Variantes de fitasa.

Fitasa que tiene al menos 85% de identidad a la SEC ID NO:2, que tiene una termoestabilidad mejorada indicada como actividad residual determinada por división de un sobrenadante de fermentación en dos partes,

una parte se incuba durante 30 minutos a 60°C, y la otra parte durante 30 minutos a 5°C, tras lo cual la actividad de ambas se determina en el fosfato de p-nitrofenilo a 37°C y pH 5.5, donde la actividad residual de la fitasa es la actividad de la muestra que ha sido incubada a 60°C dividido por la actividad de la misma muestra que ha sido incubada a 5°C, donde la actividad residual de la fitasa es al menos 120% de la actividad residual de la SEC ID NO: 2 de fitasa de referencia, medido en las mismas condiciones, y que comprende al menos una alteración en comparación con la SEC ID NO:2 en al menos una posición seleccionada de las siguientes:

G52C/A99C, K141C/V199C, G59C/F100C, Q91C/W46C, N31C/E176C, N31C/T177C, y/o S162C/S247C, donde el grado de identidad entre secuencias, se determina por el programa "Needle" utilizando la matriz de sustitución BLOSUM62, la penalización de abertura de gap es 10, y la penalización de extensión de gap es 0.5.

Variantes de fitasa Campo de la invención

[0001] La presente invención se refiere a una fitasa que tiene al menos el 74% de identidad a la fitasa derivada de Citrobacter braakii ATCC 51113 y comprende al menos una alteración respecto a esta fitasa (es decir, es una variante de la misma). La invención también se refiere al ADN que codifica estas fitasas, a métodos de su producción, así como al uso de las mismas, por ejemplo, en el alimento para animales y aditivos de alimento. La parte madura de la fitasa Citrobacter braakii ATCC 51113 está incluida en el listado de secuencias como SEC ID NO:2.

Antecedentes de la invención

Antecedentes de la técnica

[0002] La secuencia del gen phyA de Citrobacter freundii ha sido presentada por Zinin ef al. a las bases de datos EMBL/GenBank/DDBJ con número de acceso AY390262. La secuencia de aminoácidos de fitasa correspondiente se encuentra en las bases de datos UniProt/TrEMBL con número de acceso Q676V7. La parte madura prevista de Q676V7 se incluye en el presente listado de secuencias como SEC ID NO:4.

[0003] La publicación WO-2004/085638 divulga, como SEC ID NO:7, la secuencia de aminoácidos de una fitasa de Citrobacter braakii YH-15, depositada como KCCM 10427. La parte madura de esta secuencia de aminoácidos se incluye en este documento como SEC ID NO: 3. Esta secuencia se encuentra también en la base de datos Geneseqp con número de acceso ADU50737. Esta fitasa (YH-15) fue más tarde clonada en y expresada en Sacchromyces cerevisae mostrando un modelo de glicación modificada y un cambio en la termoestabilidad, cuando se expresa en Sacchromyces cerevisae, Kim et al:. " Molecular cloning of the phytase gene from Citrobacter braakii and its expression in Saccharomyces cerevisiae." Biotechnology Letters 2006, vol. 28, n°. 1.

[0004] La publicación WO 2006/037328 divulga la fitasa de tipo salvaje de Citrobacter braakii ATCC 51113 (es decir, SEC ID NO:2 en este documento), así como una variante de la misma, la cual también se incluye en el presente listado de secuencias, a saber, como SEC ID NO:6.

[0005] Las publicaciones WO 2006/038062 y WO 2006/038128 revelan ambas la secuencia de aminoácidos del gen de fitasa de Citrobacter freundii P3-42, depositada con número de acceso NCIMB 41247. Esta secuencia de aminoácidos se incluye en este documento como SEC ID NO:9.

[0006] Es un objetivo de la invención proporcionar fitasas de propiedades modificadas, preferiblemente, de propiedades mejoradas. Ejemplos no limitativos de tales propiedades son: termoestabilidad, perfil de temperatura, perfil de pH, actividad específica, rendimiento en el alimento para animales, sensibilidad de proteasa, y/o modelo de glicosilación.

Resumen de la invención

[0007] La presente invención se refiere a una fitasa que tiene una identidad de al menos el 85% a la SEC ID NO:2, que tiene una termoestabilidad mejorada indicada como actividad residual determinada dividiendo un sobrenadante en dos partes, una parte se incuba durante 30 minutos a 60°C, y la otra parte durante 30 minutos a 5°C, tras lo cual la actividad de ambas se determina en el fosfato de p-nitrofenilo a 37°C y pH 5,5, donde la actividad residual de la fitasa es la actividad de la muestra que ha sido incubada a 60°C dividida por la actividad de la misma muestra incubada a 5°C, donde la actividad residual de la fitasa es al menos 105% de la actividad residual de la fitasa de referencia SEC ID NO:2, medida en las mismas condiciones, y dicha fitasa comprende al menos una alteración y no más de 4 alteraciones en comparación con la SEC ID NO:2 de la cual se selecciona al menos uno de los siguientes: G52C/A99C, K141CA/199C, G59C/F100C, Q91C/W46C, N31C/E176C, N31C/T177C, y/o S162C/S247C, donde el grado de identidad entre secuencias, se determina por el programa "Needle" utilizando la matriz de sustitución BLOSUM62, la penalización de abertura de gap es 10, y la penalización de extensión de gap es 0.5.

[0008] La invención también se refiere a tales fitasas donde los aminoácidos en la posición 179, 180, 181, 182, 183,

184, 185, y 186 han sido sustituidos por QADKP, GEDKP, NGISA, IAGKS, KEKHQ, KEKQQ, KEKKV, o KTDKL, y tales fitasas, que comprenden una alteración seleccionada de las siguientes: 4P, 5P, 111P, 137P, 161P, 52E, 57Y, 76G, 107D, 107G, 109A, 1*, 1*/2*, 1*/2*/3*, 121T, 273L, 285G, 286Q, 299L, 362K, 331K/55D, 107E, 46E, 82E, 119R, 119K, 164E, 223E, 276R, 276K, 362R, 379R, 379K, 385D, 410D, 410E, 411 R, 411 K, 53V, 121 D, 167Q, 196Q, 200K, 202N, 218Q, 241 Q, 285N, 314N, 314G, 406A, 179K/180E/181 K/182H/183Q/18471857186*. 179K/180E/181 K/182Q/183Q/184*/185*/186*, 179K/180E/181 K/182K/183V/18471857186*. 179K/180T/181

D/182K/183L/184*/185*/186*, 111 P/241 Q, 1 K, 114T/115Q/116A/117D/118T/119S/120S/121 P/122D/123P/124L, y 114T/115Q/116T/117D/118T/119S/120S/121 P/122D/123P/124L,

donde el símbolo "*" significa que el residuo de aminoácido en la posición indicada es eliminado.

[0009] La invención también se refiere al ADN que codifica estas fitasas, métodos de su producción, así como el uso del mismo, por ejemplo, en el alimento para animales y aditivos de alimento.

Breve descripción de los dibujos

[0010]

La Fig. 1 corresponde a la Tabla 2 de la publicación WO 2006/038062 y divulga varias variantes de la fitasa Citrobacter freundii NCIMB 41247 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:9 y la Fig. 2 es una alineación de las fitasas de la SEC ID NO:2 y 9.

[0011] Los números de posición en la Fig. 1 se refieren a la numeración de la SEC ID NO:9. Las posiciones de la SEC ID NO:2 correspondientes se pueden encontrar por deducción de 22 (p. ej., la variante P229S de la Fig. 1 significa variante P207S usando la numeración de la presente aplicación).

Descripción detallada de la invención

[0012] En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una fitasa que tiene al menos el 85% de identidad a la SEC ID NO:2, que tiene una termoestabilidad mejorada indicada como actividad residual determinada dividiendo un sobrenadante en dos partes, una parte se incuba durante 30 minutos a 60°C, y la otra parte durante 30 minutos a 5°C, tras lo cual la actividad de ambas se determina sobre el fosfato de p-nitrofenilo a 37°C y pH 5,5, donde la actividad residual de la fitasa es la actividad de la muestra incubada a 60°C dividida por la actividad de la misma muestra que ha sido incubada a 5°C, donde la actividad residual de la fitasa es al menos 120% de la actividad residual de la fitasa de referencia SEC ID NO:2, medida en las mismas condiciones, y dicha fitasa comprende al menos una alteración en comparación con la SEC ID NO:2 de la cual se selecciona al menos uno de los siguientes: G52C/A99C, K141CA/199C, G59C/F100C, Q91C/W46C, N31C/E176C, N31C/T177C, y/o S162C/S247C, donde el grado de identidad entre secuencias, se determina por el programa "Needle" utilizando la matriz de sustitución BLOSUM62, la penalización de abertura de gap es 10, y la penalización de extensión de gap es 0.5.

[0013] El porcentaje de identidad se determina como se describe en la sección "Polipéptidos de fitasa, porcentaje de identidad".

[0014] Los números de posición se refieren a la numeración de posición de la SEC ID NO:2, como se describe en la sección "Numeración de posición." Las posiciones correspondientes a estos números de posición de SEC ID NO:2 en otras fitasas se determinan como se describe en la sección "Identificación de los números de posición correspondientes."

[0015] La fitasa de la invención es una variante de la fitasa de la SEC ID NO:2, a saber, no es idéntica a la SEC ID NO:2, puesto que comprende al menos una alteración en comparación con la SEC ID NO:2.

[0016] En un segundo aspecto la invención se refiere a tales fitasas, donde los aminoácidos en la posición 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, y 186 han sido sustituidos por QADKP, GEDKP, NGISA, IAGKS, KEKHQ, KEKQQ, KEKKV, o KTDKL.

[0017] En tercer lugar las fitasas de la invención pueden comprender una alteración seleccionada de las siguientes:

4P, 5P, 111 P, 137P, 161 P, 52E, 57Y, 76G, 107D, 107G, 109A, 1*, 172*, 17273*, 121 T, 273L, 285G, 286Q, 299L, 362K, 331K/55D, 107E, 46E, 82E, 119R, 119K, 164E, 223E, 276R, 276K, 362R, 379R, 379K, 385D, 410D, 410E, 411 R, 411 K, 53V, 121 D, 167Q, 196Q, 200K, 202N, 218Q, 241Q, 285N, 314N, 314G, 406A, 179K/180E/181 K/182H/183Q/18471857186*. 179K/180E/181 K/182Q/183Q/18471857186*. 179K/180E/181

K/182K/183V/18471857186*. 179K/180T/181 D/182K/183L/18471857186*. 111P/241Q, 1K,

114T/115Q/116A/117 D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L, y

114T/115Q/116T/117D/118T/119S/120S/121P/122D/123P/124L, donde el símbolo "*" significa que el residuo de aminoácido en la posición... [Seguir leyendo]

1. Fitasa que tiene al menos 85% de identidad a la SEC ID NO:2, que tiene una termoestabilidad mejorada indicada como actividad residual determinada por división de un sobrenadante de fermentación en dos partes, una parte se incuba durante 30 minutos a 60°C, y la otra parte durante 30 minutos a 5°C, tras lo cual la actividad de ambas se determina en el fosfato de p-nitrofenilo a 37°C y pH 5.5, donde la actividad residual de la fitasa es la actividad de la muestra que ha sido incubada a 60°C dividido por la actividad de la misma muestra que ha sido incubada a 5°C, donde la actividad residual de la fitasa es al menos 120% de la actividad residual de la SEC ID NO: 2 de fitasa de referencia, medido en las mismas condiciones, y que comprende al menos una alteración en comparación con la SEC ID NO:2 en al menos una posición seleccionada de las siguientes:

G52C/A99C, K141C/V199C, G59C/F100C, Q91C/W46C, N31C/E176C, N31C7T177C, y/o S162C/S247C, donde el grado de identidad entre secuencias, se determina por el programa "Needle" utilizando la matriz de sustitución BLOSUM62, la penalización de abertura de gap es 10, y la penalización de extensión de gap es 0.5.

2. Fitasa según la reivindicación 1, donde los aminoácidos en la posición 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, y 186 han sido sustituidos por QADKP, GEDKP, NGISA, IAGKS, KEKHQ, KEKQQ, KEKKV, o KTDKL.

3. Fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende una alteración seleccionada de las siguientes: 4P, 5P, 111P, 137P, 161P, 52E, 57Y, 76G, 107D, 107G, 109A, 1*, 1*/2*, 17273*, 121T, 273L, 285G, 286Q, 299L, 362K, 331K/55D, 107E, 46E, 82E, 119R, 119K, 164E, 223E, 276R, 276K, 362R, 379R, 379K, 385D, 410D, 410E, 411 R, 411 K, 53V, 121 D, 167Q, 196Q, 200K, 202N, 218Q, 241Q, 285N, 314N, 314G, 406A,

179K/180E/181K/182H/183Q/18471857186*,

179K/180E/181 K/182Q/183Q/18471857186*,

179K/180E/181 K/182K/183V/18471857186*,

179K/180T/181D/182K/183L/18471857186*,

111P/241Q, 1K,

114T/115Q/116A/117D/118T/119S/120S/121 P/122D/123P/124L, y 114T/115Q/116T/117D/118T/119S/120S/121

P/122D/123P/124L,

donde el símbolo "*" significa que el residuo de aminoácido en la posición indicada es eliminado.

4. Fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que es una variante de la fitasa de SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, SEC ID NO:4, SEC ID NO:6,o SEC ID NO:9.

5. Fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 que comprende además una sustitución o una combinación de sustituciones seleccionadas de entre las sustituciones y combinaciones de sustituciones catalogadas en cada fila de la Fig. 1

6. Ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. Constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 6 operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la producción de la fitasa en un huésped de expresión adecuado.

8. Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 7.

9. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 7 y/o el vector de expresión según la reivindicación 8.

10. Método para la producción de la fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende

(a) el cultivo de la célula huésped según la reivindicación 9 para producir un sobrenadante que comprende la fitasa; y

(b) la recuperación de la fitasa.

11. Planta transgénica, o parte de planta, que ha sido transformada con un ácido nucleico según la reivindicación 3 o 4, capaz de expresar una fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

12. Animal transgénico no humano, o productos, o elementos del mismo, que ha sido transformado con un ácido nucleico según la reivindicación 6 o 7, siendo capaz de expresar una fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

13. Composición que comprende al menos una fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, y (a) al menos una vitamina soluble en grasa;

(b) al menos una vitamina soluble en agua; y/o

(c) al menos un ollgoelemento.

14. Composición según la reivindicación 13 que comprende además al menos una enzima seleccionada del 5 siguiente grupo de enzimas: amilasa, fitasa, fosfatasa, xilanasa, galactanasa, alfa-galactosidasa, proteasa,

fosfolipasa, y/o beta-glucanasa.

15. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 13-14 que es un aditivo para alimentación animal.

16. Composición alimentaria para animales con un contenido de proteína cruda de 50 a 800 g/kg y que comprende

la fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 13- 15.

17. Método para mejorar el valor nutricional de un alimento para animales, donde la fitasa según cualquiera de las 15 reivindicaciones 1-5 o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 13-15 se añade al alimento.

18. Proceso para reducir niveles de fitato en el abono animal que comprende alimentar a un animal con una cantidad eficaz del alimento según la reivindicación 16.

19. Método para el tratamiento de proteínas vegetales, que comprende el paso de añadir la fitasa según cualquiera

de las reivindicaciones 1-5 o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 13-15 a por lo menos una proteína vegetal o fuente de proteína.

20. Uso de la fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o de la composición según cualquiera de las 25 reivindicaciones 13-15 en alimentos para animales; en la preparación de alimentos para animales; para mejorar el valor nutricional de alimentos para animales; para reducir los niveles de fitato en el abono animal; para el tratamiento de proteínas vegetales; o para liberar fósforo de un sustrato de fitasa.