Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España en los últimos 80 años. Clasificación Internacional de Patentes CIP 2013.

ANTICUERPOS ANTI-CD22 CON AFINIDAD AUMENTADA POR LAS CELULAS LEUCEMICAS QUE EXPRESAN CD22.

Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen:

Un anticuerpo anti-CD22 con una cadena ligera variable (VL) que tiene la secuencia de la cadena VL del anticuerpo RFB4 de la Figura 1 y una cadena pesada variable

(VH) que tiene la secuencia de la cadena VH del anticuerpo RFB4 de la Figura 1, siempre que los restos SSY de las posiciones 104, 105 y 106 de CDR3 de la cadena VH de dicho anticuerpo anti-CD22 sean remplazados por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en THW, YNW, TTW y STY.

Solicitante: THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA AS REPRESENTED BY THE SECRETARY OF HEALTH AND HUMAN.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: OFFICE OF TECHNOLOGY TRANSFER, 6011 EXECUTIVE BOULEVARD, SUITE NO. 325,ROCKVILLE, MD 20854.

Inventor/es: PASTAN, IRA, H., KREITMAN, ROBERT J., SALVATORE,GIULIANA, BEERS,RICHARD.

Fecha de Publicación de la Concesión: 19 de Julio de 2010.

Fecha Concesión Europea: 19 de Mayo de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes: C07K16/28A.

Clasificación PCT: A61K39/395 (.Anticuerpos (aglutininas 38/36); Inmunoglobulinas; Inmunosuero, p. ej. suero antilinfocitario [3]), G01N33/53 (...Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto (preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A 61 K; haptenos en general, ver los lugares apropiados en la clase C 07; proteínas en general C 07 K) [4]), C07K16/00 (Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales [6]), C12N15/63 (..Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión [5]), C07H21/04 (.con desoxirribosilo como radical sacárido [2]).

Clasificación antigua: A61K39/395 (.Anticuerpos (aglutininas 38/36); Inmunoglobulinas; Inmunosuero, p. ej. suero antilinfocitario [3]), G01N33/53 (...Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto (preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A 61 K; haptenos en general, ver los lugares apropiados en la clase C 07; proteínas en general C 07 K) [4]), C07K16/00 (Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales [6]), C12N15/63 (..Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión [5]), C07H21/04 (.con desoxirribosilo como radical sacárido [2]).

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Descripción:

Anticuerpos anti-CD22 con afinidad aumentada por las células leucémicas que expresan CD22.

Antecedentes de la invención

Las malignidades hematológicas son un grave problema de salud pública. Se ha estimado que en el año 2000, se produjeron más de 50.000 nuevos casos de linfoma no Hodgkin y más de 30.000 nuevos casos de leucemia en los Estados Unidos (Greenlee, R.T. et al., CA Cancer J. Clin., 50:7-33 (2000)) y se esperaban más de 45.000 muertes por estas enfermedades. Muchos más pacientes viven con una morbidez relacionada con enfermedades crónicas. Desafortunadamente, en un elevado porcentaje de pacientes, las terapias convencionales no son capaces de inducir remisiones completas a largo plazo.

En los últimos años se han desarrollado inmunotoxinas como enfoque terapéutico alternativo para tratar estas malignidades. Las inmunotoxinas estaban compuestas originalmente por un anticuerpo conjugado químicamente con una toxina vegetal o bacteriana. El anticuerpo se une al antígeno expresado en la célula diana y la toxina es internalizada ocasionando la muerte celular al detener la síntesis de proteínas e inducir la apoptosis (Brinkmann, U., Mol. Med. Today, 2:439-446 (1996)).

Las malignidades hematológicas son una diana atractiva para las terapias con inmunotoxinas ya que las células tumorales son fácilmente accesibles y tos antígenos diana son altamente expresados (Kreitman, R.J. y Pastan, I., Semin. Cancer. Biol., 6:297-306 (1995)). Uno de estos antígenos es CD25. Una prueba clínica con la inmunotoxina LMB-2 (anti-Tac(Fv)-PE38) que se dirige a CD25 demostró que el agente era bien tolerado y que tenía una actividad anti-tumoral sustancial (Kreitman, R.J. et al., Blood, 94:3340-3348 (1999); Kreitman, R.J. et al., J. Clin. Oncol. 18:16222- 1636 (2000)). Se observó una respuesta completa en un paciente con Leucemia de Células Pilosas y se observaron respuestas parciales en pacientes con Leucemia de Células Pilosas, leucemia linfocítica crónica, linfoma cutáneo de células T, enfermedad de Hodgkin y leucemia de células T adultas.

Otro antígeno que se ha utilizado como diana de inmunotoxinas es CD22, un antígeno de células B restringido por el linaje expresado en 60%-70% de los linfomas y leucemias de células B. CD22 no está presente sobre la superficie celular en las fases tempranas de desarrollo de las células B y no es expresado sobre las células pluripotenciales (Tedder, T.F. et al., Annu. Rev. Immunol, 5:481-504 (1997)). Se han llevado a cabo pruebas clínicas con una inmunotoxina que contiene un anticuerpo anti- CD22, RFB4, o su fragmento Fab, acoplado a ricina A desglicosilada. En estas pruebas se han observado respuestas clínicas sustanciales; no obstante, el síndrome de extravasación capilar, grave y en algunos casos fatal, resultó limitante de la dosis (Sausvilie, E.A. et al., Blood, 85:3457-3465 (1995); Amlot, P.L et al., Blood, 82:2624-2633 (1993); Vitetta, E.S, et al., Cancer Res., 51:4052-4058 (1991)).

Como enfoque alternativo, se utilizó el anticuerpo RFB4 para elaborar una inmunotoxina recombinante en la cual el fragmento Fv en forma de cadena sencilla se fusiona con una forma truncada de 38 kDa de la exotoxina A de Pseudomonas (PE38). PE38 contiene los dominios de translocación y de ribosilación del ADP de PE pero no la porción de unión a la célula (Hwuang, J. et al., Cell, 48:129-136 (1987)). RFB4 (Fv)-PE38 es citotóxico para las células CD22 positivas (Mansfield, E. et al., Biochem. Soc. Trans., 25:709-714 (1997)). Para estabilizar la inmunotoxina Fv de cadena sencilla y hacerla más adecuada para su desarrollo clínico, se diseñaron restos cisteína en regiones marco de VH y VL (Mansfield, E. et al., Blood, 90:2020-2026 (1997)) generando la molécula RFB4(dsFv)-PE38.

RFB4 (dsFv)-PE38 es capaz de eliminar las células leucémicas de pacientes e inducir remisiones completas en ratones que portan xenoinjertos de linfomas (Kretiman, R.J. et al., Clin. Cancer Res., 6:1476-1487 (2000); Kreitman, RJ. et al., Int. J. Cancer, 81:148-155 (1999)). RFB4 (dsFv)-PE38 (BL22) está siendo evaluado actualmente en un ensayo clínico en fase I en el Instituto Nacional del Cancer en pacientes con malignidades hematológicas. Se trataron dieciséis pacientes con leucemia de células pilosas resistente a análogos de purina con BL22 y 11 (86%) alcanzaron remisiones completas (Kreitman, R.J. et al., N. Engl. J. Med. (2001).

Debido a los beneficios clínicos obtenidos con BL22, y debido a que se ha demostrado que la mejora de la afinidad de unión mejora la liberación selectiva en el tumor de los scFv (Adams et al., Cancer Res. 58:485-490 (1998)), la mejora de la afinidad de unión de los scFv y otras fracciones localizadoras (tales como dsFv, Fab, y F(ab')2) de los productos inmunoconjugados pudo mejorar la eficacia de estos agentes al liberar moléculas efectoras para las células B malignas. El direccionamiento mejorado disminuye probablemente la dosis necesaria para lograr la remisión completa de estos cánceres.

Los factores que influyen en la afinidad de unión son afectados de manera múltiple y la obtención de scFv mutantes con una afinidad mejorada no es trivial. Aunque la estructura cristalina del anticuerpo-antígeno puede sugerir qué restos están implicados en la unión, los datos estructurales de la resolución atómica no se encuentran disponibles para la mayoría de los anticuerpos. Por otra parte, incluso cuando tales datos están disponibles generalmente no se puede predecir qué restos y qué mutaciones darán como resultado un anticuerpo con un incremento de la actividad de unión al antígeno.

Breve resumen de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos mejorados para la unión a células que expresan CD22 (una "célula CD22+"), especialmente células cancerosas que expresan CD22 sobre su superficie exterior (una "célula cancerosa CD22+"). Con respecto a esto, la invención proporciona anticuerpos anti-CD22 con una cadena ligera variable (VL) que tiene la secuencia del anticuerpo RFB4 de la Figura 1 y una cadena pesada variable (VH) que tiene la secuencia de un anticuerpo RFB4 de ta Figura 1, pero en los que los restos 100, 100A y 100B de CDR3 de dicha cadena VH enumerada por el sistema de numeración de Kabat y Wu (restos 104, 105 y 106 como se numera de acuerdo con la Figura 1) tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: THW, YNW, TTW, y STY. El anticuerpo puede ser una molécula de anticuerpo completa, pero es preferiblemente un Fv de cadena sencilla ("scFv"), un Fv estabilizado con disulfuro ("dsFv"), un Fab, o un F(ab'). En una forma particularmente preferida, el anticuerpo es dsFv. (Por conveniencia para la referencia, el término "anticuerpo" del texto de más abajo hace referencia a anticuerpos completos y, más preferiblemente, a scFv, dsFv, Fab, o F(ab')).

La invención proporciona adicionalmente composiciones que comprenden uno de estos anticuerpos conjugado o fusionado con un radical terapéutico o una marca detectable. El radical terapéutico puede ser una citotoxina, un fármaco, un radioisótopo, o un liposoma cargado con un fármaco o una citotoxina. En las realizaciones preferidas, el radical efector es una citotoxina. La citotoxina puede ser seleccionada del grupo que consiste en ricina A, abrina, ribotoxina, ribonucleasa, saporina, caliqueamicina, toxina de la difteria o una subunidad citotóxica o uno de sus mutantes, una exotoxina de Pseudomonas, o una de sus porciones citotóxicas, una exotoxina de Pseudomonas mutada, una de sus porciones citotóxicas, y toxinas A a F de botulinum. En las formas preferidas, la citotoxina es una exotoxina de Pseudomonas o uno de sus fragmentos citotóxicos, o una exotoxina de Pseudomonas mutada o uno de sus fragmentos citotóxicos. En formas particularmente preferidas, la exotoxina de Pseudomonas se selecciona del grupo que consiste en PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E, y PE38QQR. En la realización más preferida, la exotoxina de Pseudomonas es PE38. Las composiciones pueden comprender adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable.

La invención proporciona adicionalmente el uso de un anticuerpo anti-CD22 de la invención como se ha descrito antes, para la fabricación de un medicamento para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa CD22+. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo completo, un scFv, dsFv, Fab, o F(ab')2. En una forma particularmente preferida, el anticuerpo es un dsFv. La invención proporciona adicionalmente el uso de una composición para la fabricación de un medicamento para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa CD22+, cuya composición comprende un anticuerpo como se acaba de describir conjugado o fusionado con un radical terapéutico o una marca detectable. El radical terapéutico puede ser por ejemplo, una citotoxina, un fármaco, un radioisótopo, o un liposoma cargado con un fármaco o una citotoxina. En las formas preferidas, el radical terapéutico es una citotoxina. La citotoxina se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en ricina A, abrina, ribotoxina, ribonucleasa, saporina, caliqueamicina, toxina de la difteria o una de sus subunidades citotóxicas o uno de sus mutantes, una exotoxina de Pseudomonas, una de sus porciones citotóxicas, una exotoxina de Pseudomonas mutada, una de sus porciones citotóxicas, y toxinas A a F de botulinum. En los usos preferidos, la citotoxina es una exotoxina de Pseudomonas o uno de sus fragmentos citotóxicos, o una exotoxina de Pseudomonas mutada o uno de sus fragmentos citotóxicos y, en los usos particularmente preferidos, se selecciona del grupo que consiste en PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E, y PE38QQR, siendo la más preferida PE38.

En otro grupo de realizaciones, la invención proporciona los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos anti-CD22 de la invención descritos antes. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo completo, o se puede seleccionar del grupo que consiste en un scFv, un dsFv, un Fab, o un F(ab')2. En las formas particularmente preferidas, el anticuerpo es un dsFv. El ácido nucleico puede codificar adicionaímente un polipéptido que es un radical terapéutico o una marca detectable. El radical terapéutico puede ser un fármaco o una citotoxina. La citotoxina puede ser, por ejemplo, una exotoxina de Pseudomonas o uno de sus fragmentos citotóxicos, o una exotoxina de Pseudomonas mutada o uno de sus fragmentos citotóxicos y se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E y PE38QQR. En la forma más preferida, la exotoxina de Pseudomonas es PE38. La invención proporciona adicionalmente vectores de expresión que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos descritos antes conectado operablemente a un promotor.

En otro grupo más de realizaciones, la invención proporciona el anticuerpo anti- 0022 de la invención para su uso en un método de inhibición del crecimiento de una célula cancerosa CD22+. Los métodos pueden comprender poner en contacto la célula con el anticuerpo anti-CD22 fusionado o conjugado con un radical terapéutico, cuyo radical terapéutico inhibe el crecimiento de dicha célula. El anticuerpo puede ser un scFv, un dsFv, un Fab, o un F(ab')2. En una forma particularmente preferida, el anticuerpo es un dsFv. El anticuerpo terapéutico puede ser, por ejemplo, una citotoxina, un fármaco, un radioisótopo, o un liposoma cargado con un fármaco o una citotoxina. En las formas preferidas, el radical terapéutico es una citotoxina. La citotoxina puede ser, por ejemplo, ricina A, abrina, ribotoxina, ribonucleasa, saporina, caliqueamicina, toxina de la difteria o una de sus subunidades o mutantes citotóxicos, una exotoxina, de Pseudomonas, una de sus porciones citotóxicas, una exotoxina de Pseudomonas mutada, una de sus porciones citotóxicas, y las toxinas A a F de botulinum. En las formas preferidas, la citotoxina es una exotoxina de Pseudomonas o uno de sus fragmentos citotóxicos, o una exotoxina de Pseudomonas mutada o uno de sus fragmentos citotóxicos. En realizaciones particularmente preferidas, la exotoxina de Pseudomonas se selecciona del grupo que consiste en PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E, y PE38QQR. En la realización más preferida, la exotoxina de Pseudomonas es PE38.

La invención proporciona adicionalmente métodos para detectar la presencia de una célula cancerosa CD22+ en una muestra biológica, comprendiendo dicho método poner en contacto las células de dicha muestra biológica con un anticuerpo anti-CD22 de la invención, estando fusionado o conjugado dicho anticuerpo con una marca detectable; y detectando la presencia o ausencia de dicha marca, donde la detección de la presencia de dicha marca indica la presencia de una célula cancerosa CD22+ en dicha muestra. El anticuerpo puede ser seleccionado, por ejemplo, del grupo que consiste en un scFv, un dsFv, un Fab, o un F(ab')2. En una forma particularmente preferida, el anticuerpo es un dsFv.

En otro grupo de realizaciones, la invención proporciona kits para detectar la presencia de una célula cancerosa CD22+ en una muestra biológica, comprendiendo dicho kit un recipiente, y un anticuerpo anti-CD22 de la invención, cuyo anticuerpo está fusionado o conjugado con una marca detectable. En algunas realizaciones, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un scFv, un dsFv, un Fab, o un F(ab')2.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 3) y la secuencia de aminoácidos (SEG ID NO: 4) de la región variable de la cadena ligera de RFB4 y la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de la región variable de la cadena pesada de RFB4.

La Figura 2 es un impreso del Número de Entrada 038145 de la base de datos Kabat que muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de la región variable de la cadena ligera de RFB4 y la numeración de las posiciones de Kabat correspondiente a cada residuo aminoácido.

La Figura 3 es un impreso del Número de Entrada 038146 de la base de datos Kabat que muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de la región variable de la cadena pesada de RFB4 y la numeración de las posiciones de Kabat correspondiente a cada residuo aminoácido.

Descripción detallada de la invención

Introducción

La presente invención proporciona anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que tienen una afinidad de unión incrementada para las células cancerosas que portan el antígeno CD22 en comparación con el anticuerpo anti-CD22 conocido en la técnica como RFB4. Se han descubierto y aislado scFv mutados que tienen incrementos en la afinidad de 3,5 a 15 veces la afinidad del RFB4 de tipo salvaje. Las inmunotoxinas elaboradas con estas variantes de afinidad elevada presentaban un incremento significativo de la actividad citotóxica en comparación con una inmunoglobulina similar elaborada con RFB4 de tipo salvaje.

Estos mutantes cambian la secuencia de aminoácidos de los restos de las posiciones 100, 100A, y 100B de CDR3 de la cadena VH de RFB4 de la secuencia de tipo salvaje SSY a THW, YNW, o STY. Un único cambio de aminoácido, por ejemplo, la diferencia de un aminoácido entre la secuencia SSY y STY, redujo la constante de disociación (KD) de una inmunotoxina quimérica elaborada con el scFv resultante a 49 kD, en comparación con los 85 kD de una inmunotoxina similar utilizando la secuencia del anticuerpo RFB4 parental. Un cambio de SSY a TTW disminuyó la kD de la inmunotoxina resultante a 24 kD. Incluso más impresionantemente, la mutación de los restos SSY a YNW mejoró la afinidad de la inmunotoxina resultante de 85 kD de la inmunotoxina empleando el anticuerpo RFB4 de tipo salvaje, parental a 10 kD. Y la sustitución de THW por la secuencia de tipo salvaje SSY mejoró la afinidad incluso más, hasta 6 kD.

Estas afinidades mejoradas se reflejan en una mejor actividad citotóxica de las inmunotoxinas elaboradas fusionando o conjugando los anticuerpos o sus fragmentos que conservan la capacidad de reconocimiento del antígeno con una citotoxina. Por ejemplo, los ensayos de una inmunotoxina ilustrativa elaborada a partir de la combinación de un scFv que tiene una secuencia CDR3 de VH de RFB4, en la cual SSY se había mutado a STY, con una citotoxina demostró que la cantidad de inmunotoxina necesaria para inhibir 50% de la síntesis de proteínas (conocida como la CI50 de la inmunotoxina) en células cancerosas que expresan CD22 de pacientes se reducía tanto como 7 veces en comparación con una inmunotoxina similar elaborada con la secuencia SSY de tipo salvaje. Ensayos similares realizados con una inmunotoxina elaborada con la secuencia THW demostraron que la secuencia THW incrementaba la actividad citotóxica de la inmunotoxina para las células de la leucemia linfocítica crónica cancerosa que porta CD22 50 veces. También se elaboró una inmunotoxina con un dsFv que tenía la secuencia THW y se sometió a ensayo en busca de citotoxicidad frente a células de pacientes que tenían leucemia linfocítica crónica (CLL) o leucemia de células pilosas (HCL). La inmunotoxina dsFv THW mostró una citotoxicidad 10 a 40 veces mayor contra las células de CLL de lo que lo hizo la inmunotoxina dsFv RFB4 de tipo salvaje, y una citotoxicidad 4 a 7 veces mayor contra las células de HCL que la inmunotoxina dsFv RFB4 de tipo salvaje.

La mejora de la afinidad del anticuerpo y los fragmentos de anticuerpo mejorados proporcionados por la presente invención se puede incorporar a productos inmunoconjugados quiméricos para mejorar la capacidad del producto inmunoconjugado quimérico para localizar las células B diana que portan el antígeno CD22. Los productos inmunoconjugados pueden llevar, por ejemplo, una marca detectable tal como un radioisótopo o una enzima informadora. Estos productos inmunoconjugados marcados se utilizan, por ejemplo, en análisis in vitro para detectar la presencia de células que expresan CD22 en una muestra biológica. Típicamente, la muestra biológica será una muestra de sangre o linfocitos de una muestra de sangre.

En otro grupo de usos in vitro, el producto inmunoconjugado lleva una citotoxina en lugar de una marca detectable. Tales inmunotoxinas se pueden utilizar para purgar una muestra de sangre o cultivo de linfocitos de un paciente. La muestra o cultivo purgados se pueden volver a administrar después al paciente para reforzar la población de glóbulos blancos funcionales.

En las utilizaciones in vivo, se pueden emplear las inmunotoxinas elaboradas con los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención para inhibir el crecimiento y la proliferación de las células cancerosas que portan el antígeno CD22. Como se observa en la sección de Antecedentes, una inmunotoxina elaborada con el anticuerpo parental RFB4, se encuentra actualmente en pruebas clínicas en seres humanos y, cuando se somete a ensayo frente a un cáncer de expresa CD22 ilustrativo, ocasiona remisiones completas en 86% de los pacientes. La mayor afinidad de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la invención en comparación con el anticuerpo parental, RFB4, y la mayor citotoxicidad de las inmunotoxinas resultantes significa que se pueden administrar cantidades más pequeñas de las inmunotoxinas, logrando de ese modo el mismo efecto terapéutico a la vez que se reduce la oportunidad de efectos secundarios.

En realizaciones preferidas, el anticuerpo es un scFv o un dsFv. Muchas de las inmunotoxinas recombinantes producidas a partir de constructos de scFv tienen un tercio del tamaño de los productos conjugados químicos de IgG-toxina y tienen una composición homogénea. La eliminación de la porción constante de la molécula de IgG del scFv da como resultado un aclaramiento más rápido de la inmunotoxina después de su inyección en animales, incluyendo primates, y el menor tamaño de los productos conjugados mejora la penetración del fármaco en los tumores sólidos. Juntas, estas propiedades disminuyen los efectos secundarios asociados con el radical tóxico reduciendo el tiempo en el que la inmunotoxina (IT) interacciona con los tejidos no diana y los tejidos que expresan niveles muy bajos de antígeno. La elaboración de Fv estabilizados con disulfuro (dsFv) a partir de anticuerpos anti-CD22 se comenta en la solicitud de propiedad compartida de FitzGerald et al., Publicación Internacional Número WO 98/41641.

Sin embargo, estas ventajas son compensadas hasta cierto punto por la pérdida de afinidad de unión al antígeno que se produce cuando las IgG se convierten en scFv (Reiter et al., Nature Biotechnol. 14:239-1245 (1996)). Se ha demostrado que el aumento de afinidad mejora la liberación selectiva en el tumor de los scFv (Adams et al., Cancer Res. 58:485-490 (1998)), y es probable que incremente su utilidad en la formación de imágenes y el tratamiento de tumores. Por lo tanto, el incremento de afinidad de los scFv y otras fracciones localizadoras (tales como dsFv, Fab, y F(ab')2) de los productos inmunoconjugados es deseable para mejorar la eficacia de estos agentes en la liberación de moléculas efectoras, tales como toxinas y otros agentes terapéuticos, en sus dianas pretendidas. Por consiguiente la mejora de la afinidad de los anticuerpos de la invención es un importante avance en la liberación de toxinas, fármacos, y otros agentes terapéuticos para células de cánceres que expresan CD22.

En las siguientes secciones, se definen los términos utilizados en la presente memoria para una mayor claridad. La invención se describe con más detalle. Finalmente, los ejemplos demuestran la construcción y ensayo de las inmunotoxinas ilustrativas utilizando anticuerpos en los cuales STY, YNW, TTW, o THW han sustituido la secuencia SSY del anticuerpo RFB4.

Definiciones

Las unidades, prefijos, y símbolos se indican en la forma aceptada por el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A menos que se indique de otro modo, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación amino a carboxi. Los encabezamientos proporcionados en la presente memoria no son limitaciones de los diferentes aspectos de las realizaciones de la invención, que se pueden tomar como referencia para la memoria en su totalidad. Por consiguiente, los términos definidos inmediatamente más abajo se definen más completamente mediante la referencia a la memoria en su totalidad.

"CD22" hace referencia a un antígeno de las células B restringido por el linaje perteneciente a la superfamilia de las Ig. Es expresado en 60-70% de los linfomas y leucemias de las células B y no está presente sobre la superficie celular en las fases tempranas del desarrollo de las células B o sobre las células pluripotenciales. Véase, p. ej., Vaickus et al., Crit. Rev. Oncol/Hematol. 11:267-297 (1991).

Según se utiliza en la presente memoria, el término "anti-CD22" en referencia a un anticuerpo, hace referencia a un anticuerpo que se une específicamente a CD22 e incluye la referencia a un anticuerpo que se genera contra CD22. En las realizaciones preferidas, el CD22 es un CD22 de primate tal como CD22 humano. En una realización particularmente preferida, el anticuerpo se genera contra CD22 humano sintetizado por un mamífero no primate después de la introducción en el animal de un ADNc que codifica CD22 humano.

"RFB4" hace referencia a un anticuerpo monoclonal IgG1 de ratón que se une específicamente a CD22 humano. RFB4 es asequible comercialmente con el nombre RFB4 de diferentes fuentes, tales como Southern Biotechnology Associates, Inc. (Birmingham AL; Núm. de Cat. 9360-01) y Autogen Bioclear UK Ltd. (Clane, Wilts, Reino Unido; Núm. de Cat. AB147). RFB4 es altamente específico para las células de linaje B y no presenta reactividad cruzada con otros tipos de células normales. Li et al., Ceit. Immunol. 118:85-99 (1989). Las cadenas pesada y ligera de RFB4 han sido clonadas. Véase, Mansfield et al., Blood 90:2020-2026 (1997). La secuencia de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada de RFB4 son el SEQ ID NO: 1 y el SEQ ID NO: 2, respectivamente. La secuencia de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de RFB4 son el SEQ ID NO: 3 y el SEQ ID NO: 4, respectivamente. Las secuencias se exponen en la Figura 1.

A menos que se indique de otro modo, las referencias de la presente memoria a posiciones de aminoácidos de la cadena pesada o ligera de RFB4 hacen referencia a la numeración de aminoácidos en el sistema de "Kabat y Wu". Véase, Kabat, E., et al., SEGUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, U.S. Government Printing Office, NIH Publication Núm. 91-3242 (1991). Se debe observar que el número asignado a un resto en el sistema de Kabat y Wu no corresponde necesariamente al número que se podría obtener para un resto en una cadena pesada o ligera dadas contando desde el extremo amino de esa cadena. Las Figuras 2 y 3 muestran la correlación entre la numeración sucesiva de los restos de las cadenas ligera y pesada de RFB4 y la numeración de Kabat y Wu de esos restos. Por conveniencia, la numeración de "Kabat y Wu" es referida a veces en la presente memoria como numeración de "Kabat".

Según se utiliza en la presente memoria, "anticuerpo" incluye la referencia a una molécula de inmunoglobulina inmunológicamente reactiva con un antígeno concreto, e incluye anticuerpos tanto policlonales como monoclonales. El término también incluye formas diseñadas genéticamente tales como anticuerpos quiméricos (p. ej., anticuerpos murinos humanizados), anticuerpos heteroconjugados (p. ej., anticuerpos biespecíficos), fragmentos Fv de cadena sencilla recombinante (scFv), y fragmentos Fv estabilizados por disulfuro (dsFv) (véase, la Patente de los Estados Unidos Núm. del mismo propietario Núm. 5.747.654). El término "anticuerpo" también incluye formas de unión al antígeno de los anticuerpos (p. ej., Fab', F(ab')2, Fab, Fv y rlgG. Véase también, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Goldsby et al., eds., Kuby, J., Immunology, 4ª Ed., W.H. Freeman & Co., Nueva York (2000).

Se puede generar un anticuerpo inmunológicamente reactivo con un antígeno concreto mediante métodos recombinantes tales como ta selección de genotecas de anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares, véase, p. ej., Huse, et al., Science 246:1275-1281 (1989); Ward, et al., Nature 341:544-546 (1989); y Vaughan, et al., Nature Biotech. 14:309-314 (1996), o inmunizando un animal con el antígeno o con el ADN que codifica el antígeno.

Típicamente, una inmunoglobulina tiene una cadena pesada y una cadena ligera. Cada cadena pesada y ligera contiene una región constante y una región variable, (las regiones también son conocidas como "dominio"). Las regiones variables de la cadena ligera y pesada contienen una región "marco" interrumpida por tres regiones hipervariables, también denominadas "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR". La extensión de la región marco y de las CDR ha sido definida. Véase, Kabat y Wu, más arriba. Las secuencias de las regiones marco de diferentes cadenas ligeras o pesadas están relativamente conservadas dentro de las especies. La región marco de un anticuerpo, que son las regiones marco combinadas de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirve para situar y alinear las CDR en el espacio tridimensional.

Las CDR son responsables principalmente de la unión a un epítopo de un antígeno. Las CDR de cada cadena son referidas típicamente como CDR1, CDR2 y CDR3, numeradas sucesivamente partiendo del extremo N, y también son identificadas típicamente por la cadena en la cual está localizada la CDR concreta. De este modo, una CDR3 de VH está localizada en el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo en el cual se encuentra, mientras una CDR1 de VL es la CDR1 del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo en el cual se encuentra.

Las referencias a "VH" o una "VH" se refieren a ta región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo un Fv, scFv, dsFv o Fab. Las referencias a "VL" o una "VL" se refieren a la región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina, incluyendo Fv, scFv, dsFv o Fab.

La expresión "Fv de cadena sencilla" o "scFv" hace referencia a un anticuerpo en el que los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera de un anticuerpo bicatenario tradicional se han unido para formar una cadena. Típicamente, se inserta un péptido conector entre las dos cadenas para permitir el plegamiento apropiado y la creación de un sitio de unión activo.

El término "péptido conector" incluye la referencia a un péptido dentro de un fragmento de unión al anticuerpo (p. ej., fragmento Fv) que sirve para unir directamente el dominio variable de la cadena pesada al dominio variable de la cadena ligera.

El término "anticuerpo parental" representa cualquier anticuerpo de interés que vaya a ser mutado o variado para obtener anticuerpos o sus fragmentos que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo parental, pero con una afinidad mayor.

El término "punto de hipermutabilidad" representa una porción de una secuencia de nucleótidos de una CDR o de una región marco de un dominio variable que es un sitio de variación natural particularmente elevada. Aunque las CDR se consideran en sí mismas regiones de hipervariabilidad, se ha aprendido que las mutaciones no están uniformemente distribuidas a lo largo de todas las CDR. Se han identificado sitios concretos o puntos de hipermutabilidad, como las localizaciones que experimentan mutaciones concentradas. Los puntos de hipermutabilidad se caracterizan por numerosos rasgos estructurales y secuencias. Estos "motivos de puntos de hipermutabilidad" se pueden utilizar para identificar puntos de hipermutabilidad. Dos motivos de secuencias consenso que están especialmente bien caracterizados son la secuencia de tetranucleótidos RGYW y la secuencia de serina AGY, donde R es A o G, Y es C o T, y W es A o T.

Una "fracción localizadora" es la porción de un producto inmunoconjugado destinada a dirigir el producto inmunoconjugado a una célula de interés. Típicamente, la fracción localizadora es un anticuerpo, un scFv, un dsFv, un Fab, o un F(ab')2.

Un "radical tóxico" es la porción de una inmunotoxina que convierte la inmunotoxina en citotóxica para las células de interés.

Un "radical terapéutico" es la porción de un producto inmunoconjugado que se pretende que actúe como agente terapéutico.

El término "agente terapéutico" incluye cualquiera de Sos numerosos compuestos conocidos actualmente o desarrollados más tarde para actuar como anti- neoplásicos, anti-inflamatorios, citoquinas, anti-infecciosos, activadores o inhibidores enzimáticos, modificadores alostéricos, antibióticos u otros agentes administrados para inducir un efecto terapéutico deseado en un paciente. El agente terapéutico también puede ser una toxina o un radioisótopo, cuando el efecto terapéutico deseado es, por ejemplo, la eliminación de una célula cancerosa.

Una "marca detectable" representa, con respecto a un producto inmunoconjugado, una porción del producto inmunoconjugado que tiene la propiedad de hacer detectable su presencia. Por ejemplo, el producto inmunoconjugado puede estar marcado con un isótopo radiactivo que permite que las células en las cuales está presente et producto inmunoconjugado sean detectadas en análisis inmunohistoquímicos.

El término "radical efector" representa la porción de un producto inmunoconjugado destinado a tener efecto sobre una célula elegida como diana por la fracción localizadora o para identificar la presencia del producto inmunoconjugado. De este modo, el radical efector puede ser, por ejemplo, un radical terapéutico, una toxina, una radiomarca, o una marca fluorescente.

El término "producto inmunoconjugado" incluye la referencia a una conexión covalente de una molécula efectora a un anticuerpo. La molécula efectora puede ser una inmunotoxina.

Los términos "cantidad eficaz" o "cantidad eficaz para" o "cantidad terapéuticamente eficaz" incluyen la referencia a una dosificación de un agente terapéutico suficiente para producir el resultado deseado, tal como la inhibición de la síntesis de proteínas celular en al menos 50%, o la eliminación de la célula.

El término "toxina" incluye la referencia a abrina, ricina, exotoxina de Pseudomonas (PE), toxina de la difteria (DT), toxina de botulinum, o sus toxinas modificadas. Por ejemplo, PE y DT son compuestos muy tóxicos que ocasionan típicamente la muerte por toxicidad hepática. Sin embargo, PE y DT, pueden ser modificadas a una forma para su uso como inmunotoxina eliminando el componente dirigido nativo de la toxina (p. ej., el dominio la de PE o la cadena B de DT) y remplazándolo por una fracción localizadora diferente, tal como un anticuerpo.

El término "poner en contacto" incluye la referencia a la colocación en asociación física directa.

Un "plásmido de expresión" comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de interés, que está conectada operablemente a un promotor.

Según se utiliza en la presente memoria, "polipéptido", "péptido", y "proteína" se utilizan indistintamente e incluyen la referencia a un polímero de residuos aminoácido. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos aminoácido son análogos químicos artificiales de un aminoácido correspondiente de origen natural, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural. Los términos se aplican a polímeros que contienen sustituciones de aminoácidos conservativas de manera que la proteína sigue siendo funcional.

El término "resto" o "residuo aminoácido" o "aminoácido" incluye referencias a un aminoácido que es incorporado a una proteína, polipéptido, o péptido (en conjunto "péptido"). El aminoácido puede ser un aminoácido de origen natural y, a menos que se limite de otro modo, puede incluir análogos conocidos de aminoácidos naturales que pueden funcionar de una manera similar a los aminoácidos de origen natural.

Los aminoácidos y análogos referidos en la presente memoria se describen mediante designaciones taquigráficas como sigue en la Tabla A:

TABLA A Nomenclatura de Aminoácidos

Una "sustitución conservativa", cuando se describe una proteína hace referencia a un cambio en la composición de aminoácidos de la proteína que no altera sustancialmente la actividad de la proteína. De este modo, "variaciones modificadas conservativamente" de una secuencia de aminoácidos concreta hace referencia a sustituciones de aminoácidos de aquellos aminoácidos que no son críticos para la actividad de la proteína o la sustitución de aminoácidos por otros aminoácidos que tengan propiedades similares (p. ej., ácidos, alcalinos, cargados positivamente o negativamente, polares o no polares, etc.) de manera que las sustituciones de aminoácidos incluso críticos no alteran sustancialmente la actividad. Las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Los siguientes seis grupos de la Tabla B contienen aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí:

TABLA B

El término "sustancialmente similar" en el contexto de un péptido indica que un péptido comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos 90%, preferiblemente al menos 95% con la secuencia de referencia a lo largo de una ventana de comparación de 10-20 aminoácidos. El porcentaje de identidad de la secuencia se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas a lo largo de una ventana de comparación, donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (esto es, espacios) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que se encuentran bases de ácidos nucleicos o residuos aminoácido idénticos en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas por el número total de posiciones de la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de la secuencia.

La expresión "enlace disulfuro" o "enlace disulfuro cisteína-cisteína" hace referencia a una interacción covalente entre dos cisteínas en las que los átomos de azufre de las cisteínas están oxidados para formar un enlace disulfuro. La energía media de enlace de un enlace disulfuro es de aproximadamente 60 kcal/mol en comparación con 1-2 kcal/mol de un enlace de hidrógeno. En el contexto de esta invención, las cisteínas que forman el enlace disulfuro están en las regiones marco del anticuerpo de cadena sencilla y sirven para estabilizar la conformación del anticuerpo.

Los términos "conjugar", "acoplar", "unir" o "conectar" hacen referencia a convertir dos polipéptidos en una molécula de polipéptidos contiguos. En el contexto de la presente invención, los términos incluyen la referencia al acoplamiento de un radical de anticuerpo a una molécula efectora (ME). La conexión puede ser mediante medios químicos o recombinantes. Los medios químicos hacen referencia a una reacción entre el radical de anticuerpo y la molécula efectora de manera que se forma un enlace covalente entre las dos moléculas para formar una molécula.

Según se utiliza en la presente memoria, "recombinante" incluye la referencia a una proteína producida utilizando células que no tienen, en su estado nativo, una copia endógena del ADN capaz de expresar la proteína. Las células producen la proteína recombinante porque han sido alteradas genéticamente mediante la introducción de la secuencia aislada de ácido nucleico apropiada. El término también incluye la referencia a una célula, o ácido nucleico, o vector, que ha sido modificado por la introducción de un ácido nucleico heterólogo o la alteración de un ácido nucleico nativo a una forma no nativa para esa célula, o que la célula deriva de una célula modificada de ese modo. Así, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en la forma nativa (no recombinante) de la célula, expresan mutantes de genes que se encuentran en la forma nativa, o expresan genes nativos que de otro modo son expresados anormalmente, expresados a la baja o no expresados en absoluto.

Según se utiliza en la presente memoria, "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" incluye la referencia a un polímero desoxirribonucleotídico o ribonucleotídico en forma de hebra sencilla o doble, y a menos que se limite de otro modo, abarca los análogos conocidos de los nucleótidos naturales que hibridan con ácidos nucleicos de una manera similar a los nucleótidos de origen natural. A menos que se indique de otro modo, una secuencia de ácido nucleico concreta incluye su secuencia complementaria así como las variantes conservativas, esto es, ácidos nucleicos presentes en posiciones tambaleantes de codones y variantes que, cuando se traducen a proteína, dan como resultado una sustitución conservativa de un aminoácido.

Según se utiliza en la presente memoria, "codificante" con respecto a un ácido nucleico especificado, incluye la referencia a ácidos nucleicos que comprenden la información para la traducción a la proteína especificada. La información es especificada por el uso de codones. Típicamente, la secuencia de aminoácidos es codificada por el ácido nucleico utilizando el código genético "universal". No obstante, se pueden utilizar variantes del código universal, tales como la que está presente en mitocondrias de algunas plantas, animales, y hongos, la bacteria Mycoplasma capricolum (Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:2306-2309 (1985), o el ciliado Macronucleus, cuando el ácido nucleico es expresado utilizando la maquinaria traduccional de estos organismos.

La expresión "fusionar en marco" hace referencia al acoplamiento de dos o más secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos de manera que la secuencia de ácido nucleico acoplada se traduce a una proteína monocatenaria que comprende las cadenas polipeptídícas originales.

Según se utiliza en la presente memoria, "expresado" incluye la referencia a la traducción de un ácido nucleico a una proteína. Las proteínas pueden ser expresadas y permanecer intracelulares, convertirse en un componente de la membrana de la superficie celular o ser secretadas a la matriz o medio extracelular.

Por "célula anfitriona" se quiere significar una célula que pueda apoyar la replicación o expresión del vector de expresión. Las células anfitrionas pueden ser células procarióticas tales como E coli, o células eucarióticas tales como células de levadura, insecto, anfibio, o mamífero.

La frase "genoteca de presentación en fagos" hace referencia a una población de bacteriófagos, cada uno de los cuales contiene un ADNc foráneo fusionado recombinantemente en marco a una proteína de la superficie. Los fagos presentan la proteína foránea codificada por el ADNc sobre su superficie. Después de la replicación en un anfitrión bacteriano, típicamente E. coli, los fagos que contienen el ADNc foráneo de interés se seleccionan por medio de la expresión de la proteína foránea sobre la superficie del fago.

Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad" en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, hacen referencia a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos aminoácido o nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y se alinean para una máxima correspondencia, como se mide utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual.

La expresión "esencialmente idéntico", en el contexto de los ácidos nucleicos o polipéptidos, hace referencia a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen una identidad de nucleótidos o residuos aminoácido de al menos 60%, más preferiblemente 65%, incluso más preferiblemente 70%, aún más preferiblemente 75%, incluso más preferiblemente 80%, y muy preferiblemente 90-95%, cuando se comparan y se alinean para una correspondencia máxima, como se mide utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Preferiblemente, la identidad esencial existe a lo largo de una región de las secuencias que tiene al menos aproximadamente 50 restos de longitud, más preferiblemente a lo largo de una región de al menos aproximadamente 100 restos, y muy preferiblemente las secuencias son esencialmente idénticas a lo largo de al menos aproximadamente 150 restos. En una realización muy preferida, las secuencias son esencialmente idénticas a lo largo de toda la longitud de las regiones codificantes.

Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la cual se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de las subsecuencias, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. El algoritmo de comparación de secuencias calcula después el porcentaje de identidad de las secuencias para la secuencia o las secuencias de ensayo con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa designado.

El alineamiento óptimo de las secuencias para su comparación se puede llevar a cabo, p. ej., mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento por homología de Needlman y Wunsch, J. Mol. Biol, 48:443 (1970), mediante la búsqueda por el método de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones cornputarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Soporte Lógico de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), o mediante inspección visual (véase generalmente, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley and Sons, Inc., (Suplemento de 1995) (Ausubel)).

Los ejemplos de los algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que son descritos por Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 y Altschul et al., (1977) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, respectivamente. El soporte lógico para realizar los análisis BLAST se encuentra disponible al público a través del Centro nacional para la Información de Biotecnología (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica la identificación primero de los pares de secuencias de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia problema, que coinciden o satisfacen una cierta puntuación T del umbral de valor positivo alineadas con una palabra de la misma longitud de la secuencia de la base de datos. T es referido como el umbral de puntuación de la palabra vecina (Altschul et al., más arriba). Estos éxitos de la palabra vecina inicial actúan como semillas para iniciar las búsquedas para encontrar HSP más largas que los contengan. Los éxitos de las palabras se prolongan después en ambas direcciones a lo Sargo de cada secuencia tanto como se puede incrementar la puntuación del alineamiento cumulativo. Las puntuaciones cumulativas se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación recompensa para un par de restos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para restos que no coinciden; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación cumulativa. La prolongación de los éxitos de las palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento cumulativo decae en una cantidad X desde su máximo valor alcanzado; la puntuación cumulativa tiende a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de restos de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una esperanza (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas hebras. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una esperanza (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)).

Además de calcular el porcentaje de identidad de la secuencia, el algoritmo BLAST también realiza una análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, p. ej. Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual se produce por casualidad una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de la suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0,1, más preferiblemente menor de aproximadamente 0,01, y muy preferiblemente menor de aproximadamente 0,001.

Una indicación adicional de que dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos son esencialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico presenta reacción cruzada inmunológica con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe más abajo. De este modo, un polipéptido es típicamente esencialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren solamente en sustituciones conservativas. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son esencialmente idénticas es que las dos moléculas hibridan entre sí en condiciones restrictivas, como se describe más abajo.

El término "in vivo" incluye la referencia al interior del cuerpo del organismo del cual se obtuvo la célula. "Ex vivo" e "in vitro" significa fuera del cuerpo del organismo del cual se obtuvo la célula.

La expresión "célula maligna" o "malignidad" hace referencia a tumores o células tumorales que son invasivas y/o capaces de sufrir metástasis, esto es, una célula cancerosa.

Según se utiliza en la presente memoria, "células de mamífero" incluye la referencia a células derivadas de mamíferos incluyendo seres humanos, ratas, ratones, cobayas, chimpancés, o macacos. Las células se pueden cultivar in vivo o in vitro.

El término "selectivamente reactivo" hace referencia, con respecto a un antígeno, a la asociación preferente de un anticuerpo, en su totalidad o en parte, con una célula o tejido que porta el antígeno y no a las células o tejidos que carecen de ese antígeno. Por supuesto, se reconoce que se puede producir un cierto grado de interacción no específica entre una molécula y una célula o tejido no diana. Sin embargo, la reactividad selectiva se puede distinguir al estar mediada por el reconocimiento específico del antígeno. Aunque los anticuerpos reactivos selectivamente se unen al antígeno, pueden hacerlo con una afinidad baja. Por otra parte, la unión específica da como resultado una asociación mucho más fuerte entre el anticuerpo y las células que portan el antígeno que entre el anticuerpo unido y las células que carecen del antígeno. La unión específica produce típicamente un incremento mayor de 2 veces, preferiblemente mayor de 5 veces, más preferiblemente mayor de 10 veces y muy preferiblemente mayor de 100 veces en la cantidad de anticuerpo unido (por unidad de tiempo) a una célula o tejido que porta CD22 en comparación con una célula o tejido que carece de CD22. La unión específica a una proteína en tales condiciones requiere un anticuerpo que sea seleccionado por su especificidad para una proteína concreta. Son apropiados para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína concreta una variedad de formatos de inmunoanálisis. Por ejemplo, los inmunoanálisis ELISA en fase sólida se utilizan rutinariamente para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunorreactivos con una proteína. Véase Harlow y Lañe, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York (1988), para una descripción de formatos de inmunoanálisis y condiciones que se pueden utilizar para determinar la inmunorreactividad específica.

El término "condiciones inmunológicamente reactivas" incluye la referencia a condiciones que permiten que un anticuerpo generado para un epítopo concreto se una a ese epítopo en un grado detectablemente mayor que, y/o hasta la exclusión sustancial, de la unión a sustancialmente todos los demás epítopos. Las condiciones inmunológicamente reactivas dependen del formato de la reacción de unión al anticuerpo y típicamente son aquellas utilizadas en los protocolos de inmunoanálisis o aquellas condiciones encontradas in vivo. Véase Harlow y Lane, más arriba, para una descripción de los formatos y las condiciones de inmunoanálisis. Preferiblemente, las condiciones inmunológicamente reactivas empleadas en los métodos de la presente invención son "condiciones fisiológicas" que incluyen la referencia a las condiciones (p. ej., temperatura, osmolaridad, pH) que son típicas en el interior de un mamífero vivo o una célula de mamífero. Si bien se reconoce que algunos órganos están sujetos a condiciones extremas, el entorno intra-organismo e intracelular se encuentra en torno a pH 7 (esto es, de pH 6,0 a pH 8,0, más típicamente de pH 6,5 a pH 7,5), contiene agua como disolvente predominante, y existe a una temperatura superior a 0ºC e inferior a 50ºC. La osmolaridad se encuentra en un intervalo que apoya la viabilidad y la proliferación celular.

Numeración de restos aminoácido en las cadenas pesada y ligera de RFB4

Las posiciones de los residuos aminoácido en una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo son referidas convenientemente en la técnica mediante numeraciones convencionales como exponen Kabat, E., et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, U.S. Government Printing Office, NIH Publication Núm. 91-3242 (1991). Véase también, Johnson, G. y Wu, T., Nuc. Acids Res. 29:205-206 (2001). La base de datos de Kabat et al. es referida típicamente en la técnica como "Kabat" o "Kabat y Wu". Se mantiene en la actualidad en línea en http://immuno.bme.nwu.edu. Las cadenas pesada y ligera de RFB4 han sido clonadas. Véase, Mansfield et al., Blood 90:2020-2026 (1997). Las secuencias de aminoácidos de las cadenas VL y VH de RFB4 y una lista de la numeración de Kabat de la posición de cada residuo aminoácido se exponen en la base de datos de Kabat con los Números de Entrada 038145 y 038146, respectivamente. La Figura 2 muestra la comparación de la numeración de los aminoácidos de la cadena VL de RFB4 con las correspondientes posiciones de Kabat expuestas en la Entrada de Kabat 038145; la Figura 3 muestra la misma comparación para los aminoácidos de la cadena VH de RFB4, expuestas en la Entrada de Kabat 038146.

Unión de anticuerpos e inmunoanálisis

A. Afinidad de Unión de los Anticuerpos

Los anticuerpos de esta invención se unen a sus antígenos diana con una afinidad mejor que la del anticuerpo RFB4 parental. Los anticuerpos son anticuerpos anti-CD22 que se unen a un epítopo extracelular de CD22. La afinidad de unión para un antígeno diana se mide o determina típicamente mediante análisis anticuerpo- antígeno convencionales, tales como análisis competitivos, análisis de saturación, o inmunoanálisis tales como ELISA o RIA.

Tales análisis se pueden utilizar para determinar la constante de disociación del anticuerpo. La expresión "constante de disociación" hace referencia a la afinidad de un anticuerpo por un antígeno. La especificidad de unión entre un anticuerpo y un antígeno existe si la constante de disociación (KD = 1/K, donde K es la constante de afinidad) del anticuerpo es < 1 µM, preferiblemente < 100 nM, y muy preferiblemente < 0,1 nM. Las moléculas de anticuerpo tendrán típicamente una KD en los intervalos inferiores. KD = [Ab-Ag]/[Ab][Ag] donde [Ab] es la concentración en equilibrio del anticuerpo, [Ag] es la concentración en equilibrio del antígeno y [Ab-Ag] es la concentración en equilibrio del complejo anticuerpo-antígeno. Típicamente, las interacciones de unión entre antígeno y anticuerpo incluyen asociaciones no covalentes reversibles tales como la atracción electrostática, las fuerzas de Van der Waals y los enlaces de hidrógeno. Este método de definir la especificidad de unión se aplica a las cadenas pesadas y/o ligeras individuales, las CDR, las proteínas de fusión o los fragmentos de las cadenas pesadas y/o ligeras, que son específicos para CD22 si se unen a CD22 solo o combinado.

B. Inmunoanálisis

Los anticuerpos pueden ser detectados y/o cuantificados utilizando cualquiera de los numerosos análisis de unión inmunológica bien conocidos (véanse, p. ej., las Patentes de los Estados Unidos 4.366.241; 4.376.110; 4.517.288; y 4.837.168). Para una revisión de los inmunoanálisis generales, véase también METHODS IN CELL BIOLOGY, VOL. 37, Asai, ed. Academic Press, Inc. Nueva York (1993); BASIC AND CLIN1CAL 1MMUNOLOGY 7ª EDICIÓN, Stites y Ter, eds. (1991). Los análisis de unión inmunológica (o inmunoanálisis) utilizan típicamente un ligando (p. ej., CD22) para unirse específicamente a, y a menudo inmovilizar, un anticuerpo. Los anticuerpos empleados en los inmunoanálisis de la presente invención se comentan con mayor detalle más arriba.

Los inmunoanálisis también utilizan a menudo un agente de mareaje para unirse específicamente y para marcar el complejo de unión formado por el ligando y el anticuerpo. El agente de mareaje puede ser a su vez uno de los radicales que comprenden el complejo anticuerpo/analito, esto es, el anticuerpo anti-CD22. Alternativamente, el agente de mareaje puede ser un tercer radical, tal como otro anticuerpo, que se une específicamente al complejo anticuerpo/proteína CD22.

En un aspecto, se contempla un análisis competitivo en el que el agente de mareaje es un segundo anticuerpo anti-CD22 que porta una marca. Los dos anticuerpos compiten después por la unión al CD22 inmovilizado. Alternativamente, en un formato no competitivo, el anticuerpo para CD22 carece de marca, pero un segundo anticuerpo específico para los anticuerpos de la especie de la cual deriva el anticuerpo anti-CD22, p. ej., murino, y que se une al anticuerpo anti-CD22, está marcado.

Otras proteínas capaces de unirse específicamente a regiones constantes de inmunoglobulina, tales como la Proteína A o la Proteína G también pueden ser utilizadas como agente de mareaje. Estas proteínas son constituyentes normales de las paredes celulares de las bacterias estreptocócicas. Muestran una fuerte reactividad no inmunogénica con las regiones constantes de las inmunoglobulinas de una variedad de especies (véase, generalmente Kronval, et al., J. Immunol. 111:1401-1406 (1973); y Akerstrom, et al., J. Immunol. 135:2589-2542 (1985)).

En los análisis, se pueden requerir etapas de incubación y/o lavado después de cada combinación de reactivos. Las etapas de incubación pueden variar de aproximadamente 5 segundos a varias horas, preferiblemente de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 24 horas. No obstante, el tiempo de incubación dependerá del formato de análisis, el anticuerpo, el volumen de solución, las concentraciones, y similares. Normalmente, los análisis se llevarán a cabo a la temperatura ambiente, aunque se pueden llevar a cabo en un intervalo de temperaturas, por ejemplo de 10º a 40ºC.

Si bien los detalles de los inmunoanálisis de la presente invención pueden variar con el formato concreto empleado, el método de detección de los anticuerpos anti-CD22 en una muestra que contiene los anticuerpos comprende generalmente las etapas de poner en contacto la muestra con un anticuerpo que reacciona específicamente, en condiciones inmunológicamente reactivas, con el complejo CD22/anticuerpo.

Producción de productos inmunoconjugados

Los productos inmunoconjugados incluyen, pero no está limitados a, moléculas en las que hay un enlace covalente de un agente terapéutico a un anticuerpo. Un agente terapéutico es un agente con una actividad biológica concreta dirigida contra una molécula diana particular o una célula que porta una molécula diana. Un experto en la técnica apreciará que los agentes terapéuticos pueden incluir diferentes fármacos tales como vinblastina, daunomicina y similares, citotoxinas tales como la exotoxina de Pseudomonas o la toxina de la Difteria nativa o modificada, agentes encapsulantes, (p. ej., liposomas) que contienen composiciones farmacológicas, agentes radiactivos tales como I125, P32, C14, H3 y S35 y otras marcas, fracciones localizadores y ligandos.

La elección de un agente terapéutico concreto depende de la molécula o célula diana concreta y del efecto biológico que se desea evocar. De este modo, por ejemplo, el agente terapéutico puede ser una citotoxina que se utiliza para ocasionar la muerte de una célula diana concreta. Por el contrario, cuando solamente se desea evocar una respuesta biológica no letal, el agente terapéutico puede ser conjugado con un agente farmacológico no letal o un liposoma que contiene un agente farmacológico no letal.

Con los agentes terapéuticos y los anticuerpos proporcionados en la presente memoria, un experto en la técnica puede construir fácilmente una variedad de clones que contienen ácidos nucleicos funcionalmente equivalentes, tales como ácidos nucleicos que difieren en la secuencia pero que codifican la misma ME o secuencia de anticuerpo. De este modo, la presente invención proporciona ácidos nucleicos que codifican anticuerpos y productos conjugados y sus proteínas de fusión.

A. Métodos Recombinantes

Las secuencias de ácido nucleico de la presente invención se pueden preparar mediante cualquier método adecuado incluyendo, por ejemplo, la clonación de las secuencias apropiadas o mediante síntesis química directa por métodos tales como el método del fosforotriéster de Narang, et al., Meth. Enzymol, 68:90-99 (1979); el método del fosfodiéster de Brown, et al., Meth. Enzymol. 68:109-151 (1979); el método de la dietilfosforamidita de Beaucage, et al., Tetra. Lett. 22:1859-1862 (1981); el método del triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por Beaucage y Caruthers, Tetr. Letts. 22(20): 1859-1862 (1981), p. ej., utilizando un sintetizador automatizado como describen, por ejemplo, Needham-VanDervanter, et al., Nucl. Acids Res. 12:6159-6168 (1984); y el método del soporte sólido de la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.458.066. La síntesis química produce un

Reivindicaciones:

1. Un anticuerpo anti-CD22 con una cadena ligera variable (VL) que tiene la secuencia de la cadena VL del anticuerpo RFB4 de la Figura 1 y una cadena pesada variable (VH) que tiene la secuencia de la cadena VH del anticuerpo RFB4 de la Figura 1, siempre que los restos SSY de las posiciones 104, 105 y 106 de CDR3 de la cadena VH de dicho anticuerpo anti-CD22 sean remplazados por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en THW, YNW, TTW y STY.

2. Un anticuerpo de la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un scFv, un dsFv, un Fab y un F(ab')2.

3. Un anticuerpo de la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo tiene una metionina añadida en el extremo N.

4. Un anticuerpo que es una forma humanizada del anticuerpo murino de la reivindicación 1.

5. Una composición que comprende un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 conjugado o fusionado con un radical terapéutico o una marca detectable.

6. Una composición de la reivindicación 5, donde el radical terapéutico se selecciona del grupo que consiste en una citotoxina, un fármaco, un radioisótopo y un liposoma cargado con un fármaco o una citotoxina.

7. Una composición de la reivindicación 6, donde el radical terapéutico es una citotoxina.

8. Una composición de la reivindicación 7, donde la citotoxina se selecciona del grupo que consiste en ricina A, abrina, ribotoxina, ribonucleasa, saporina, caliqueamicina, toxina de la difteria o una de sus subunidades citotóxicas o mutantes, una exotoxina de Pseudomonas, una de sus porciones citotóxicas, una exotoxina de Pseudomonas mutada, una de sus porciones citotóxicas y las toxinas A a F de botulinum.

9. Una composición de la reivindicación 8, donde dicha citotoxina es una exotoxina de Pseudomonas o uno de sus fragmentos citotóxicos, o una exotoxina de Pseudomonas mutada o uno de sus fragmentos citotóxicos.

10. Una composición de la reivindicación 9, donde dicha exotoxina de Pseudomonas o uno de sus fragmentos se selecciona del grupo que consiste en PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E y PE38QQR.

11. Una composición de la reivindicación 10, donde el fragmento de exotoxina de Pseudomonas es PE38.

12. Una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, que comprende adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable.

13. El uso de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12 para la fabricación de un medicamento para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa CD22+.

14. Un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-CD22 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

15. Un ácido nucleico de la reivindicación 14, donde adicionalmente dicho ácido nucleico codifica un polipéptido que es un radical terapéutico o una marca detectable.

16. Un ácido nucleico de la reivindicación 15, donde adicionalmente dicho radical terapéutico es un fármaco o una citotoxina.

17. Un ácido nucleico de la reivindicación 16, donde dicha citotoxina es una exotoxina de Pseudomonas o uno de sus fragmentos citotóxicos, o una exotoxina de Pseudomonas mutada o uno de sus fragmentos citotóxicos.

18. Un ácido nucleico de la reivindicación 17, donde dicha exotoxina de Pseudomonas o uno de sus fragmentos se seleccionan del grupo que consiste en PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E y PE38QQR.

19. Un ácido nucleico de la reivindicación 18, donde el fragmento de exotoxina de Pseudomonas es PE38.

20. Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19 conectado operablemente a un promotor.

21. Un método para detectar la presencia de una célula cancerosa CD22+ en una muestra biológica, comprendiendo dicho método:

(a) poner en contacto células de dicha muestra biológica con un anticuerpo anti-CD22 con una cadena ligera variable (VL) que tiene la secuencia de la cadena VL del anticuerpo RFB4 de la Figura 1 y una cadena pesada variable (VH) que tiene la secuencia de la cadena VH del anticuerpo RFB4 de la Figura 1, siempre que los restos SSY de las posiciones 104, 105 y 106 de CDR3 de la cadena VH de dicho anticuerpo anti-CD22 sean remplazados por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en THW, YNW, TTW y STY, estando fusionado o conjugado dicho anticuerpo con una marca detectable; y (b)detectar la presencia o ausencia de dicha marca,

donde la detección de la presencia de dicha marca indica la presencia de una célula cancerosa CD22+ en dicha muestra.

22. Un método de la reivindicación 21, donde dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un scFv, un dsFv, un Fab y un F(ab')2.

23. Un kit para detectar la presencia de una célula cancerosa CD22+ en una muestra biológica, comprendiendo dicho kit:

(a) un recipiente; y (b) un anticuerpo anti-CD22 con una cadena ligera variable (VL) que tiene la secuencia de la cadena VL del anticuerpo RFB4 de la Figura 1 y una cadena pesada variable (VH) que tiene la secuencia de la cadena VH del anticuerpo RFB4 de la Figura 1, siempre que los restos 104, 105 y 106 de CDR3 de la cadena VH de dicho anticuerpo anti-CD22 sean remplazados por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en THW, YNW, TTW y STY, cuyo anticuerpo está fusionado o conjugado con una marca detectable.

24. Un kit de la reivindicación 23, donde dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un scFv, un dsFv, un Fab, y un F(ab')2.

25. Un método de inhibición del crecimiento de una célula cancerosa CD22+ poniendo en contacto dicha célula in vitro con un anticuerpo anti-CD22 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el anticuerpo está fusionado o conjugado con una citotoxina, cuya citotoxina inhibe el crecimiento de dicha célula.

26. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, para su uso en un método para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa CD22+.


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