Amplificación de ácido nucleico.

Un método para la amplificación selectiva de una secuencia de nucleótidos diana localizada en una molécula de ácido nucleico, comprendiendo el método:

poner en contacto la molécula de ácido nucleico

(molécula "molde") con

(i) al menos un oligonucleótido facilitador no cebador, donde el oligonucleótido facilitador incluye al menos una modificación en su extremo 3' o próxima a su extremo 3' de tal manera que la extensión 3' procedente del oligonucleótido facilitador se bloquea, y

(ii) dos o más cebadores de oligonucleótidos, al menos uno de los cuales es un cebador iniciador modificado de tal manera que la presencia de la modificación termina prematuramente la síntesis de la hebra inversa, donde el oligonucleótido facilitador y el cebador iniciador se unen a las mismas regiones solapantes o adyacentes de la molécula molde de ácido nucleico y el oligonucleótido facilitador comprende además secuencias complementarias a la secuencia diana 3' con respecto a la localización de unión del cebador iniciador; y

llevando a cabo la amplificación enzimática termocíclica, de tal manera que la secuencia diana específica se amplifica selectivamente, donde dicha amplificación incluye la etapa de ampliar la síntesis de la hebra inversa iniciada por la unión de dicho oligonucleótido facilitador.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/AU2008/001475.

Solicitante: COMMONWEALTH SCIENTIFIC AND INDUSTRIAL RESEARCH ORGANISATION.

Nacionalidad solicitante: Australia.

Dirección: Limestone Avenue Campbell, Australian Capital Territory 2612 AUSTRALIA.

Inventor/es: RAND,KEITH NORMAN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)

PDF original: ES-2460896_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Amplificación de ácido nucleico Campo de la invención La presente invención se refiere a métodos para la amplificación selectiva de secuencias específicas de ácido nucleico. La selectividad de la amplificación se consigue mediante el uso de al menos un cebador de oligonucleótido modificado junto con un oligonucleótido facilitador correspondiente en una reacción de amplificación enzimática termocíclica. Se proporciona también selectividad mediante secuencias ubicadas dentro del amplicón a las cuales se une el oligonucleótido facilitador. La invención se refiere también a la manipulación del producto de amplificación y a los usos del producto modificado generado de acuerdo con los métodos de la invención, tal como la adición de la secuencia 3' monocatenaria que se puede usar como un sitio de unión a una única secuencia de nucleótidos.

Antecedente de la invención La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica para sintetizar rápidamente un gran número de copias de un segmento definido de una molécula de ácido nucleico (véase, por ejemplo, Mullis y col., patentes de los Estados Unidos Nros 4683195, 4683202 y 4800159) . La técnica de la PCR es extremadamente sensible, requiriendo teóricamente una solo única molécula de ácido nucleico para la amplificación. La PCR es una reacción mediada por enzimas que incorpora normalmente una molécula molde, una pareja de cebadores de oligonucleótidos y una polimerasa de ácido nucleico en un medio de reacción que contiene las sales adecuadas, cationes metálicos, nucleótidos libres y un sistema tamponante del pH. El método de la PCR se basa en ciclos repetidos de desnaturalización del ácido nucleico bicatenario, seguido por la hibridación del ácido nucleico con el molde de ácido nucleico, y la extensión del cebador mediante la polimerasa. Los cebadores de oligonucleótidos utilizados en la PCR se diseñan para hibridarse a las hebras opuestas de la molécula molde y se sitúan flanqueando la secuencia diana que se va a amplificar. A medida que los cebadores se amplían desde sus extremos 3' mediante la polimerasa, los productos de ampliación proporcionan copias de la secuencia diana original que pueden a su vez actuar como moléculas molde para los ciclos adicionales de la amplificación. La amplificación mediante la PCR da como resultado el aumento exponencial de moléculas de ácido nucleico discretas para obtener la cantidad deseada de producto de ácido nucleico amplificado, cuya longitud se define por los extremos 5' de los cebadores de oligonucleótidos.

Aunque es simple y específica en principio, la PCR es propensa a diversos tipos de artefactos no deseados que pueden ser problemáticos para los usuarios y pueden afectar negativamente la selectividad y la especificidad de la técnica. Por ejemplo, la amplificación no específica de fragmentos puede ser el resultado de la unión de uno o ambos cebadores a una (s) secuencia (s) diferente (s) de la secuencia diana, que puede producir uno o más fragmentos que no sean el producto deseado. La unión no específica de cebadores se produce frecuentemente y puede deberse, por ejemplo, a alternar secuencias de unión a cebadores que están presentes en el molde de la secuencia de nucleótidos diana, la presencia de secuencias de unión a cebadores similares en moléculas contaminantes extrañas y/o a un diseño de la secuencia del cebador que no sea óptimo. Estos productos de ácido nucleico no específicos pueden ser problemáticos, especialmente cuando el molde de ácido nucleico que contiene la secuencia diana está presente en unas pocas copias.

En algunos casos, los cebadores solamente pueden unirse parcialmente a los sitios de unión complementarios, y ampliarse incluso cuando está presente un emparejamiento incorrecto con el ADN unido en el extremo 3' de un cebador (por ejemplo, véase Kwok y col. 1990, "Effects of primer template mismatches on the polymerase chain reaction human-immunodeficiency-virus type-1 model studies." Nucleic Acids Research 18 (4) : 999-1005) . Debido a esto, se puede producir una amplificación no específica no deseada. Cuando se copia la hebra de ADN resultante del cebado incorrecto, se genera un primer sitio de unión al cebador que se empareja completamente con el cebador. De este modo, pueden aparecer productos no deseados en la PCR convencional que tiene en ambos extremos sitios de unión que son totalmente complementarios de los cebadores. De esta manera, una vez que se produce este producto no deseado, es probable que se amplifique con elevada eficacia. En otras palabras, una vez se ha producido el cebado incorrecto, no es posible especificidad adicional en la PCR convencional. Aunque se pueden usar diversos tipos de sondas para detectar específicamente la diana deseada, si se producen demasiadas amplificaciones no específicas, puede evitarse o reducirse la producción del producto deseado a niveles que son indetectables con la sonda específica. Esta situación es más probable que se produzca en casos donde la diana de interés constituye solo una muy pequeña fracción del ácido nucleico total.

La amplificación no específica se agudiza también cuando se produce en los ciclos iniciales del ciclo de la PCR. Normalmente en las técnicas de la PCR existentes, la especificidad debida a las secuencias de los cebadores se consigue solo en los ciclos iniciales de la PCR. Una vez que se ha generado una cantidad significativa de producto, la amplificación continúa a iguales velocidades tanto si los cebadores se han ampliado desde los sitios previstos que flanquean la secuencia diana o desde los amplicones no específicos que surgen del cebado incorrecto. Esto es, incluso aunque los cebadores puedan haberse unido y se haya producido la extensión desde sitios incorrectos para los cuales los cebadores tengan solo complementariedad parcial, los productos no específicos amplificados tienen la

secuencia exacta de unión al cebador de oligonucleótido incorporada en virtud de la técnica de la PCR, y esta compite con igual eficacia con el molde de ácido nucleico que contiene la secuencia diana para la unión al cebador de oligonucleótido en los ciclos posteriores de la PCR. En aplicaciones tales como la PCR específica de alelo se requieren normalmente un considerable cuidado en el diseño del cebador y un considerable esfuerzo en la optimización de la técnica para minimizar el cebado incorrecto.

En un intento de limitar la incidencia de la amplificación de productos no específicos, las técnicas de la PCR actuales pueden emplear procedimientos modificados destinados a aumentar la especificidad de unión del cebador al ácido nucleico diana. Esto puede implicar, por ejemplo, alterar la presencia y la concentración de diferentes cofactores que median el método de unión al cebador o modifican la termociclación del método de la PCR. Alternativamente, se puede utilizar la PCR anidada que implica dos conjuntos de cebadores utilizados en dos ciclos sucesivos de la PCR. La primera amplificación de la PCR produce la diana y productos potencialmente no específicos que utilizan el primer conjunto de cebadores, mientras que el segundo ciclo de la PCR utiliza nuevos cebadores para amplificar una diana secundaria dentro del primer ciclo del producto diana en un esfuerzo por reducir la generación de un producto no específico.

El documento W003/074724 se refiere a un método de amplificación polinomial del ADN que utiliza, inter alia, cebadores semianidados. De acuerdo con esta divulgación, una molécula de ácido nucleico que se va a amplificar se pone en contacto con al menos dos cebadores; un cebador no replicable que se puede hibridar con la molécula de ácido nucleico que se está amplificando, y un cebador replicable que se puede hibridar con un producto de ampliación del cebador generado... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para la amplificación selectiva de una secuencia de nucleótidos diana localizada en una molécula de ácido nucleico, comprendiendo el método:

poner en contacto la molécula de ácido nucleico (molécula "molde") con

(i) al menos un oligonucleótido facilitador no cebador, donde el oligonucleótido facilitador incluye al menos una modificación en su extremo 3' o próxima a su extremo 3' de tal manera que la extensión 3' procedente del oligonucleótido facilitador se bloquea, y

(ii) dos o más cebadores de oligonucleótidos, al menos uno de los cuales es un cebador iniciador modificado de tal manera que la presencia de la modificación termina prematuramente la síntesis de la hebra inversa,

donde el oligonucleótido facilitador y el cebador iniciador se unen a las mismas regiones solapantes o adyacentes de la molécula molde de ácido nucleico y el oligonucleótido facilitador comprende además secuencias complementarias a la secuencia diana 3' con respecto a la localización de unión del cebador iniciador; y llevando a cabo la amplificación enzimática termocíclica, de tal manera que la secuencia diana específica se amplifica selectivamente, donde dicha amplificación incluye la etapa de ampliar la síntesis de la hebra inversa iniciada por la unión de dicho oligonucleótido facilitador.

2. El método de la reivindicación 1 donde el método comprende las etapas de:

(a) . desnaturalizar la molécula molde de ácido nucleico; (b) . poner en contacto la molécula molde de ácido nucleico desnaturalizada con al menos un cebador iniciador e iniciar la síntesis de la segunda hebra a partir de la anterior, introduciendo de esta forma la modificación a partir del cebador iniciador en la hebra sintetizada recientemente; (c) . desnaturalizar las moléculas bicatenarias así generadas e iniciar la síntesis de la hebra inversa a partir de un cebador localizado en el extremo opuesto de la secuencia de nucleótidos diana a la cual se une el cebador iniciador, mientras que la síntesis de la hebra inversa termina prematuramente debido a la modificación introducida en la etapa (b) ; (d) . desnaturalizar las moléculas bicatenarias sintetizadas recientemente, unir el oligonucleótido facilitador a la hebra inversa incompleta generada en la etapa (c) y ampliar la síntesis de la hebra inversa iniciada por la unión de dicho oligonucleótido facilitador para completar la hebra inversa; y (e) . repetir opcionalmente las etapas (a) a (d) durante uno o más ciclos adicionales.

3. El método de las reivindicaciones 1 o 2 donde la región 5' del oligonucleótido facilitador comparte una de:

(i) una identidad de secuencia suficiente con el cebador iniciador de tal manera que el sitio de unión al cebador iniciador se regenera tras la ampliación de la síntesis de la hebra inversa iniciada a partir de la unión de dicho oligonucleótido facilitador permitiendo por tanto al cebador iniciador iniciar ciclos adicionales de síntesis de la hebra, o

(ii) una identidad de secuencia insuficiente con el cebador iniciador de tal manera que el sitio de unión al cebador iniciador no se regenera tras la ampliación de la síntesis de la hebra inversa iniciada a partir de la unión de dicho oligonucleótido facilitador.

4. El método de reivindicación 3 donde existe (ii) identidad de secuencia insuficiente entre la región 5' del oligonucleótido facilitador y el cebador iniciador, el método emplea adicionalmente un cebador dependiente del oligonucleótido facilitador, modificado de tal manera que la presencia de la modificación termina prematuramente la síntesis de la hebra complementaria, cuyo cebador comparte una identidad de secuencia suficiente con la región 5' del oligonucleótido facilitador de tal manera que la síntesis de la hebra iniciada a partir del oligonucleótido facilitador genera un sitio de unión del cebador dependiente del oligonucleótido facilitador que permite por tanto al cebador dependiente del oligonucleótido facilitador iniciar ciclos adicionales de síntesis de la hebra.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde el método se puede usar para mejorar la especificidad de la amplificación de una secuencia diana deseada, reduciendo o eliminando de forma simultánea la amplificación de secuencias no diana no deseadas.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde la al menos una modificación que bloquea la extensión 3' del oligonucleótido facilitador incluye la incorporación de uno o más restos o análogos de nucleótidos no extensibles en o próximos al extremo 3',

7. El método de la reivindicación 6 donde la al menos una modificación comprende una base o un análogo de base no extensibles del extremo 3' únicos, una combinación de una base no extensible del extremo 3' y uno o más nucleótidos emparejados incorrectamente próximos al extremo 3' del oligonucleótido, y/o la incorporación de un sitio

abásico cerca del extremo 3' del oligonucleótido, opcionalmente donde la base no extensible se selecciona entre un 2' 3' didesoxinucleótido, un 3' C3, C18 u otro separador en longitud, un nucleótido 3' fosforilado, una base de "ácido nucleico peptídico", una base de "ácido nucleico bloqueado" (LNA) , un derivado de amina de nucleótido, uracilo tratado con Uracil ADN glicosilasa, ARN o un 2' O-metil nucleótido, o una combinación de estos.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde el cebador iniciador y/o el cebador dependiente del oligonucleótido facilitador están modificados mediante la inclusión de uno o más separadores, sitios abásicos o nucleótidos modificados tales com.

2. O-metil nucleótidos, de manera opcional donde la modificación se localiza suficientemente próxima al extremo 3' del cebador de tal manera que aunque el cebador retiene la capacidad de iniciar la extensión 3', cuando se copia el producto ampliado que contiene la modificación en su secuencia de cebador, la hebra complementaria se trunca prematuramente evitando la unión del cebador en los posteriores ciclos de amplificación.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde el extremo 5' del oligonucleótido facilitador coincide con el extremo 5' o está comprendido dentro del cebador iniciador, y/o el cebador dependiente del oligonucleótido facilitador.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde el oligonucleótido facilitador comprende una cola 5' ampliada que comprende una secuencia adicional a la que está presente en el extremo 5' del cebador iniciador, y/o el cebador dependiente del oligonucleótido facilitador.

11. El método de reivindicación 1 donde ambos cebadores de oligonucleótidos que flanquean la secuencia diana son cebadores iniciadores y el método emplea dos oligonucleótidos facilitadores, uno de los cuales se une a la misma región, a una región solapante o a una región adyacente de la molécula de ácido nucleico molde como el cebador iniciador directo, y el otro se une a la misma región, a una región solapante o a una región adyacente de la molécula de ácido nucleico molde como el cebador iniciador inverso.

12. El método de reivindicación 11 donde la región 5' de al menos un oligonucleótido facilitador comparte una de:

(i) una identidad de secuencia suficiente con el cebador iniciador correspondiente de tal manera que el sitio de unión al cebador iniciador se regenera tras la ampliación de la síntesis de la hebra inversa iniciada a partir de la unión de al menos un oligonucleótido facilitador permitiendo por tanto al cebador iniciador correspondiente iniciar ciclos adicionales de síntesis de la hebra, o

(ii) una identidad de secuencia insuficiente con el cebador iniciador correspondiente de tal manera que el sitio de unión al cebador iniciador no se regenera tras la ampliación de la síntesis de la hebra inversa iniciada a partir de la unión de al menos un oligonucleótido facilitador.

13. El método de reivindicación 12 donde existe (ii) identidad de secuencia insuficiente entre la región 5' del oligonucleótido facilitador y el cebador iniciador, el método emplea adicionalmente al menos un cebador dependiente del oligonucleótido facilitador, modificado de tal manera que la presencia de la modificación termina prematuramente la síntesis de la hebra inversa, cuyo cebador comparte una identidad de secuencia suficiente con la región 5' del oligonucleótido facilitador correspondiente de tal manera que la síntesis de la hebra inversa iniciada a partir del de la unión del oligonucleótido facilitador genera un sitio de unión del cebador dependiente del oligonucleótido facilitador que permite por tanto al cebador dependiente del oligonucleótido facilitador iniciar ciclos adicionales de síntesis de la hebra.

14. El método de la reivindicación 13 donde el método emplea dos cebadores dependientes de oligonucleótidos facilitadores, uno de los cuales se une a la misma región, a una región solapante o a una región adyacente de la molécula de ácido nucleico molde como el oligonucleótido facilitador, y el otro se une a la misma región, a una región solapante o a una región adyacente de la molécula de ácido nucleico molde como el otro oligonucleótido facilitador.

15. Un método para mejorar la especificidad de una reacción de amplificación enzimática termocíclica, utilizando la reacción al menos dos cebadores de oligonucleótidos que flanquean una secuencia de nucleótidos diana de interés localizada en una molécula de ácido nucleico, donde al menos uno de dichos cebadores está modificado de tal manera que la presencia de la modificación termina prematuramente la síntesis de la hebra inversa, y la reacción utiliza además al menos un oligonucleótido facilitador no cebador, donde el oligonucleótido facilitador incluye al menos una modificación en su extremo 3' o próxima a su extremo 3' de tal manera que la extensión 3' procedente del oligonucleótido facilitador se bloquea; y donde el oligonucleótido facilitador y el cebador modificado se unen a las mismas regiones solapantes o adyacentes de la molécula molde de ácido nucleico y el oligonucleótido facilitador comprende además secuencias complementarias a la secuencia diana 3' con respecto a la localización de unión del cebador modificado; donde dicha amplificación incluye la etapa de ampliar la síntesis de la hebra inversa iniciada por la unión de dicho oligonucleótido facilitador.

16. El método de reivindicación 15 donde la especificidad de la reacción de amplificación enzimática termocíclica se determina mediante la eliminación de, o la reducción en la cantidad de, producto de amplificación que no comprende

la secuencia del nucleótido diana de interés.

17. Un método para detectar una secuencia de nucleótidos variante, comprendiendo el método amplificar selectivamente una secuencia de nucleótidos diana localizada en una molécula de ácido nucleico y que comprende

la secuencia variante, donde el método comprende: poner en contacto la molécula de ácido nucleico (molécula "molde") con

(i) al menos un oligonucleótido facilitador no cebador, donde el oligonucleótido facilitador incluye al menos una modificación en su extremo 3' o próxima a su extremo 3' de tal manera que la extensión 3' procedente del 10 oligonucleótido facilitador se bloquea, y

(ii) dos o más cebadores de oligonucleótidos, al menos uno de los cuales es un cebador iniciador modificado de tal manera que la presencia de la modificación termina prematuramente la síntesis de la hebra complementaria,

donde el oligonucleótido facilitador y el cebador iniciador se unen a las mismas regiones solapantes o adyacentes de la molécula molde de ácido nucleico y el oligonucleótido facilitador comprende además secuencias 3' complementarias a la secuencia 3' diana con respecto a la localización de la unión del cebador iniciador y donde dichas secuencias 3' permiten la unión preferente del oligonucleótido facilitador con la secuencia de nucleótidos diana que comprende la secuencia variante en lugar de con la correspondiente secuencia no variante; llevando a cabo la amplificación enzimática termocíclica, de tal manera que la secuencia diana específica se amplifica selectivamente, donde dicha amplificación incluye la etapa de ampliar la síntesis de la hebra inversa iniciada por la unión de dicho oligonucleótido facilitador; y comparar la secuencia de nucleótidos del producto amplificado con una secuencia correspondiente a la secuencia diana no variante, para detectar la secuencia de nucleótidos variante.

18. El método de la reivindicación 17 donde la secuencia variante comprende la adición, la deleción o la sustitución de uno o más nucleótidos o una modificación, tal como un estado de metilación alterado, de uno o más nucleótidos en la secuencia diana.

19. El método de las reivindicaciones 17 o 18 donde el método se utiliza en el análisis de metilación del ADN y/o en el diagnóstico de, o en la predicción de la susceptibilidad de, una enfermedad o dolencia en un sujeto, donde la enfermedad o dolencia está caracterizada o asociada con una alteración en una secuencia genética.

Hibridación / ampliación