Análisis de polinucleótidos basado en nanoporos con marcadores fluorescentes que se inactivan mutuamente.
Un método para determinar una secuencia de nucleótidos de al menos un polinucleótido,
comprendiendo el método las etapas de:
translocar al menos un polinucleótido de cadena sencilla a través de un nanoporo, en el que los nucleótidos del polinucleótido de cadena sencilla se marcan con marcadores fluorescentes a partir de un conjunto que se inactiva mutuamente, en el que el nanoporo obliga a los marcadores fluorescentes dentro del nanoporo a un estado restringido en el que no se genera prácticamente ninguna señal detectable, y en el que cada marcador fluorescente del conjunto que se inactiva mutuamente (i) inactiva la fluorescencia de cada marcador fluorescente del conjunto de tal manera que los marcadores fluorescentes de nucleótidos adyacentes están en un estado inactivado en solución libre y (ii) genera una señal fluorescente distinta cuando se excita y cuando está en un estado no inactivado;
excitar el marcador fluorescente de cada nucleótido al salir del nanoporo y antes de la formación de un estado inactivado con un nucleótido adyacente;
medir una señal fluorescente generada por el marcador fluorescente que sale para identificar el nucleótido al que está unido el marcador fluorescente; y
determinar una secuencia de nucleótidos del polinucleótido a partir de una secuencia de señales fluorescentes.
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2015/054756.
Solicitante: Quantapore Inc.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 815 Dubuque Avenue South San Francisco, CA 94080 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.
Inventor/es: HUBER, MARTIN.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/6869 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › Métodos de secuenciación.
PDF original: ES-2789000_T3.pdf
Reivindicaciones:
1. Un método para determinar una secuencia de nucleótidos de al menos un polinucleótido, comprendiendo el método las etapas de:
translocar al menos un polinucleótido de cadena sencilla a través de un nanoporo, en el que los nucleótidos del polinucleótido de cadena sencilla se marcan con marcadores fluorescentes a partir de un conjunto que se inactiva mutuamente, en el que el nanoporo obliga a los marcadores fluorescentes dentro del nanoporo a un estado restringido en el que no se genera prácticamente ninguna señal detectable, y en el que cada marcador fluorescente del conjunto que se inactiva mutuamente (i) inactiva la fluorescencia de cada marcador fluorescente del conjunto de tal manera que los marcadores fluorescentes de nucleótidos adyacentes están en un estado inactivado en solución libre y (ii) genera una señal fluorescente distinta cuando se excita y cuando está en un estado no inactivado;
excitar el marcador fluorescente de cada nucleótido al salir del nanoporo y antes de la formación de un estado inactivado con un nucleótido adyacente;
medir una señal fluorescente generada por el marcador fluorescente que sale para identificar el nucleótido al que está unido el marcador fluorescente; y
determinar una secuencia de nucleótidos del polinucleótido a partir de una secuencia de señales fluorescentes. 2. El método de la reivindicación 1, en el que los nucleótidos de dicho polinucleótido se marcan con segundos miembros de un par de FRET, cada segundo miembro produce una señal de FRET indicativa del nucleótido al que está unido, y en el que los nucleótidos de dicho polinucleótido pasan en secuencia por un primer miembro del par de FRET colocado adyacente a dicho nanoporo de modo que cada segundo miembro al salir de dicho nanoporo pasa dentro de una distancia de FRET del primer miembro del par de FRET; y
en el que dicha etapa de excitación incluye exponer el primer miembro a un haz de luz de una primera longitud de onda de manera que FRET ocurra entre el primer y el segundo miembro del par de FRET dentro de la distancia de FRET para generar una señal de FRET de una segunda longitud de onda indicativa del nucleótido que sale de dicho nanoporo.
3. El método de la reivindicación 2, en el que dicho nanoporo está dispuesto en una membrana de fase sólida y en el que dicho primer miembro de dicho par de FRET está unido a la membrana de fase sólida adyacente a dicho nanoporo.
4. El método de la reivindicación 2, en el que dicho nanoporo es un nanoporo de proteína y en el que dicho primer miembro de dicho par de FRET está unido al nanoporo de proteína.
5. El método de la reivindicación 2, en el que dicho primer miembro de dicho par de FRET es un donante y dicho segundo miembro de dicho par de FRET es un aceptador.
6. El método de la reivindicación 5 en el que dicho donante es un punto cuántico.
7. El método de la reivindicación 5 en el que dicho aceptor es un colorante orgánico fluorescente.
8. El método de la reivindicación 5, en el que dicha etapa de exposición incluye exponer dicho donante a una onda evanescente de una excitación total reflejada internamente.
9. El método de la reivindicación 1, en el que dicho nanoporo se incrusta en una bicapa lipídica.
10. El método de la reivindicación 1 en el que dicho nanoporo está en una matriz de nanoporos que comprende una pluralidad de nanoporos sustancialmente idénticos.
11. El método de la reivindicación 10, en el que dichos nanoporos de dicha matriz de nanoporos son nanoporos de proteínas.
12. El método de la reivindicación 11, en el que dicha matriz de nanoporos comprende una membrana de fase sólida que separa una primera cámara de una segunda cámara, comprendiendo la membrana de fase sólida una matriz plana de aberturas, cada una de las cuales tiene dicho nanoporo de proteína inmovilizada allí.
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