.ej. en solución acuosa, también tiene lugar la hidrólisis de los coenzimas NAD y NADP solo por efecto de la humedad ambiental. Esta inestabilidad puede producir inexactitudes en la medición de analitos.

En B.M. Anderson, Pyridine Nucleotide Coenzymes, Academic Press, Nueva York, Londres 1982 , editado por J. Everese, B. Anderson, K. You, capítulo 4, p.ej., se describe una serie de derivados de NAD/NADP. Sin embargo la mayoría de estos derivados no son bien admitidos por los enzimas. El único derivado que ha sido utilizado hasta la fecha para ensayos diagnósticos es el 3-acetilpiridina-adenina-dinucleótido (acetil-NAD) , descrito por primera vez en 1956 (N.O. Kaplan, J. Biol. Chem. (1956) , 221, 823) . Este coenzima también muestra una baja aceptación por los enzimas y varía el potencial redox.

En la patente WO 01/94370 se describe el uso de otros derivados de NAD con un grupo piridino modificado. Sin embargo las modificaciones del grupo nicotinamida tienen en general una influencia directa en la reacción catalítica, que en la mayoría de los casos es negativa.

Siguiendo otro concepto de estabilización se modificó la unidad de ribosa para controlar la estabilidad del enlace glicosilo. Este procedimiento no interfiere directamente en la reacción catalítica del grupo nicotinamido, pero puede haber una influencia indirecta en cuanto el enzima presente una unión fuerte y específica a la unidad de ribosa. A este respecto Kaufmann y otros revelan en las patentes WO 98/33936 y US 5, 801, 006 o WO 01/49247 una serie de derivados de tiorribosa-NAD. Sin embargo hasta ahora no se ha demostrado ninguna relación entre la modificación de la unidad de nicotinamida-ribosa y la actividad de los derivados en las reacciones enzimáticas.

El CarbaNAD, un derivado sin enlace glicosilo, se describió por primera vez en 1988 (J.T. Slama, Biochemistr y 1989, 27, 183 y Biochemistr y 1989, 28, 7688) . Aquí la ribosa se sustituye por una unidad de azúcar carbocíclico. Aunque el 10 CarbaNAD fue descrito como substrato para deshidrogenasas, su actividad en procedimientos clínicos de detección bioquímica no ha sido comprobada hasta la fecha.

Con posterioridad G.M. Blackburn, Chem. Comm., 1996, 2765 describió una formulación análoga para preparar carbaNAD con un enlace de metilenbisfosfonato en lugar del pirofosfato natural. El metilenbisfosfonato muestra 15 mayor estabilidad frente a las fosfatasas y se usó como inhibidor de ADP-ribosilciclasa. El objetivo no era aumentar la estabilidad a la hidrólisis (J.T. Slama, G.M. Blackburn) .

Por tanto la presente invención tiene por objeto proporcionar sistemas estables de medición bioanalítica, sobre todo para la determinación de glucosa, que eviten la sensibilidad a la hidrólisis de NAD/NADP y al mismo tiempo actúen 20 como coenzimas en las reacciones enzimáticas.

Este objetivo se resuelve mediante un elemento de ensayo para la determinación de glucosa, que comprende (i) una glucosa-deshidrogenasa (EC 1.1.1.47) y (ii) como coenzima un compuesto de la siguiente fórmula general (I) :

en el cual A = adenina o un análogo de ella, T = O, S respectivamente independientes,

U = OH, SH, BH3-, BCNH2- respectivamente independientes,

V = OH respectivamente independiente o un grupo fosfato, de modo que en caso de que un radical V sea un grupo OH y el segundo radical V un grupo fostato, el grupo OH y el grupo fostato pueden formar un anillo con los átomos de carbono a los que están unidos;

W = COOR, CON... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Elemento de ensayo para la determinación de glucosa, que comprende (i) una glucosa-deshidrogenasa (EC 1.1.1.47) y (ii) como coenzima un compuesto de la siguiente fórmula general (I) :

en el cual

A = adenina o un análogo de ella, 10 T = O, S respectivamente independientes,

U = OH, SH, BH3-, BCNH2- respectivamente independientes,

V = OH respectivamente independiente o un grupo fosfato, de modo que en caso de que un radical V sea un grupo OH y el segundo radical V un grupo fostato, el grupo OH y el grupo fostato pueden formar un anillo con los átomos de carbono a los que están unidos; 15 W = COOR, CON (R) 2, COR, CSN (R) 2, donde R = H o alquilo C1-C2 respectivamente independientes,

X1, X2 = O, CH2, CHCH3, C (CH3) 2, NH, NCH3 respectivamente independientes,

Y = NH, S, O, CH2,

Z = un radical, incluyendo un grupo cíclico de 5 átomos de C que puede llevar un heteroátomo escogido entre O, S y N, así como uno o más sustituyentes, y un radical CR42 unido al grupo cíclico y a X2, donde 20 R4 = H, F, Cl, CH3 respectivamente independientes, con la condición de que Z y el radical piridino no estén unidos por un enlace glicosídico,

o una sal o, dado el caso, una forma reducida del mismo.

2. Elemento de ensayo según la reivindicación 1, caracterizado porque los sustituyentes de Z se eligen del

grupo formado por F, Cl, así como alquilo C1-C2, que puede estar fluorado o clorado o/y sustituido con OH, O-alquilo C1-C2.

3. Elemento de ensayo según la reivindicación 1 o 2, que comprende como coenzima un compuesto de la siguiente fórmula general (I’) : 30

con

A = adenina o un análogo de ella,

35 T = U = O, S respectivamente independientes, OH, SH, BH3 -, BCNH2 - respectivamente independientes,

V = OH o un grupo fosfato respectivamente independientes,

W = COOR, CON (R) 2, COR, CSN (R) 2, donde R = H o alquilo C1-C2 respectivamente independientes,

X1, X2 = O, CH2, CHCH3, C (CH3) 2, NH, NCH3 respectivamente independientes,

40 Y = NH, S, O, CH2,

Z = un anillo carbocíclico o heterocíclico de cinco miembros, saturado o insaturado, de la fórmula general (II)

donde entre R5’ y R5” puede haber un enlace sencillo o doble, R4 = H, F, Cl, CH3 respectivamente independientes,

R5 = CR42, cuando hay un enlace sencillo entre R5’ y R5”, R5’ = O, S, NH, N-alquilo C1-C2, CR42, CHOH, CHOCH3, R5” = CR42, CHOH, CHOCH3, cuando entre R5’ y R5” hay un enlace doble R5’ = R5” = CR4, R6, R6’ = CH, CCH3 respectivamente independientes,

o una sal o, dado el caso, una forma reducida del mismo. 10

4. Elemento de ensayo según una de las reivindicaciones 1 a 3, donde W = CONH2 o COCH3.

5. Elemento de ensayo según una de las reivindicaciones 1 a 4 en forma de una tira de ensayo.

6. Compuesto de la fórmula general (I”) :

con

20 A = adenina o un análogo de ella,

T = U = O, S respectivamente independientes, OH, SH, BH3 -, BCNH2 - respectivamente independientes,

V = OH respectivamente independiente o un grupo fosfato, de modo que en caso de que un radical V sea un

grupo OH y el segundo radical V un grupo fostato, el grupo OH y el grupo fostato pueden formar un anillo

25 con los átomos de carbono a los que están unidos;

W = COOR, CON (R) 2, COR, CSN (R) 2, donde R = H o alquilo C1-C2 respectivamente independientes,

X1, X2 = O o NH respectivamente independientes,

Y = NH, S, O, CH2,

Z = un anillo carbocíclico o heterocíclico de cinco miembros, saturado o insaturado, de la fórmula general (II)

30

donde entre R5’ y R5” puede haber un enlace sencillo o doble,

R4 = H, F, Cl, CH3 respectivamente independientes, 35 R5 = CR42, cuando hay un enlace sencillo entre R5’ y R5”,

R5’ = O, S, NH, N-alquilo C1-C2, CR42, CHOH, CHOCH3,

R5” = CR42, CHOH, CHOCH3, cuando entre R5’ y R5” hay un enlace doble R5’ = R5” = CR4,

R6, R6’ = CH, CCH3 respectivamente independientes,

con la condición de que cuando R5 = CH2, T = O, U = OH respectivamente, V = OH, W = CONH2, X1, X2 = O e Y = 40 O, entonces R5’ y R5” no sean simultáneamente CHOH,

o una sal o, dado el caso, una forma reducida del mismo.

7. Compuesto según la reivindicación 6, caracterizado porque al menos un radical U es distinto de OH.

8. Compuesto según la reivindicación 6 o 7, caracterizado porque al menos un radical U = BH3-.

9. Compuesto según una de las reivindicaciones 6 a 8, en que W = CONH2 o COCH3.

10. Compuesto según una de las reivindicaciones 6 a 9, en el cual un radical V es un grupo OH y el segundo radical V un grupo fosfato.

11. Compuesto según una de las reivindicaciones 6 a 9, en el cual R5’ = CR42 o CHOH.

12. Compuesto según una de las reivindicaciones 6 a 9, en el cual R5’ = O.

13. Compuesto según una de las reivindicaciones 6 a 9, en el cual R5’ = NH o N- alquilo C1-C2.

14. Compuesto según una de las reivindicaciones 6 a 9, que es carbaNADP o una sal o una forma reducida del mismo.

15. Complejo enzima-coenzima formado por un compuesto según una de las reivindicaciones 6 a 14 combinado con un enzima adecuado.

16. Complejo según la reivindicación 15, caracterizado porque el enzima es una deshidrogenasa escogida entre una glucosa-deshidrogenasa (EC 1.1.1.47) , lactato-deshidrogenasa (EC 1.1.1.27; 1.1.1.28) , malato-deshidrogenasa (EC 1.1.1.37) , glicerina-deshidrogenasa (E.C.1.1.1.6) , alcohol-deshidrogenasa (EC 1.1.1.1) , alfa-hidroxibutiratodeshidrogenasa, sorbitol-deshidrogenasa o aminoácido--deshidrogenasa, tal como L-aminoácido-deshidrogenasa (EC 1.4.1.5) .

17. Uso de un compuesto según una de las reivindicaciones 6 a 14 o de un complejo según la reivindicación 15 o 16 para detectar un analito en una muestra mediante una reacción enzimática.

18. Kit de reactivos que comprende un compuesto según una de las reivindicaciones 6 a 14 y dado el caso un enzima o un complejo enzima-coenzima idóneos según la reivindicación 15 o 16, así como un tampón de reacción apropiado.

19. Kit de reactivos según la reivindicación 18, caracterizado porque el enzima es una deshidrogenasa escogida entre una glucosa-deshidrogenasa (EC 1.1.1.47) , lactato-deshidrogenasa (EC 1.1.1.27; 1.1.1.28) , malatodeshidrogenasa (EC 1.1.1.37) , glicerina-deshidrogenasa (E.C.1.1.1.6) , alcohol-deshidrogenasa (EC 1.1.1.1) , alfahidroxibutirato-deshidrogenasa, sorbitol-deshidrogenasa o aminoácido--deshidrogenasa, tal como L-aminoácidodeshidrogenasa (EC 1.4.1.5) .

20. Empleo del elemento de ensayo según una de las reivindicaciones 1 a 5 o del kit de reactivos según la reivindicación 18 o 19 para determinar analitos escogidos entre glucosa, ácido láctico, ácido málico, glicerina, alcohol, colesterol, triglicéridos, ácido ascórbico, cisteína, glutatión, péptidos, urea, amonio, salicilato, piruvato, 5’nucleotidasa, creatina-cinasa (CK) , lactato-deshidrogenasa (LDH) y dióxido de carbono.

21. Método para detectar un analito que comprende las etapas de

(a) poner en contacto una muestra con un elemento de ensayo según una de las reivindicaciones 1 a 5 o con un kit de reactivos según la reivindicación 18 o 19, que lleva un coenzima y

(b) detectar el analito.

22. Método según la reivindicación 21, caracterizado porque la detección del analito tiene lugar por fotometría o por fluorimetría.

Figura 1

(100%, producto crudo)

Figura 6B

Absorción

Figura 10B

Absorción

Absorción