Preparación de ácidos nucleicos.

Método de preparación de ácidos nucleicos a partir de un ácido nucleico molde en el que se somete una muestra a ciclos térmicos

, que comprende las etapas:

a) someter una primera cantidad de dicha muestra en una primera cámara de amplificación a un primer número de ciclos térmicos para prepara una primera cantidad e una primera mezclad e reacción, y

b) someter una cantidad parcial de dicha primera mezcla de reacción en una segunda cámara de amplificación a un segundo número de ciclos térmicos para preparar una segunda cantidad de una segunda mezcla de reacción,

en el que el volumen de dicha segunda cámara de amplificación es inferior al volumen de dicha primera cámara de amplificación.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E05024993.

Solicitante: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG.

Inventor/es: KOPP,MARTIN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)
  • SECCION B — TECNICAS INDUSTRIALES DIVERSAS; TRANSPORTES > PROCEDIMIENTOS O APARATOS FISICOS O QUIMICOS EN GENERAL > APARATOS DE LABORATORIO PARA LA QUIMICA O LA FISICA,... > B01L7/00 (Aparatos de calentamiento o de enfriamiento (evaporadores B01D 1/00; secado de gases o vapores, p. ej. desecadores, B01D 53/26; autoclaves B01J 3/04; hornos de secado F26B; altos hornos, hornos F27 ); Dispositivos de aislamiento térmico)

PDF original: ES-2532117_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Preparación de ácidos nucleicos Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para preparar ácidos nucleicos a partir de un ácido nucleico molde, a un dispositivo diagnóstico para preparar ácidos nucleicos a partir de un molde, a un programa informático para controlar un método para la preparación de ácidos nucleicos a partir de un ácido nucleico molde utilizando ciclos térmicos y a un producto de programa informático que comprende dicho programa, un aparato para preparar ácidos nucleicos y un método para determinar la presencia o la ausencia o la cantidad de un ácido nucleico molde en una muestra.

Antecedentes de la invención

Los métodos para la amplificación de ácidos nucleicos a partir de muestras que contienen estos ácidos nucleicos son conocidos. En los métodos in vivo, se utilizan microorganismos con un genoma manipulado genéticamente pra que contenga el ácido nucleico que debe amplificarse, con el fin de producir grandes cantidades de copias del ácido nucleico. Estos métodos son lentos y requieren mucha experimentación para conseguir una implementación exitosa. Más recientemente, se han establecido métodos in vitro para preparar grandes cantidades de ácidos nucleicos sin la participación de microorganismos. El primer método de amplificación in vitro es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), descrito en la patente EP n° 201.184. En una realización mu preferente de PCR, la muestra que contiene el ácido nucleico que debe amplificarse se somete repetidamente a un perfil de temperaturas que refleja las etapas de hibridación del cebador con el ácido nucleico diana, el alargamiento de dicho cebador para producir un producto de extensión utilizando el ácido nucleico que debe copiarse como molde y la separación del producto de extensión del ácido nucleico molde. Se aplica el perfil de temperaturas varias veces, repitiendo las etapas, entre las que se incluyen la hibridación y el alargamiento de un segundo cebador capaz de hibridarse con el producto de extensión del primer cebador. Cada perfil de temperaturas realizado repetidamente se denomina ciclo térmico.

Dicho método se ha aplicado a métodos para la determinación de ácidos nucleicos basado en la superior sensibilidad de detección proporcionada por la cantidad incrementada de ácidos nucleicos. En la patente EP n° 200.362 se da a conocer un método que utiliza la adición de una sonda capaz de hibridarse con los ácidos nucleicos formados en la mezcla de reacción y la detección de la presencia, la ausencia o la cantidad de híbridos formados como medida del ácido nucleico original en la muestra.

Más recientemente se ha encontrado que los métodos para la amplificación de ácidos nucleicos resultan tan eficaces que existe un riesgo de contaminación del medio ambiente, por ejemplo del laboratorio en el que se lleva a cabo la reacción de amplificación. Lo anterior puede producir resultados falsos positivos de detecciones posteriores. En la patente EP n° 543.942 se da a conocer un método que no requiere abrir la cámara, recipiente o tubo de reacción entre la amplificación y la detección de híbridos, para la adición de la sonda. Estos métodos se denominan métodos de amplificación y detección homogénea.

El tiempo necesario para llevar a cabo una reacción de amplificación depende en gran medida del volumen de reacción utilizado. Por ejemplo, al llevar a cabo una reacción de PCR en un volumen de 50 a 100 pl en un instrumento termociclador como el instrumento PCR System 9700 (Applied Biosystems), se requiere un tiempo de reacción de dos a cuatro horas. La mayor parte de este tiempo resulta necesario para modificar la temperatura de la mezcla de reacción para llevar a cabo los ciclos térmicos. Esta modificación puede acelerarse por varios medios. Rn primer lugar, pude modificarse la forma del recipiente de reacción para obtener una superficie incrementada que permita un régimen de calentamiento y enfriamiento más rápido. En segundo lugar, puede reducirse el volumen de reacción de manera que se requiera calentar y enfriar un volumen menor. Por estos medios algunos termocicladores como el LightCycler® (Roche Diagnostics) permiten reducir el tiempo de reacción a varios minutos en lugar de horas. Sin embargo, la utilización de volúmenes de reacción reducidos presenta la desventaja de que únicamente pueden añadirse a la reacción volúmenes reducidos de muestra, lo que reducirá proporcionalmente el límite de detección (LDD). Alternativamente, podría mantenerse el volumen de reacción y podría minimizarse la distancia de difusión térmica utilizando una celda de amplificación grande muy plana. Sin embargo, ello conduciría a un área de amplificación y un área de detección drásticamente incrementados y por ello un termociclador muy caro y cantidades enormes de desechables. Además, la superficie incrementada de dichas cámaras de reacción puede inhibir la reacción.

En el documento n° W02004/51218 se da a conocer un método para detectar diferentes analitos, en el que tras una amplificación multiplex de todos los ingredientes de la mezcla de reacción, ésta se divide en alícuotas y la alícuotas se tratar con reactivos para la amplificación específica de analitos específicos en reacciones separadas. Este método presenta la desventaja de que requiere reactivos adicionales para la segunda amplificación.

En el documento n° WO 02/20845 se da a conocer un método para evitar la formación de dímeros de cebadores mediante la utilización de una primera reacción de amplificación con una baja concentración de cebador, añadiendo

después más cebadores y realizando más etapas de amplificación. Nuevamente, este método adolece de la desventaja de que en una determinada etapa durante la amplificación, debe abrirse el tubo de reacción para añadir más reactivos. Ello resulto tanto poco conveniente para el flujo de trabajo en un laboratorio como problemático por motivos de contaminación. Además, la utilización de un termociclador estándar no permite velocidades de ciclado muy elevadas.

Ambos documentos de la técnica anterior mencionados anteriormente no presentan como objetivo acortar el tiempo de amplificación en modo alguno; de esta manera, el objetivo de la presente invención es mejorar la velocidad de la amplificación.

Descripción resumida de la invención

En un primer aspecto, la invención se refiere a un método de preparación de ácidos nucleicos a partir de un ácido nucleico molde en el que se somete una muestra a ciclos térmicos que comprende las etapas siguientes:

a) someter una primera cantidad de dicha muestra en una primera cámara de amplificación a un primer número de ciclos térmicos con el fin de preparar una primera cantidad de una primera mezcla de reacción, y

b) someter una cantidad parcial de dicha mezcla de reacción en una segunda cámara de amplificación a un segundo número de ciclos térmicos con el fin de preparar una segunda cantidad de una segunda mezcla de

reacción,

en el que el volumen de dicha segunda cámara de amplificación es menor que el volumen de dicha primera cámara de amplificación.

La velocidad de calentamiento y enfriamiento integral preferentemente es de por lo menos 2 Kelvin/segundo (K/s) en la etapa a) y superior en la etapa b), preferentemente de por lo menos 5 K/s.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a un dispositivo diagnóstico para la preparación de ácidos nucleicos a partir de un molde, que comprende:

una primera cámara de amplificación, y una segunda cámara de amplificación, medios para calentar y enfriar las cámaras,

medios para controlar la temperatura de los ciclos de amplificación durante los ciclos térmicos, en... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método de preparación de ácidos nucleicos a partir de un ácido nucleico molde en el que se somete una muestra a ciclos térmicos, que comprende las etapas:

a) someter una primera cantidad de dicha muestra en una primera cámara de amplificación a un primer número de ciclos térmicos para prepara una primera cantidad e una primera mezclad e reacción, y

b) someter una cantidad parcial de dicha primera mezcla de reacción en una segunda cámara de amplificación a un segundo número de ciclos térmicos para preparar una segunda cantidad de una segunda mezcla de reacción,

en el que el volumen de dicha segunda cámara de amplificación es inferior al volumen de dicha primera cámara de amplificación.

2. Método según la reivindicación 1, en el que en la etapa a) dicha primera cantidad de muestras se somete a dicho primer número de ciclos térmicos con una velocidad de calentamiento y enfriamiento integral de por lo menos 2 Kelvin/segundo K/s) y en el que en la etapa b) dicha cantidad parcial de dicha primera mezcla de reacción se somete a dicho segundo número de ciclos térmicos con una velocidad de calentamiento y enfriamiento integral que es más alta que en la etapa a) y que es de por lo menos 5 K/s.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la velocidad de calentamiento y enfriamiento integral en la etapa a) es de 4 a 7 K/s y en la etapa b) es de 8 a 12 K/s.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el volumen de dicha primera cantidad de dicha muestra en dicha primera cámara de amplificación presenta un volumen de 5 a 200 pl.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el volumen de dicha cantidad parcial de dicha primera mezcla de reacción presenta un volumen de 0,05 a 5 pl.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho primer número de ciclos térmicos es inferior al segundo número de ciclos térmicos.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la cantidad parcial de la primera mezcla de reacción se separa físicamente del resto de dicha primera mezcla de reacción.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que una o más cantidades parciales adicionales de dicha primera mezcla de reacción se somete a ciclos térmicos en la etapa b).

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la primera cámara de amplificación se utiliza para la purificación de los ácidos nucleicos presentes en la muestra no purificada antes de llevar a cabo dicho primer número de ciclos térmicos.

10. Método según las reivindicaciones 1 a 9, que comprende además:

c) determinar la formación de ácidos nucleicos como medida de la presente, la ausencia o la cantidad de ácidos nucleicos que debe determinarse,

en el que el volumen de dicha segunda cámara de amplificación es inferior al volumen de dicha primera cámara de amplificación y la formación de ácidos nucleicos se determina durante o después de completarse las etapas a) y b).

11. Dispositivo diagnóstico para preparar ácidos nucleicos a partir de un molde, que comprende:

a. una primera cámara de amplificación, y

b. una segunda cámara de amplificación,

c. medios para el calentamiento y el enfriamiento de las cámaras,

d. medios para controlar la temperatura de los ciclos de amplificación durante los ciclos térmicos,

en el que el volumen de dicha segunda cámara de amplificación es inferior al volumen de dicha primera cámara de amplificación.

12. Dispositivo según la reivindicación 11, en el que el volumen de dicha primera cantidad de dicha primera cámara de amplificación presenta un volumen de 5 a 200 pl.

13. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, en el que el volumen de dicha segunda cámara de amplificación es de 0,05 a 5 pl.

14. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 que presenta medios para transportar líquidos de dicha primera cámara de amplificación a dicha segunda cámara de amplificación.

15. Programa informático para controlar un método para la preparación de ácidos nucleicos a partir de un ácido 5 nucleico molde utilizando ciclos térmicos, caracterizado por que el programa informático se configura para aplicar un

primer número de ciclos térmicos en la muestra y posteriormente un segundo número de ciclos térmicos con un tiempo de ciclado más corto en un volumen inferior de una mezcla de reacción originada a partir de la misma muestra.

16. Producto de programa Informático que comprende un programa según la reivindicación 15 en medios de

almacenamiento físico.

17. Aparato para preparar ácidos nucleicos, que comprende:

a. un dispositivo diagnóstico según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, y 15 b. una unidad para controlar el dispositivo diagnóstico,

en el que en la unidad para controlar el dispositivo diagnóstico se carga un programa informático según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 16.