CONJUNTO DE CEBADORES, SONDAS, PROCEDIMIENTO Y KIT PARA EL GENOTIPADODEL POLIMORFISMO GENETICO S447X DEL GEN LPL.

Conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y kit para el genotipado del polimorfismo genético S447X del gen LPL.La presente invención se refiere a un conjunto de cebadores

, sonda, procedimiento y kit para genotipado de polimorfismos genéticos, y más concretamente para el genotipado del polimorfismo genético S447X del gen LPL mediante la amplificación mediante PCR de una muestra de ADN usando el conjunto de cebadores reivindicado, y la detección mediante fluorescencia y genotipado del polimorfismo genético usando el conjunto de sondas reivindicado. Las principales ventajas de la presente invención son: gran rapidez que permite el genotipado a gran escala ya que la reacción de PCR y la detección de la señal fluorescente son simultáneas, asignación de genotipos automatizada y obtenible de forma inmediata al finalizar la reacción, gran sensibilidad que permite genotipar muestras empleando concentraciones muy bajas de ADN, y menor riesgo de contaminación al tratarse de un ensayo homogéneo

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201000006.

Solicitante: UNIVERSIDAD DE MALAGA.

Nacionalidad solicitante: España.

Provincia: MALAGA.

Inventor/es: .

Fecha de Solicitud: 29 de Diciembre de 2009.

Fecha de Publicación: .

Fecha de Concesión: 17 de Enero de 2011.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/68D2G

Clasificación PCT:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)
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Fragmento de la descripción:

Conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y kit para el genotipado del polimorfismo genético S447X del gen LPL.

Sector técnico

La presente invención se refiere a un conjunto de cebadores, sonda, procedimiento y kit para genotipado de polimorfismos genéticos, y más concretamente para el genotipado del polimorfismo genético S447X del gen LPL.

Técnica anterior

Los polimorfismos genéticos de un solo nucleótido (en inglés "single nucleotide polimorphisms" o "SNPs") son la forma más frecuente de variación que se puede encontrar en el genoma humano. El estudio de la variabilidad genética tiene repercusión biosanitaria puesto que el papel que se atribuye a los SNPs es, junto con distintos factores ambientales, de moduladores de la susceptibilidad individual a padecer la mayoría de las enfermedades comunes (hipertensión, diabetes, obesidad, arteriosclerosis...). De este modo, el desarrollo de las técnicas de genotipado es un tema en auge actualmente y es el campo en el que se encuadra la invención.

El enzima LPL (lipasa lipoprotéica) juega un papel clave en el metabolismo lipídico ya que hidroliza el grueso de triglicéridos presentes en el corazón de quilomicrones y lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) que circulan en plasma. Diferentes estudios han demostrado la implicación del gen que codifica para el enzima en el desarrollo de la arteriosclerosis y la aparición de distintas dislipemias de base genética. De las numerosas variantes descritas en el gen, el polimorfismo (SNP) S447X provoca una terminación prematura de la proteína (faltan los aminoácidos del extremo C-terminal serina y glicina) que produce un aumento de su actividad hidrolítica. De esta forma esta variante se ha asociado a menores niveles de triglicéridos y mayores concentraciones de colesterol HDL y por tanto a un efecto protector frente a arteriosclerosis y síndrome metabólico. Es de especial interés señalar que se han desarrollado sistemas de terapia génica para tratar a pacientes con hipertrilgiceridemia grave causada por déficits del enzima LPL, expresando de forma constitutiva la variante 447X con mayor actividad, de ahí la importancia de identificar a las personas portadoras o no de tal polimorfismo.

El método descrito inicialmente para el genotipado de este polimorfismo, S447X, está basado en el sistema de PCR-RFLP, o genotipado por PCR y restricción, que es el que se utiliza de forma más común para el análisis individual de la mayoría de los SNPs conocidos. En este sistema se amplifican mediante la reacción en cadena de la polimerasa los fragmentos polimórficos del gen o genes en estudio, el fragmento amplificado se digiere, con un enzima de restricción concreto pues el polimorfismo suele causar la aparición o eliminación de un sitio de restricción y el perfil de bandas específico de cada genotipo se visualiza empleando geles de agarosa o acrilamida.

Las principales ventajas de la presente invención en relación al método convencional (PCR-RFLP) son: a. una mayor rapidez que permite el genotipado a mayor escala (mayor número de muestras) ya que la reacción de PCR y la detección de la señal fluorescente son simultáneas, la asignación de genotipos está automatizada y se obtiene inmediatamente al finalizar la reacción, b. mayor sensibilidad, debido al empleo de una señal fluorescente, por lo que se pueden genotipar muestras empleando concentraciones muy bajas de ADN genómico, c. menor riesgo de contaminación, al tratarse de un ensayo homogéneo, es decir el procedimiento se realiza en una sola etapa.

Para este polimorfismo hemos encontrado descritos en la literatura dos ensayos semejantes al que propone la invención (Brousseau et al, 2004, Komurcu-Bayrak et al 2007). En el primer caso sólo se conocen las secuencias específicas de cebadores y no las de las sondas. Como se describe más abajo, los cebadores propuestos en la presente invención permiten el genotipado de las muestras en un rango de temperaturas muy amplio siendo por lo tanto más versátil que el publicado por estos otros autores. Por otra parte, en los casos publicados la aplicación de los ensayos depende del uso de los kits y aparatos de la empresa que ha desarrollado los métodos (Applied Biosystems) mientras que el ensayo propuesto en la presente invención puede llevarse a cabo en cualquier máquina de PCR en tiempo real que detecte al menos dos colores (longitudes de onda) de fluorescencia y empleando reactivos de cualquier marca comercial.

También es posible genotipar los polimorfismos de interés mediante secuenciación directa, sin embargo este sistema no se utiliza rutinariamente para el genotipado de un gran número de muestras sino para la detección de nuevos polimorfismos en los genes de interés.

Divulgación de la invención

Definiciones

Polimorfismo S447X: A lo largo de la descripción este término hace referencia a la variante nucleotídica del gen LPL definida por la aparición de un cambio C por G en la posición 1595 de la región codificante (exón 9).

Ensayo: A lo largo de la descripción este término hace referencia al conjunto de procedimientos que permiten llevar a cabo el genotipado del polimorfismo.

Sondas lineales fluorogénicas: A lo largo de la descripción este término hace referencia a las secuencias nucleotídicas, complementarias de la región polimórfica de la variante, que llevan acoplado un fluorocromo en el extremo 5' y una molécula extintora en el extremo 3' de dicha secuencia.

Objeto de la invención

La presente invención se refiere a un conjunto de cebadores, sonda, procedimiento y kit para genotipado de polimorfismos genéticos, y más concretamente para el genotipado del polimorfismo genético S447X del gen LPL.

El procedimiento, representado esquemáticamente en la figura 1, consiste en una única reacción de PCR en la que se aprovecha la actividad 5' exonucleasa del enzima Taq polimerasa. En la reacción de PCR están presentes cuatro oligonucleótidos: dos cebadores específicos que flaquean el polimorfismo de interés y dos sondas lineales fluorogénicas específicas de cada alelo. Estas sondas están marcadas en el extremo 5' con un fluorocromo de referencia, distinto para cada sonda, y una molécula extintora en el 3'. Cuando las sondas están intactas, la señal emitida por la excitación del fluorocromo de referencia es captada por la molécula extintora, debido a la proximidad física entre ambas, y por tanto no se detecta (figura 1a). La señal fluorescente, diferente para cada alelo, sí se detecta cuando la sonda híbrida con el alelo totalmente complementario y se libera el fluorocromo de referencia, por la actividad 5'rightarrow3' exonucleasa de la polimerasa, durante los ciclos de la reacción de PCR (figura 1b y 1c).

De este modo, constituye un primer objeto de la presente invención un conjunto de cebadores para el genotipado de polimorfismos genéticos, y más concretamente para el genotipado del polimorfismo genético S447X del gen LPL, en el cual al menos dos de los cebadores de dicho conjunto presentan secuencias que comprenden a las secuencias mostradas en las SEQ ID NO 1 y SED ID NO 2. Preferentemente, dicho conjunto está formado por un primer cebador cuya secuencia comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 1 y por un segundo cebador cuya secuencia comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 2. Más preferentemente, la secuencia de nucleótidos del primer cebador es idéntica a la SEQ ID NO 1 y la secuencia de nucleótidos del segundo...

 


Reivindicaciones:

1. Conjunto de cebadores para el genotipado del polimorfismo genético S447X del gen LPL caracterizado porque al menos dos de los cebadores de dicho conjunto presentan secuencias que comprenden a las secuencias mostradas en las SEQ ID NO1 y SED ID NO 2.

2. Conjunto de cebadores para el genotipado del polimorfismo genético S447X del gen LPL según la reivindicación anterior caracterizado porque dicho conjunto está formado por un primer cebador cuya secuencia comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 1 y por un segundo cebador cuya secuencia comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 2.

3. Conjunto de cebadores para el genotipado del polimorfismo genético S447X del gen LPL según la reivindicación anterior caracterizado porque la secuencia de nucleótidos del primer cebador es idéntica a la SEQ ID NO 1 y la secuencia de nucleótidos del segundo cebador es idéntica a la SEQ ID NO 2.

4. Conjunto de sondas para el genotipado del polimorfismo genético S447X del gen LPL caracterizado porque al menos dos de las sondas de dicho conjunto, una de ellas específica del alelo más frecuente (447S) y la otra específica del alelo menos frecuente (447X), presentan, respectivamente, secuencias que comprenden a las secuencias mostradas en las SEQ ID NO 3 y SED ID NO 4.

5. Conjunto de sondas para el genotipado del polimorfismo genético S447X del gen LPL según la reivindicación anterior caracterizado porque dicho conjunto está formado por una primera sonda, específica del alelo más frecuente, cuya secuencia comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 3, y por una segunda sonda, específica del alelo menos frecuente, cuya secuencia comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 4.

6. Conjunto de sondas para el genotipado del polimorfismo genético S447X del gen LPL según la reivindicación anterior caracterizado porque la secuencia de nucleótidos de la primera sonda es idéntica a la SEQ ID NO 3, y la secuencia de nucleótidos de la segunda sonda es idéntica a la SEQ ID NO 4.

7. Conjunto de sondas para el genotipado del polimorfismo genético S447X del gen LPL según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 caracterizado porque tanto la sonda específica del alelo más frecuente como la sonda específica del alelo menos frecuente están marcadas por fluorocromos de referencia distintos en el extremo 5' y en el extremo 3' con una molécula extintora.

8. Conjunto de sondas para el genotipado del polimorfismo genético S447X del gen LPL según la reivindicación anterior caracterizado porque la sonda específica del alelo más frecuente está marcada por fluorescencia en el extremo 5' con 6-carboxifluoresceína (Fam) y en el extremo 3' con carboxitetrametilrodamina (Tamra); y la sonda específica para el alelo menos frecuente está marcada por fluorescencia en el extremo 5' con hexaclorofluoresceína (Hex) y en el extremo 3' con carboxitetrametilrodamina (Tamra).

9. Procedimiento para el genotipado del polimorfismo genético S447X del gen LPL caracterizado porque comprende:

a. la amplificación mediante PCR de una muestra de ADN usando un conjunto de cebadores descrito según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y

b. la detección mediante fluorescencia y genotipado usando un conjunto de sondas descrito según la reivindicación 7.

10. Procedimiento para el genotipado del polimorfismo genético S447X del gen LPL caracterizado porque comprende:

a. la amplificación mediante PCR de una muestra de ADN usando un conjunto de cebadores descrito según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y

b. la detección mediante fluorescencia y genotipado usando un conjunto de sondas descrito según la reivindicación 8.

11. Procedimiento para el genotipado del polimorfismo genético S447X del gen LPL según la reivindicación anterior caracterizado porque las sondas para la detección mediante fluorescencia y genotipado pueden utilizarse conjuntamente o por separado.

12. Procedimiento para el genotipado del polimorfismo genético S447X del gen LPL según la reivindicación anterior caracterizado porque la detección mediante fluorescencia y genotipado se realiza usando las sondas descritas según la reivindicación 8 de forma que, en la mezcla de reacción, la sonda específica del alelo más frecuente se encuentra a una concentración de 100 nM, y la sonda específica del alelo menos frecuente se encuentra a una concentración en el rango de 100 a 300 nM.

13. Procedimiento para el genotipado del polimorfismo genético S447X del gen LPL según la reivindicación anterior caracterizado porque, en la mezcla de reacción, la sonda específica del alelo menos frecuente se encuentra a una concentración de 200 nM.

14. Procedimiento para el genotipado del polimorfismo genético S447X del gen LPL según cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13 caracterizado porque la amplificación mediante PCR comprende un paso inicial de desnaturalización del ADN y activación de la polimerasa de 5 minutos a 95ºC, y 40 ciclos con dos pasos: uno de desnaturalización de 30 segundos a 95ºC, y otro de hibridación y extensión.

15. Procedimiento para el genotipado del polimorfismo genético S447X del gen LPL según la reivindicación anterior caracterizado porque el paso de hibridación y extensión se realiza 45 segundos a una temperatura comprendida en el rango de 60 a 68ºC.

16. Procedimiento para el genotipado del polimorfismo genético S447X del gen LPL según la reivindicación anterior caracterizado porque el paso de hibridación y extensión se realiza a una temperatura de 64ºC.

17. Procedimiento para el genotipado del polimorfismo genético S447X del gen LPL según la reivindicación 14 caracterizado porque el paso de hibridación y extensión se realiza separadamente: hibridación 30 segundos a una temperatura comprendida en el rango de 60 a 68ºC, y extensión 30 segundos a 72ºC.

18. Procedimiento para el genotipado del polimorfismo genético S447X del gen LPL según la reivindicación anterior caracterizado porque la hibridación se realiza a una temperatura de 64ºC.

19. Kit para el genotipado del polimorfismo genético S447X del gen LPL que comprende al menos un conjunto de cebadores descrito según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y al menos una de las sondas del conjunto de sondas descrito según la reivindicación 7.

20. Kit para el genotipado del polimorfismo genético S447X del gen LPL que comprende al menos un conjunto de cebadores descrito según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y al menos una de las sondas del conjunto de sondas descrito según la reivindicación 8.