Generación de plantas transgénicas libres de marcadores y de estructura usando un enfoque binario único.

Un método para producir una planta transformada que no contiene un marcador seleccionable en su genoma,

que comprende (a) infectar células de plantas con Agrobacterium que contiene un vector binario único que comprende (i) un ADN de transferencia que contiene un gen de interés y (ii) un casete de expresión que contiene un gen biosintético de la hormona de una planta posicionado en la estructura fuera del ADN de transferencia, para expresar un gen biosintético de citoquinina; (b) cultivar las células en un medio libre de hormonas para producir brotes; (c) identificar un brote que tiene ADN genómico que contiene el ADN de transferencia pero no el casete de expresión del gen biosintético de citoquinina por selección sin el uso de genes de resistencia a los antibióticos; y (d) cultivar una planta de a partir del brote identificado de (c), en donde la planta es una planta transformada que no contiene un gen biosintético de la hormona de la planta en su genoma.

Generación de plantas transgénicas libres de marcadores y de estructura usando un enfoque binario único Esta solicitud de patente no provisional de los Estados Unidos reivindica prioridad con la solicitud provisional de los Estados Unidos con serial No. 60/765.177 presentada el 6 de febrero de 2006.

Campo de la invención La presente invención proporciona un método conveniente para la producción de una planta transformada. Este método requiere la expresión de un gen de la hormona colocado dentro de la estructura del plásmido que porta también un ADN-P o un ADN-T para obtener plantas transformadas sin estructura.

Antecedentes Como se sabe bien, Agrobacterium tumefaciens es una bacteria útil para el suministro e integración de ácidos nucleicos deseados, tal como transgenes deseables, en el genoma de la célula de una planta. El ADN de transferencia de la bacteria (ADN-T) es el vehículo que transporta el transgén desde el plásmido que induce el tumor contenido dentro de la cepa de la bacteria y dentro del material genético de la planta. La industria agrícola explota esta capacidad con el fin de modificar genéticamente los cultivos para expresar genes y rasgos deseables.

Típicamente, se coloca un gen marcador seleccionable al lado del transgén en el ADN-T, de modo que se integra en el genoma de la planta junto con el transgén. La expresión del marcador ayuda a identificar aquellas células que contienen un transgén integrado. Algunos marcadores comunes incluyen genes de resistencia a antibióticos bacterianos, tales como neomicina fosfotransferasa, "nptII" (Fraley y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 4803-4807, 1983) e higromicina fosfotransferasa, "hpt" (Waldron y colaboradores, Plant Mol. Biol. 5: 103-108, 1985]. Otros marcadores fúngicos bacterianos incluyen al gen de resistencia a la micotoxina fúngica, cianamida hidratasa, "cah" (Weeks y colaboradores, Crop Sci. 40: 1749-1754, 2000) , fosfomanosa isomerasa, "manA" o "pmi" (Joersbo y colaboradores, Physiol Plant 105: 109-115, 1999) y treonina desaminasa, "TD" (Ebmeier y colaboradores, Planta 218: 751-758, 2004) .

Es posible coasignar un marcador a un gen específico y por lo tanto crear un ADN-T, que contiene múltiples genes y múltiples marcadores para la integración definitiva en un genoma de una planta. Por lo tanto, la así llamada estrategia de "apilado de genes" combina varias características deseadas en una línea de plantas. Sin embargo, la capacidad de apilar numerosos genes, depende de la disponibilidad e idoneidad de los marcadores coasignados. Por lo tanto, el apilado de genes puede estar limitado por su dependencia de los genes marcadores.

Otra preocupación, es que algunos creen que los marcadores representan riesgos potenciales para la salud humana y animal y para el medio ambiente. Por ejemplo, existe la preocupación de que los genes de resistencia a los antibióticos y a los herbicidas pueden escapar de las plantas en las que han sido introducidos y hacia el medio ambiente. Por lo tanto, los genes de resistencia, fuera del genoma de la planta modificada, pueden conferir una ventaja adaptativa a las malezas y a los patógenos que los incorporen en sus propios genomas (Dale y colaboradores, Nat. Biotech. 20: 567-574, 2002) .

Por consiguiente, se han ideado varias estrategias para extirpar un marcador seleccionable de una planta transgénica. Uno de tales métodos emplea enzimas recombinasa específicas del sitio para eliminar el marcador de su ubicación en el genoma 45 de la planta. Ver Dale y Ow, Proc. Natl. Acad. Sci. 23: 10558-10562, 1991; Kilby y colaboradores, Plant J. 8: 637-652, 994; y Sugita y colaboradores, Plant J. 22: 461-469, 1999. La tasa de éxito de eliminación, sin embargo, es bastante baja. Además, el proceso de escisión típicamente deja elementos de ADN foráneo incrustados en el genoma de la planta.

Otro método implica la eliminación de los marcadores del genoma de la planta por cotransformación. Esta estrategia 50 esencialmente implica el suministro e integración del gen de interés y su marcador en el genoma de la planta usando dos ADN-T. La idea es que es más fácil eliminar el marcador de la línea de la planta, mientras se conserva el gen deseado, porque el gen y el marcador no están enlazados genéticamente. Por lo tanto, deben ocurrir dos eventos de integración distintos permitiendo de este modo que distintos elementos marcadores de ADN-T se crucen nuevamente o bien sean segregados del gen distinto ya que están presentes en lugares no vinculados.

Los ADN-T que contienen el marcador y el gen puede existir dentro del mismo vector binario o en diferente vectores binarios. Del mismo modo, un ADN-T que contiene un marcador puede estar en un plásmido que está contenido dentro de una cepa de Agrobacterium que es igual o diferente a la cepa que contiene el plásmido con el gen deseado o en la estructura de un solo vector binario. Ver Puchta, Plant Cell Tiss. Organ Cult., 74: 123-134, 2003, y Huang y colaboradores, 60 Transgen. Res. 13: 451-461, 2004.

Infortunadamente, estas estrategias de eliminación del marcador requieren mucho tiempo y puede ser económicamente, agotadoras, lo cual es problemático ya que es la ausencia de genes marcadores lo que ayuda a reducir el costo de la desregulación y facilita la comercialización de cultivos genéticamente modificados (Smyth y colaboradores, Nat. Biotech 20: 537-541, 2002) . Más importante aún, estas estrategias son inútiles en cultivos que sean estériles y no se pueden aplicar a los cultivos propagados en forma clonal tales como la patata.

Incluso una preocupación adicional es no sólo la eliminación del gen marcador, sino el hecho de que la transformación mediada por Agrobacterium más frecuentemente no introduce secuencias innecesarias de ADN en la estructura del plásmido en el genoma de la planta. Es decir, las enzimas que empalman el ADN-T del vector plásmido no siempre cortan el plásmido con precisión. Por ejemplo, las enzimas pueden cortar el plásmido más allá de los extremos del ADN-T, que están delineados por secuencias del borde izquierdo y derecho que sirven como sitios de reconocimiento para el corte por parte de las enzimas. Por lo tanto, el ADN-T, una vez empalmado al plásmido, puede ser más largo de lo esperado y por lo tanto trasportar secuencias de la estructura del plásmido además del marcador y el gen de interés.

Estas secuencias de la estructura también pueden integrarse en el genoma de la planta. De hecho, 75% de todos los eventos de integración contienen elementos de la estructura en especies de solanáceas (Kononov y colaboradores, Plant J.

11: 945-957, 1997; Heeres y colaboradores, Euphytica 124: 13-22, 2002; Rommens y colaboradores, Plant Physiol. 135: 421-431, 2004) .

Esta es una preocupación adicional porque las secuencias de la estructura de los plásmidos inductores de tumores que se utilizan en la transformación mediada por Agrobacterium contienen muchos elementos genéticos diferentes, tales como orígenes de replicación, genes marcadores seleccionables bacterianos y otros elementos reguladores externos. Las autoridades agrícolas y ambientales a menudo encuentran la presencia de tal ADN externo extraño en el genoma de una planta que es inaceptable, a pesar de los beneficios conferidos por la expresión del gen cointegrado de interés.

En consecuencia, además de idear estrategias para la eliminación de los marcadores, también deben desarrollarse estrategias para identificar aquellas plantas transgénicas que también contienen secuencias de la estructura del plásmido. Estas incluyen amplificación con base en la reacción en cadena de la polimerasa y transferencias tipo Southern para identificar la retención de las secuencias conocidas del plásmido en la composición genética de la planta. Ambos métodos de detección son tediosos y costosos, especialmente cuando las frecuencias de integración a la estructura son altas.

La colocación de genes letales en la estructura para eliminar las células que se transforman con la estructura es potencialmente útil. Véase la patente de los Estados Unidos No. 6.521.458. Dichos genes, sin embargo, pueden causar problemas a las células circundantes, tales como la alteración de su capacidad para regenerarse.

El gen condicionalmente letal de la citosina desaminasa, (codA) , convierte la 5-fluorocitosina no tóxica (5-FU) en 5fluorouracilo tóxico. Si embargo, se sabe que 5-FU migra a las células que no contienen ninguna secuencia de la estructura del plásmido. Por otra parte, el método de utilización de genes condicionalmente letales requiere la adición de sustratos exógenos, lo que significa otra etapa en la preparación del medio o transferencia del explante.

El uso de genes marcadores... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir una planta transformada que no contiene un marcador seleccionable en su genoma, que comprende (a) infectar células de plantas con Agrobacterium que contiene un vector binario único que comprende (i) un 5 ADN de transferencia que contiene un gen de interés y (ii) un casete de expresión que contiene un gen biosintético de la hormona de una planta posicionado en la estructura fuera del ADN de transferencia, para expresar un gen biosintético de citoquinina; (b) cultivar las células en un medio libre de hormonas para producir brotes; (c) identificar un brote que tiene ADN genómico que contiene el ADN de transferencia pero no el casete de expresión del gen biosintético de citoquinina por selección sin el uso de genes de resistencia a los antibióticos; y (d) cultivar una planta de a partir del brote identificado de (c) , en donde la planta es una planta transformada que no contiene un gen biosintético de la hormona de la planta en su genoma.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el gen biosintético de citoquinina se selecciona de entre un gen de isopentenil transferasa, un gen 1 independiente de citoquinina (CDK-1) , un gen ESR-2 y un gen ESR-1A.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde la expresión de una secuencia de ácido nucleico en el ADN de transferencia modifica un rasgo en la planta transgénica resultante, en donde el rasgo es al menos uno de (i) niveles más bajos de acrilamida, (ii) lesiones reducidas de manchas negras, y (iii) endulzamiento reducido inducido por frío en comparación con una planta que no contiene una célula que exprese esa secuencia de ácido nucleico.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el vector binario único está en una cepa de Agrobacterium y la etapa de transformación comprende poner en contacto la célula de la planta con la cepa de Agrobacterium.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el ADN de transferencia comprende secuencias de ácido nucleico que son nativos al genoma de la célula de la planta.

6. Un método para producir una planta transformada que no contiene un marcador seleccionable en su genoma, que comprende (a) infectar células de plantas con Agrobacterium que contiene un vector binario único que comprende (i) un ADN de transferencia que contiene un gen de interés y (ii) un casete de expresión que contiene un gen biosintético de la hormona de una planta posicionado en la estructura fuera del ADN de transferencia, para expresar un gen biosintético de citoquinina; (b) cultivar las células en un medio libre de hormonas para producir brotes; (c) cultivar los brotes en plantas; y (d) identificar una planta que tiene ADN genómico que contiene el ADN de transferencia, pero no el gen biosintético de citoquinina por selección sin el uso de genes de resistencia a antibióticos, en donde la planta de (d) es una planta 35 transformada que no contiene un gen biosintético de la hormona de la planta en su genoma.

7. El método de la reivindicación 6, en donde el gen biosintético de citoquinina se selecciona a partir de todo el gen de isopentilo transferasa, un gen 1 independiente de citoquinina un gen ESR-2, y un gen ESR-1A.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las células de las plantas están en un explante.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las células de la planta son de una planta seleccionada a partir de patata o de tomate.