ANTICUERPOS ANTI-CD22 CON AFINIDAD AUMENTADA POR LAS CELULAS LEUCEMICAS QUE EXPRESAN CD22.

Un anticuerpo anti-CD22 con una cadena ligera variable (VL) que tiene la secuencia de la cadena VL del anticuerpo RFB4 de la Figura 1 y una cadena pesada variable

(VH) que tiene la secuencia de la cadena VH del anticuerpo RFB4 de la Figura 1, siempre que los restos SSY de las posiciones 104, 105 y 106 de CDR3 de la cadena VH de dicho anticuerpo anti-CD22 sean remplazados por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en THW, YNW, TTW y STY

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US02/30316.

Solicitante: THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA AS REPRESENTED BY THE SECRETARY OF HEALTH AND HUMAN.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: OFFICE OF TECHNOLOGY TRANSFER, 6011 EXECUTIVE BOULEVARD, SUITE NO. 325,ROCKVILLE, MD 20854.

Inventor/es: PASTAN, IRA, H., KREITMAN, ROBERT J., SALVATORE,GIULIANA, BEERS,RICHARD.

Fecha de Publicación: .

Fecha Concesión Europea: 19 de Mayo de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K16/28A

Clasificación PCT:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen antígenos... > A61K39/395 (Anticuerpos (aglutininas A61K 38/36 ); Inmunoglobulinas; Inmunosuero, p. ej. suero antilinfocitario)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/53 (Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > C07K16/00 (Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/63 (Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS;... > Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido... > C07H21/04 (con desoxirribosilo como radical sacárido)

Clasificación antigua:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen antígenos... > A61K39/395 (Anticuerpos (aglutininas A61K 38/36 ); Inmunoglobulinas; Inmunosuero, p. ej. suero antilinfocitario)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/53 (Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > C07K16/00 (Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/63 (Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS;... > Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido... > C07H21/04 (con desoxirribosilo como radical sacárido)
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Fragmento de la descripción:

Anticuerpos anti-CD22 con afinidad aumentada por las células leucémicas que expresan CD22.

Antecedentes de la invención

Las malignidades hematológicas son un grave problema de salud pública. Se ha estimado que en el año 2000, se produjeron más de 50.000 nuevos casos de linfoma no Hodgkin y más de 30.000 nuevos casos de leucemia en los Estados Unidos (Greenlee, R.T. et al., CA Cancer J. Clin., 50:7-33 (2000)) y se esperaban más de 45.000 muertes por estas enfermedades. Muchos más pacientes viven con una morbidez relacionada con enfermedades crónicas. Desafortunadamente, en un elevado porcentaje de pacientes, las terapias convencionales no son capaces de inducir remisiones completas a largo plazo.

En los últimos años se han desarrollado inmunotoxinas como enfoque terapéutico alternativo para tratar estas malignidades. Las inmunotoxinas estaban compuestas originalmente por un anticuerpo conjugado químicamente con una toxina vegetal o bacteriana. El anticuerpo se une al antígeno expresado en la célula diana y la toxina es internalizada ocasionando la muerte celular al detener la síntesis de proteínas e inducir la apoptosis (Brinkmann, U., Mol. Med. Today, 2:439-446 (1996)).

Las malignidades hematológicas son una diana atractiva para las terapias con inmunotoxinas ya que las células tumorales son fácilmente accesibles y tos antígenos diana son altamente expresados (Kreitman, R.J. y Pastan, I., Semin. Cancer. Biol., 6:297-306 (1995)). Uno de estos antígenos es CD25. Una prueba clínica con la inmunotoxina LMB-2 (anti-Tac(Fv)-PE38) que se dirige a CD25 demostró que el agente era bien tolerado y que tenía una actividad anti-tumoral sustancial (Kreitman, R.J. et al., Blood, 94:3340-3348 (1999); Kreitman, R.J. et al., J. Clin. Oncol. 18:16222- 1636 (2000)). Se observó una respuesta completa en un paciente con Leucemia de Células Pilosas y se observaron respuestas parciales en pacientes con Leucemia de Células Pilosas, leucemia linfocítica crónica, linfoma cutáneo de células T, enfermedad de Hodgkin y leucemia de células T adultas.

Otro antígeno que se ha utilizado como diana de inmunotoxinas es CD22, un antígeno de células B restringido por el linaje expresado en 60%-70% de los linfomas y leucemias de células B. CD22 no está presente sobre la superficie celular en las fases tempranas de desarrollo de las células B y no es expresado sobre las células pluripotenciales (Tedder, T.F. et al., Annu. Rev. Immunol, 5:481-504 (1997)). Se han llevado a cabo pruebas clínicas con una inmunotoxina que contiene un anticuerpo anti- CD22, RFB4, o su fragmento Fab, acoplado a ricina A desglicosilada. En estas pruebas se han observado respuestas clínicas sustanciales; no obstante, el síndrome de extravasación capilar, grave y en algunos casos fatal, resultó limitante de la dosis (Sausvilie, E.A. et al., Blood, 85:3457-3465 (1995); Amlot, P.L et al., Blood, 82:2624-2633 (1993); Vitetta, E.S, et al., Cancer Res., 51:4052-4058 (1991)).

Como enfoque alternativo, se utilizó el anticuerpo RFB4 para elaborar una inmunotoxina recombinante en la cual el fragmento Fv en forma de cadena sencilla se fusiona con una forma truncada de 38 kDa de la exotoxina A de Pseudomonas (PE38). PE38 contiene los dominios de translocación y de ribosilación del ADP de PE pero no la porción de unión a la célula (Hwuang, J. et al., Cell, 48:129-136 (1987)). RFB4 (Fv)-PE38 es citotóxico para las células CD22 positivas (Mansfield, E. et al., Biochem. Soc. Trans., 25:709-714 (1997)). Para estabilizar la inmunotoxina Fv de cadena sencilla y hacerla más adecuada para su desarrollo clínico, se diseñaron restos cisteína en regiones marco de VH y VL (Mansfield, E. et al., Blood, 90:2020-2026 (1997)) generando la molécula RFB4(dsFv)-PE38.

RFB4 (dsFv)-PE38 es capaz de eliminar las células leucémicas de pacientes e inducir remisiones completas en ratones que portan xenoinjertos de linfomas (Kretiman, R.J. et al., Clin. Cancer Res., 6:1476-1487 (2000); Kreitman, RJ. et al., Int. J. Cancer, 81:148-155 (1999)). RFB4 (dsFv)-PE38 (BL22) está siendo evaluado actualmente en un ensayo clínico en fase I en el Instituto Nacional del Cancer en pacientes con malignidades hematológicas. Se trataron dieciséis pacientes con leucemia de células pilosas resistente a análogos de purina con BL22 y 11 (86%) alcanzaron remisiones completas (Kreitman, R.J. et al., N. Engl. J. Med. (2001).

Debido a los beneficios clínicos obtenidos con BL22, y debido a que se ha demostrado que la mejora de la afinidad de unión mejora la liberación selectiva en el tumor de los scFv (Adams et al., Cancer Res. 58:485-490 (1998)), la mejora de la afinidad de unión de los scFv y otras fracciones localizadoras (tales como dsFv, Fab, y F(ab')2) de los productos inmunoconjugados pudo mejorar la eficacia de estos agentes al liberar moléculas efectoras para las células B malignas. El direccionamiento mejorado disminuye probablemente la dosis necesaria para lograr la remisión completa de estos cánceres.

Los factores que influyen en la afinidad de unión son afectados de manera múltiple y la obtención de scFv mutantes con una afinidad mejorada no es trivial. Aunque la estructura cristalina del anticuerpo-antígeno puede sugerir qué restos están implicados en la unión, los datos estructurales de la resolución atómica no se encuentran disponibles para la mayoría de los anticuerpos. Por otra parte, incluso cuando tales datos están disponibles generalmente no se puede predecir qué restos y qué mutaciones darán como resultado un anticuerpo con un incremento de la actividad de unión al antígeno.

Breve resumen de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos mejorados para la unión a células que expresan CD22 (una "célula CD22+"), especialmente células cancerosas que expresan CD22 sobre su superficie exterior (una "célula cancerosa CD22+"). Con respecto a esto, la invención proporciona anticuerpos anti-CD22 con una cadena ligera variable (VL) que tiene la secuencia del anticuerpo RFB4 de la Figura 1 y una cadena pesada variable (VH) que tiene la secuencia de un anticuerpo RFB4 de ta Figura 1, pero en los que los restos 100, 100A y 100B de CDR3 de dicha cadena VH enumerada por el sistema de numeración de Kabat y Wu (restos 104, 105 y 106 como se numera de acuerdo con la Figura 1) tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: THW, YNW, TTW, y STY. El anticuerpo puede ser una molécula de anticuerpo completa, pero es preferiblemente un Fv de cadena sencilla ("scFv"), un Fv estabilizado con disulfuro ("dsFv"), un Fab, o un F(ab'). En una forma particularmente preferida, el anticuerpo es dsFv. (Por conveniencia para la referencia, el término "anticuerpo" del texto de más abajo hace referencia a anticuerpos completos y, más preferiblemente, a scFv, dsFv, Fab, o F(ab')).

La invención proporciona adicionalmente composiciones que comprenden uno de estos anticuerpos conjugado o fusionado con un radical terapéutico o una marca detectable. El radical terapéutico puede ser una citotoxina, un fármaco, un radioisótopo, o un liposoma cargado con un fármaco o una citotoxina. En las realizaciones preferidas, el radical efector es una citotoxina. La citotoxina puede ser seleccionada del grupo que consiste en ricina A, abrina, ribotoxina, ribonucleasa, saporina, caliqueamicina, toxina de la difteria o una subunidad citotóxica o uno de sus mutantes, una exotoxina de Pseudomonas,...

 


Reivindicaciones:

1. Un anticuerpo anti-CD22 con una cadena ligera variable (VL) que tiene la secuencia de la cadena VL del anticuerpo RFB4 de la Figura 1 y una cadena pesada variable (VH) que tiene la secuencia de la cadena VH del anticuerpo RFB4 de la Figura 1, siempre que los restos SSY de las posiciones 104, 105 y 106 de CDR3 de la cadena VH de dicho anticuerpo anti-CD22 sean remplazados por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en THW, YNW, TTW y STY.

2. Un anticuerpo de la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un scFv, un dsFv, un Fab y un F(ab')2.

3. Un anticuerpo de la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo tiene una metionina añadida en el extremo N.

4. Un anticuerpo que es una forma humanizada del anticuerpo murino de la reivindicación 1.

5. Una composición que comprende un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 conjugado o fusionado con un radical terapéutico o una marca detectable.

6. Una composición de la reivindicación 5, donde el radical terapéutico se selecciona del grupo que consiste en una citotoxina, un fármaco, un radioisótopo y un liposoma cargado con un fármaco o una citotoxina.

7. Una composición de la reivindicación 6, donde el radical terapéutico es una citotoxina.

8. Una composición de la reivindicación 7, donde la citotoxina se selecciona del grupo que consiste en ricina A, abrina, ribotoxina, ribonucleasa, saporina, caliqueamicina, toxina de la difteria o una de sus subunidades citotóxicas o mutantes, una exotoxina de Pseudomonas, una de sus porciones citotóxicas, una exotoxina de Pseudomonas mutada, una de sus porciones citotóxicas y las toxinas A a F de botulinum.

9. Una composición de la reivindicación 8, donde dicha citotoxina es una exotoxina de Pseudomonas o uno de sus fragmentos citotóxicos, o una exotoxina de Pseudomonas mutada o uno de sus fragmentos citotóxicos.

10. Una composición de la reivindicación 9, donde dicha exotoxina de Pseudomonas o uno de sus fragmentos se selecciona del grupo que consiste en PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E y PE38QQR.

11. Una composición de la reivindicación 10, donde el fragmento de exotoxina de Pseudomonas es PE38.

12. Una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, que comprende adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable.

13. El uso de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12 para la fabricación de un medicamento para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa CD22+.

14. Un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-CD22 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

15. Un ácido nucleico de la reivindicación 14, donde adicionalmente dicho ácido nucleico codifica un polipéptido que es un radical terapéutico o una marca detectable.

16. Un ácido nucleico de la reivindicación 15, donde adicionalmente dicho radical terapéutico es un fármaco o una citotoxina.

17. Un ácido nucleico de la reivindicación 16, donde dicha citotoxina es una exotoxina de Pseudomonas o uno de sus fragmentos citotóxicos, o una exotoxina de Pseudomonas mutada o uno de sus fragmentos citotóxicos.

18. Un ácido nucleico de la reivindicación 17, donde dicha exotoxina de Pseudomonas o uno de sus fragmentos se seleccionan del grupo que consiste en PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E y PE38QQR.

19. Un ácido nucleico de la reivindicación 18, donde el fragmento de exotoxina de Pseudomonas es PE38.

20. Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19 conectado operablemente a un promotor.

21. Un método para detectar la presencia de una célula cancerosa CD22+ en una muestra biológica, comprendiendo dicho método:

(a) poner en contacto células de dicha muestra biológica con un anticuerpo anti-CD22 con una cadena ligera variable (VL) que tiene la secuencia de la cadena VL del anticuerpo RFB4 de la Figura 1 y una cadena pesada variable (VH) que tiene la secuencia de la cadena VH del anticuerpo RFB4 de la Figura 1, siempre que los restos SSY de las posiciones 104, 105 y 106 de CDR3 de la cadena VH de dicho anticuerpo anti-CD22 sean remplazados por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en THW, YNW, TTW y STY, estando fusionado o conjugado dicho anticuerpo con una marca detectable; y (b)detectar la presencia o ausencia de dicha marca,

donde la detección de la presencia de dicha marca indica la presencia de una célula cancerosa CD22+ en dicha muestra.

22. Un método de la reivindicación 21, donde dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un scFv, un dsFv, un Fab y un F(ab')2.

23. Un kit para detectar la presencia de una célula cancerosa CD22+ en una muestra biológica, comprendiendo dicho kit:

(a) un recipiente; y (b) un anticuerpo anti-CD22 con una cadena ligera variable (VL) que tiene la secuencia de la cadena VL del anticuerpo RFB4 de la Figura 1 y una cadena pesada variable (VH) que tiene la secuencia de la cadena VH del anticuerpo RFB4 de la Figura 1, siempre que los restos 104, 105 y 106 de CDR3 de la cadena VH de dicho anticuerpo anti-CD22 sean remplazados por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en THW, YNW, TTW y STY, cuyo anticuerpo está fusionado o conjugado con una marca detectable.

24. Un kit de la reivindicación 23, donde dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un scFv, un dsFv, un Fab, y un F(ab')2.

25. Un método de inhibición del crecimiento de una célula cancerosa CD22+ poniendo en contacto dicha célula in vitro con un anticuerpo anti-CD22 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el anticuerpo está fusionado o conjugado con una citotoxina, cuya citotoxina inhibe el crecimiento de dicha célula.

26. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, para su uso en un método para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa CD22+.