CONJUGADOS DE PEPTIDO-POLISACARIDO.

La presente invención se refiere a un conjugado de polisacárido péptido y a un procedimiento para prepararlo. En una realización particular de la invención, el conjugado usa polisacáridos bacterianos o fúngicos y así puede ser útil para vacunas. Los polisacáridos constituyen una amplia familia de moléculas poliméricas que son útiles en varios campos de la técnica. En algunos casos, requieren estar acoplados a un polipéptido, p. ej. una proteína o un péptido. Por ejemplo, los polisacáridos se usan en técnicas de diagnóstico o de purificación como medio matriz para reactivos de péptido. Los polisacáridos no inmunógenos tales como el dextrano son también útiles para presentar péptidos pequeños al sistema inmunológico como se describe en el documento EP 326 1 11. El realidad, los péptidos han de unirse a portadores de proteínas o han de ser administrados con un coadyuvante, siendo los compuestos de aluminio los más comúnmente usados. Sin embargo, los péptidos pequeños mezclados, adsorbidos o precipitados con estos coadyuvantes pueden verse impedidos por el gel de aluminio, y por tanto no estar disponibles para el sistema inmunológico. Para obviar este problema, el documento EP 326 111 enseña que los péptidos pueden ser conjugados con polisacáridos no inmunógenos. Tales conjugados, en presencia de compuestos de aluminio, pueden desencadenar una respuesta inmunitaria contra el resto peptídico. En el campo de las vacunas, es también muy importante conjugar polipéptidos, p. ej. péptido o proteína, con polisacáridos inmunógenos, persiguiendo estos una respuesta inmunitaria contra los polisacáridos. En realidad, la cápsula y la pared celular de las bacterias (y también la pared celular de los hongos) están constituidas esencialmente por polisacáridos compuestos de unidades repetitivas muy específicas que llevan motivos de epítopo que normalmente no se encuentran en los mamíferos y que pueden mediar la inmunogenicidad. Por tanto, los polisacáridos, p. ej. los polisacáridos capsulares, han sido ya usados como vacunas contra enfermedades bacterianas tales como la meningitis, la neumonía y la fiebre tifoidea. Sin embargo, hay un importante problema cuando se usan polisacáridos como vacunas. Aunque han demostrado ya ser inmunógenos, es decir, en otras palabras, desencadenan una respuesta inmunitaria cuando son administrados a tales mamíferos, e incluso aunque esta respuesta puede ser escasa, son específicos por cuanto pertenecen al pequeño número de antígenos que pueden inducir la producción de células B sin ayuda de células T. En consecuencia, se les denomina antígenos T-independientes (independientes de las células T). La respuesta inmunitaria inducida por los antígenos T-independientes se caracteriza por varios aspectos entre los que se encuentran: (i) La respuesta primaria es más débil y más temprana que la respuesta a los antígenos T-dependientes; (ii) La respuesta del anticuerpo no madura en una elevada producción de IgG, con aumento de la afinidad, como se observa con los antígenos T-dependientes; (iii) La memoria inmunitaria correspondiente a los antígenos T-independientes es escasa y por tanto, como la memoria inmunitaria es la clave para la respuesta inmunitaria secundaria que constituye la base del principio de la vacunación, un antígeno T-independiente es un antígeno pobre para inducir una respuesta inmunitaria protectora a largo plazo; y (iv) Los niños no pueden responder a los polisacáridos antes de cumplir uno o dos años. Para que induzcan una respuesta inmunitaria secundaria, los antígenos T-independientes necesitan estar unidos covalentemente a una proteína portadora tal como la toxina de la difteria o del tétanos, que da al antígeno el carácter T-dependiente. Su conjugado puede entonces ser complementado con un coadyuvante tal como un compuesto de aluminio o el coadyuvante de Freund completo o incompleto (estos dos últimos exclusivamente para ser usados en mamíferos distintos de los seres humanos), para que las respuesta inmunitaria se potencie (efecto del coadyuvante). Por el término portador (barriera) se entiende una molécula que, cuando se une covalentemente a un antígeno, p. ej. un polisacárido, es capaz de promover una respuesta T-dependiente contra el antígeno. Tal respuesta se muestra en un esquema de vacunación que comprende al menos dos inyecciones del conjugado antígeno-portador, con una separación de días, semanas o meses (sensibilización y refuerzo). En la primera infección (sensibilización), se muestra una respuesta débil del anticuerpo, mientras que en la inyección de refuerzo la respuesta del anticuerpo se desencadena a un nivel elevado. Tal respuesta aumentada no se observa con el control negativo constituido por el antígeno no conjugado. En la técnica se dispone ya de varios métodos de conjugación. Los grupos funcionales polisacárido que están normalmente implicados pueden ser los grupos amino, carboxilo o hidroxilo situados a lo largo de la cadena o grupos aldehído, bien sean terminales o a lo largo de la cadena. Los grupos funcionales polipéptido que están normalmente implicados pueden ser grupos amino o carboxilo, terminales o presentes en las cadenas laterales aminoácido o incluso grupos tiol. 2 ES 2 335 557 T3 De una manera general, los conjugados de polisacárido pueden mostrar tres tipos de estructura dependiendo de la localización de los grupos funcionales tanto del polisacárido (bien sea a lo largo de la cadena o en el extremo) como del portador, que están implicados en la unión. Estos tipos de estructura se denominan, para hacer más fácil su descripción, tipos Sun o Ear, Rake y Lattice. Se ilustran en la Figura 1, en la que (A), (B) y (C), respectivamente, representan los tipos Sun (neoglicoconjugado), Rake y Lattice. En el tipo Sun, un polisacárido está unido a una proteína o un péptido por medio de un grupo reactivo situado exclusivamente en un extremo de la cadena de polisacárido. Usualmente esto implica un grupo carbonilo situado en el extremo reductor de la cadena de polisacárido. Varias cadenas de polisacárido pueden unirse a la proteína, implicando la unión normalmente un grupo amino portado, p. ej., por un resto de lisina. Tales conjugados se definen también como neoglicoconjugados. A título de ejemplo, se logra un conjugado de este tipo en Alonso de Velasco et al., Infect. Immun. (1995) 63 : 961, Paradiso et al., Vaccine Research (1993) 2 (4) : 239, y Jennings en la patente de EE.UU. nº 4.356.170. En el tipo Rake, los péptidos están unidos a lo largo de la cadena de polisacárido. Un ejemplo de este tipo se proporciona en Lett et al., Infect. Immun. (1994) 62 : 785, y más apropiadamente en Lett et al., Infect. Immun. (1995) 63 : 2645 y Konen-Waisman et al., J. Immunol. (1995) : 5977. La unión implica al grupo amino portado por el único resto de lisina interno a la secuencia del péptido y/o el grupo amino terminal. En el tipo Lattice, la proteína y el polisacárido están entrecruzados. Esto se hace posible debido al hecho de que se usa una proteína en vez de un péptido (usualmente grupos amino o ácido situados a lo largo de la proteína), y de que intervienen grupos reactivos localizados a lo largo de la cadena de polisacárido. Un conjugado de este tipo se describe en la patente de EE.UU. nº 4.673.574 de Anderson. Schneerson et al., J. Exp. Med. (1980) 152 : 361, describen también un método de conjugación que conduce a un tipo Lattice. Utiliza CNBr y, como enlazador, dihidrazida de ácido adípico (ADH). Están implicados los grupos hidroxilo presentes a lo largo de la cadena de polisacárido y los grupos amino de la cadena lateral de la proteína. Cada una de estas estructuras puede conseguirse de acuerdo con una diversidad de procedimientos de conjugación. La unión puede ser un enlace directo como en la patente de EE.UU. nº 4.673.574 de Anderson, la patente de EE.UU. nº 4.356.170 de Jennings, Lett et al. o Könen-Waisman et al. La unión puede también ser un enlace indirecto por cuanto se usa una molécula de enlazador, como se ilustra en Schneerson et al. Además de un enlazador, también puede usarse un espaciador como se describe en Alonso de Velasco et al. o en Paradiso et al. (para el polisacárido neumocócico). Pueden estar implicados varios grupos funcionales presentes en el polisacárido, la proteína, el enlazador y opcionalmente, el espaciador. Algunas de las referencias de la técnica anterior citadas anteriormente se presentan con más detalle a continuación: En Alonso de Velasco et al., el portador es un péptido de aproximadamente 20 restos de aminoácido, que comprende un único resto de cisteína en cualquiera de los extremos. El polisacárido 17F de Streptococcus pneumoniae es primero derivatizado en el extremo reductor por aminación reductora con diaminopropano en presencia de NaCNBH 3. Después el polisacárido derivatizado...

1. Un procedimiento para conjugar (i) un péptido que contiene al menos seis restos de aminoácido, al menos uno de los cuales es un resto de cisteína, con (ii) un polisacárido que comprende al menos cuatro unidades repetitivas, comprendiendo dicho procedimiento: A (i) Activar el polisacárido con un enlazador bifuncional de fórmula (I) R1-A-R2 en la que R1 es un grupo maleimidilo, A es una cadena carbonada aromática o alifática sustituida o no sustituida, y R2 es un grupo succinimidilo, de forma que R2 reacciona con los grupos amino del polisacárido y se obtiene un polisacárido activado; y (ii) conjugar con el péptido el polisacárido activado, de forma que R1 reacciona con el grupo tiol del resto de cisteína y se obtiene un conjugado, en el que se introduce al azar una diversidad de entidades de péptido todo a lo largo de la cadena de polisacárido por unión covalente; o B (i) Derivatizar el polisacárido con un espaciador de fórmula (II) R3-B-R4 en la que R3 es un grupo funcional capaz de reaccionar con grupos amino, carboxilo o hidroxilo, B es una cadena carbonada aromática o alifática y R4 es un grupo amino, de forma que R3 reacciona con los grupos amino, carboxilo o hidroxilo del polisacárido y se obtiene un polisacárido derivatizado, en el que se introduce al azar una diversidad de entidades de espaciador todo a lo largo de la cadena de polisacárido; (ii) activar el polisacárido derivatizado con un enlazador bifuncional de fórmula (I) R1-A-R2 en la que R1 es un grupo maleimidilo, A es una cadena carbonada aromática o alifática sustituida o no sustituida, y R2 es un grupo succinimidilo, de forma que R2 reacciona con R4 y se obtiene un polisacárido activado; y (iii) conjugar con el péptido el polisacárido activado de forma que R1 reacciona con el grupo tiol del resto de cisteína del péptido y se obtiene un conjugado, en el que una diversidad de entidades de péptido se introduce al azar todo a lo largo de la cadena de polisacárido, por unión covalente. 2. Un procedimiento según la reivindicación 1ª, en el que el péptido contiene de seis a doscientos restos de aminoácido, incluyendo el resto de cisteína. 3. Un procedimiento según la reivindicación 2ª, en el que el péptido contiene de quince a cien restos de aminoácido, incluyendo el resto de cisteína. 4. Un procedimiento según la reivindicación 3ª, en el que el péptido contiene de veinte a cincuenta restos de aminoácido, incluyendo el resto de cisteína. 5. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª, en el que el resto de cisteína está situado en el extremo N- o C-terminal del péptido. 6. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 5ª, en el que el péptido contiene un epítopo T-dependiente. 7. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 6ª, en el que el polisacárido es un polisacárido nativo elegido entre la cadena O-específica de lipopolisacáridos bacterianos, lipopolisacáridos bacterianos destoxificados, y polisacáridos capsulares. 8. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 7ª, en el que el polisacárido se deriva de un polisacárido nativo que comprende grupos N-acetilo, por hidrólisis ácida o básica controlada. 9. Un procedimiento según la reivindicación 7ª o 8ª, en el que el polisacárido se deriva de un polisacárido nativo elegido entre un polisacárido capsular. 10. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 9ª, en el que el polisacárido se compone de 4 a 3000 unidades repetitivas. 11. Un procedimiento según la reivindicación 10ª, en el que el polisacárido se compone de 4 a 1000 unidades repetitivas. 12. Un procedimiento según la reivindicación 11ª, en el que el polisacárido se compone de 7 a 700 unidades repetitivas. 13 ES 2 335 557 T3 13. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 12ª, en el que el enlazador de fórmula (I) se elige entre el grupo consistente en succinimidil-4-(N-maleiimidometil)ciclohexan-1-carboxilato, N-succinimidil-4-(4maleiimidofenil)butirato, N-succinimidil-4-maleiimido-butirato, N-succinimidil-3-maleiimido-benzoato y éster N-(gmaleimidobutiriloxi)succinimida (GMBS). 14. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 13ª, en el que el espaciador de fórmula (II) es dihidrazida de ácido adípico (ADH). 15. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 14ª, en el que la conjugación se realiza de forma que el conjugado obtenido de la misma contiene de un mol de péptido por cada cincuenta moles de unidades repetitivas (1 : 50) a un mol de péptido por cada mol de unidades repetitivas (1 : 1). 16. Un procedimiento según la reivindicación 15ª, en el que la conjugación se realiza de forma que el conjugado obtenido de la misma contiene de un mol de péptido por cada treinta moles de unidades repetitivas (1 : 30) a un mol de péptido por cada tres moles de unidades repetitivas (1 : 3). 17. Un procedimiento según la reivindicación 16ª, en el que la conjugación se realiza de forma que el conjugado obtenido de la misma contiene de un mol de péptido por cada veinte moles de unidades repetitivas (1 : 20) a un mol de péptido por cada cinco moles de unidades repetitivas (1 : 5). 18. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado producido por el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 17ª, junto con un diluyente o vehículo aceptable farmacéuticamente. 19. Una composición según la reivindicación 18ª, que no comprende ningún coadyuvante. 20. Un conjugado producido por el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 17ª, para inducir una respuesta inmunitaria contra el resto de polisacárido del conjugado. 14 ES 2 335 557 T3