Composiciones y métodos para evaluar el uso de receptor/correceptor viral e inhibidores de la entrada de virus utilizando ensayos de virus recombinantes.
Un método para detectar en un paciente infectado por una población de virus el desarrollo de una respuesta de anticuerpos capaz de bloquear la infección por los virus que comprende:
(a) transfectar en una pluralidad de primeras células
i) ácido nucleico que codifica las proteínas de envoltura viral de la población de virus que infectan al paciente, y
ii) un vector de expresión viral que carece de un ácido nucleico que codifica una proteína de envoltura del virus,
de manera que la pluralidad de primeras células producen partículas virales que comprenden la población de proteínas de envoltura viral codificadas por el ácido nucleico obtenido del paciente;
(b) poner en contacto la población de partículas virales producidas en el paso (a) con una preparación de anticuerpos del paciente;
(c) poner en contacto la población de partículas virales y preparación de anticuerpos del paso (b) con una pluralidad de segundas células, donde las segundas células expresan un receptor de la superficie celular al que se une el virus, donde el vector de expresión viral o las segundas células comprenden un ácido nucleico indicador que produce una señal detectable;
(d) medir la cantidad de señal detectable producida por las segundas células para determinar la infecciosidad de la población de partículas virales; y
(e) comparar la cantidad de señal medida en el paso (d) con la cantidad de señal producida con la infección de las segundas células por la población de partículas virales del paso (a) en ausencia de la preparación de anticuerpos, donde una cantidad reducida de señal medida en presencia de la preparación de anticuerpos indica que el paciente ha desarrollado una respuesta de anticuerpos a la población de proteínas de envoltura viral de manera que es capaz de bloquear la infección por la población de virus.
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2003/004373.
Solicitante: MONOGRAM BIOSCIENCES, INC.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 345 Oyster Point Boulevard South San Francisco, CA 94080-4811 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.
Inventor/es: HUANG, WEI, PARKIN,Neil T, PETROPOULOS,Christos J, RICHMAN,DOUGLAS, WRIN,MARY T, LITTLE,SUSAN, WHITCOMB,JEANNETTE M.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/70 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen virus o bacteriófagos.
PDF original: ES-2474193_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Composiciones y métodos para evaluar el uso de receptor/correceptor viral e inhibidores de la entrada de virus utilizando ensayos de virus recombinantes
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La entrada de virus es una nueva diana atractiva para el tratamiento antiviral, y aproximadamente 10 fármacos que están diseñados para bloquear la unión del virus o fusión de la membrana están siendo evaluados actualmente en estudios clínicos o preclínicos (Richman, 1998; PhRMA, 1999; Stephenson, 1999) . Los virus animales con envoltura se unen y entran en la célula huésped a través de la interacción de proteínas virales en la membrana del virión (proteínas de envoltura) y proteínas de la superficie celular (receptores de virus) . El reconocimiento y enlace de receptores es mediado por la proteína de envoltura de superficie.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Por consiguiente, es un objeto de la presente divulgación proporcionar un ensayo fenotípico sensible y
rápido para medir la susceptibilidad de un virus a inhibidores de la entrada viral.
Otro objeto de la presente divulgación es proporcionar un sistema de vector retroviral que produzca partículas de virus que contengan proteínas de envoltura viral derivadas de una variedad de fuentes y la identificación de líneas celulares que expresan receptores virales y toleran la replicación viral.
Otro objeto de la presente divulgación es proporcionar un vector de expresión para la envoltura viral que sea capaz de aceptar segmentos derivados de pacientes que codifican genes de la envoltura.
Otro objeto de esta divulgación es proporcionar un vector bioseguro que represente la mayoría del genoma viral del VIH-1 (HIV-1, en inglés) , pero porte un gen reportero de luciferasa en lugar de la región de envoltura.
Otro objeto de la presente divulgación es el ensayo fenotípico que reduce la probabilidad de formar VIH-1 infeccioso recombinante, proporcionando un vector de expresión viral que porte una deleción en una región reguladora transcripcional (la copia 3' de U3) del genoma del VIH-1.
Otro objeto de la presente divulgación es proporcionar un ensayo capaz de identificar y determinar el tropismo por el receptor/correceptor, que identifica de manera rápida y precisa los pacientes infectados con cepas de un virus trópico.
Estos y otros objetos pueden lograrse por la presente divulgación mediante un método para determinar si un virus tiene una susceptibilidad alterada a un compuesto, comprendiendo dicho método: (a) poner en contacto una célula huésped con el compuesto, donde la célula huésped comprende un ácido nucleico derivado de virus y un gen indicador, la actividad del gen indicador es afectada por la actividad del ácido nucleico derivado de virus de manera que un cambio en la actividad del ácido nucleico derivado de virus resulta en un cambio en la actividad del gen indicador, y el compuesto se dirige directa o indirectamente al ácido nucleico derivado de virus o una proteína que codifica, y (b) detectar la actividad del gen indicador, donde una diferencia en la actividad del gen indicador en la célula huésped en contacto con el compuesto en relación con la actividad en ausencia del compuesto, indica que el virus presenta una susceptibilidad alterada al compuesto.
En un aspecto de la divulgación, una primera célula comprende un ácido nucleico derivado de virus que codifica una proteína viral y un vector de expresión viral que carece del ácido nucleico que codifica la proteína 40 viral y que comprende un ácido nucleico indicador que produce una señal detectable, de manera que la primera célula produce una partícula viral que comprende la proteína viral codificada por el ácido nucleico derivado de virus. La primera célula puede ponerse en contacto con una segunda célula, por ejemplo, una célula huésped, en presencia del compuesto, donde la segunda célula expresa un receptor de superficie celular al que se une la partícula viral. En un modo de realización, la presente divulgación proporciona un método para identificar si un 45 compuesto inhibe la entrada de un virus en una célula que comprende: (a) obtener ácido nucleico que codifica una proteína de envoltura viral de un paciente infectado por el virus; (b) cotransfectar en una primera célula (i) el ácido nucleico del paso (a) , y (ii) un vector de expresión viral que carece de un ácido nucleico que codifica una proteína de envoltura, y que comprende un ácido nucleico indicador que produce una señal detectable, de manera que la primera célula produce partículas virales que comprenden la proteína de envoltura codificada por 50 el ácido nucleico obtenido del paciente; (c) poner en contacto las partículas virales producidas en el paso (b) con una segunda célula en presencia del compuesto, donde la segunda célula expresa un receptor de la superficie celular al que se une el virus; (d) medir la cantidad de señal producida por la segunda célula para determinar la infecciosidad de las partículas virales; y (e) comparar la cantidad de señal medida en el paso (d) con la cantidad de señal producida en ausencia del compuesto, donde una cantidad reducida de señal medida en presencia del compuesto indica que el compuesto inhibe la entrada del virus en la segunda célula.
En otro aspecto, una primera célula comprende un ácido nucleico derivado de virus que codifica una proteína viral y un vector de expresión viral que carece del ácido nucleico que codifica la proteína viral, de manera que la primera célula produce una partícula viral que comprende la proteína viral codificada por el ácido nucleico derivado de virus. La primera célula puede ponerse en contacto con una segunda célula, por ejemplo, una célula huésped, en presencia del compuesto, donde la segunda célula expresa un receptor de superficie celular al que se une la partícula viral. Además, la segunda célula comprende un ácido nucleico indicador que produce una señal detectable. En un modo de realización, el ácido nucleico indicador se integra en el ácido nucleico de la segunda célula.
En un modo de realización, la presente divulgación proporciona un método para detectar en un paciente infectado por un virus el desarrollo de una respuesta de anticuerpos capaz de bloquear la infección que comprende: (a) poner en contacto una célula huésped con una preparación de anticuerpos del paciente, donde 15 la célula huésped comprende un ácido nucleico que codifica una proteína viral del paciente y un ácido nucleico indicador que produce una señal detectable; (b) medir la cantidad de señal detectable producida por la célula huésped; y (c) comparar la cantidad de señal medida en el paso (b) con la cantidad de señal producida en ausencia de la preparación de anticuerpos, donde una cantidad reducida de señal medida en presencia de la preparación de anticuerpo indica que el paciente ha desarrollado una respuesta de anticuerpos a la proteína viral capaz de bloquear la infección.
En otro modo de realización, la presente divulgación proporciona un método para detectar en un paciente infectado por un virus el desarrollo de una respuesta de anticuerpos capaz de bloquear la infección que comprende: (a) transfectar en una primera célula (i) un ácido nucleico que codifica una proteína viral del paciente, y (ii) un vector de expresión viral que carece de un ácido nucleico que codifica la proteína viral, y que 25 comprende un ácido nucleico indicador que produce una señal detectable, de tal manera que la primera célula produce partículas virales que comprenden la proteína viral codificada por el ácido nucleico obtenido del paciente; (b) poner en contacto las partículas virales producidas en el paso (a) con una preparación de anticuerpos del paciente; (c) poner en contacto las partículas virales y la preparación de anticuerpos del paso (b) con una segunda célula, donde la segunda célula expresa un receptor de la superficie celular al que se une el
virus; (d) medir la cantidad de señal detectable producida por la segunda célula para determinar la infecciosidad de las partículas virales; y (e) comparar la cantidad de señal medida en el paso (d) con la cantidad de señal producida en ausencia de la preparación de anticuerpos, donde una cantidad reducida de señal medida en presencia de la preparación de anticuerpos indica que el paciente ha desarrollado una respuesta de anticuerpos a la proteína viral capaz de bloquear la infección.
En otro modo de realización, la presente invención proporciona un método para detectar en un paciente infectado por un virus el desarrollo de una respuesta de anticuerpos capaz de bloquear la infección que comprende: (a) transfectar en una primera célula (i) un ácido nucleico que... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Un método para detectar en un paciente infectado por una población de virus el desarrollo de una respuesta de anticuerpos capaz de bloquear la infección por los virus que comprende: (a) transfectar en una pluralidad de 5 primeras células i) ácido nucleico que codifica las proteínas de envoltura viral de la población de virus que infectan al paciente, y
ii) un vector de expresión viral que carece de un ácido nucleico que codifica una proteína de envoltura del virus,
de manera que la pluralidad de primeras células producen partículas virales que comprenden la población de proteínas de envoltura viral codificadas por el ácido nucleico obtenido del paciente; (b) poner en contacto la población de partículas virales producidas en el paso (a) con una preparación de anticuerpos del paciente; (c) poner en contacto la población de partículas virales y preparación de anticuerpos del paso (b) con una pluralidad de segundas células, donde las segundas células expresan un receptor de la superficie celular al que se une el virus, donde el vector de expresión viral o las segundas células comprenden un ácido nucleico indicador que produce una señal detectable; (d) medir la cantidad de señal detectable producida por las segundas células para determinar la infecciosidad de la población de partículas virales; y (e) comparar la cantidad de señal medida en el paso (d) con la cantidad de señal producida con la infección de las segundas células por la población de partículas virales del
paso (a) en ausencia de la preparación de anticuerpos, donde una cantidad reducida de señal medida en presencia de la preparación de anticuerpos indica que el paciente ha desarrollado una respuesta de anticuerpos a la población de proteínas de envoltura viral de manera que es capaz de bloquear la infección por la población de virus.
2. Un método para detectar en un paciente infectado por una población de virus el desarrollo de una respuesta 25 de anticuerpos capaz de bloquear la infección por los virus que comprende:
(a) incubar una pluralidad de primeras células que comprende (i) un ácido nucleico que codifica proteínas de envoltura viral de una población de virus que infectan al paciente, y
(ii) un vector de expresión viral que carece de un ácido nucleico que codifica una proteína de 30 envoltura del virus, y que comprende un ácido nucleico indicador que produce una señal detectable,
de manera que la pluralidad de primeras células producen partículas virales que comprenden la población de proteínas de envoltura viral codificadas por el ácido nucleico obtenido del paciente;
(b) poner en contacto la población de partículas virales producidas en el paso (a) con una preparación de anticuerpos del paciente;
(c) poner en contacto la población de partículas virales y preparación de anticuerpos del paso (b) con una pluralidad de segundas células, donde la pluralidad de segundas células expresan un receptor de la superficie celular al que se une el virus;
(d) medir la cantidad de señal detectable producida por la pluralidad de segundas células para determinar la infecciosidad de las partículas virales; y
(e) comparar la cantidad de señal medida en el paso (d) con la cantidad de señal producida con la infección de una pluralidad de segundas células por la población de partículas virales del paso (a) en ausencia de la preparación de anticuerpos, donde una cantidad reducida de señal medida en presencia de la preparación de anticuerpos indica que el paciente ha desarrollado una respuesta de anticuerpos a la población viral de proteínas de envoltura de manera que es capaz de bloquear la infección por la 45 población de virus.
3. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, donde el ácido nucleico de (i) es parte del vector de expresión viral de (ii) .
4. El método de las reivindicaciones 1 -3, donde el ácido nucleico de (i) y/o vector viral de (ii) están integrados
en el genoma de la pluralidad de primeras células.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el ácido nucleico indicador comprende un gen indicador que codifica luciferasa.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde el virus es VIH-1.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde el ácido nucleico que codifica la población de proteínas de envoltura viral codifica la glicoproteína de envoltura de superficie (gp120) , y/o la glicoproteína de envoltura transmembrana (gp41) .
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde el vector de expresión viral comprende un ácido nucleico de gag-pol de VIH-1.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la pluralidad de primeras células son un 15 tipo celular humano.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la pluralidad de segundas células es una de entre una célula T humana, una célula mononuclear de sangre periférica, una célula de astroglioma, como una célula U87, o una célula de osteosarcoma humana, como una célula HT4.
13. Un método para evaluar la neutralización por anticuerpos de VIH-1 que comprende:
(a) incubar una pluralidad de primeras células que comprenden un vector de expresión viral que incluye un ácido nucleico que codifica la población de proteínas de envoltura viral de VIH-1 de un paciente y comprende además un ácido nucleico indicador que produce una señal detectable;
de manera que la pluralidad de primeras células producen partículas virales que comprenden la población de proteínas de envoltura viral del paciente; y
(b) poner en contacto la población de partículas virales producida en el paso (a) con una preparación de anticuerpos que comprende anticuerpos bien caracterizados;
(c) poner en contacto la población de partículas virales y preparación de anticuerpos del paso (a) con una segunda célula, donde la segunda célula expresa un receptor de la superficie celular al que se une la partícula viral;
(d) medir la cantidad de señal detectable producida por las segundas células para determinar la infecciosidad de la población de partículas virales; y
(e) comparar la cantidad de señal medida en el paso (d) con la cantidad de señal producida con la infección de la pluralidad de segundas células con la población de partículas virales de (a) , en ausencia de la preparación de anticuerpos, donde una cantidad reducida de señal medida en presencia de preparación de anticuerpos usando la población de partículas virales de (a) indica que la población de virus del paciente comprende virus que son susceptibles de ser neutralizados por dichos anticuerpos específicos bien caracterizados.
LUCIFERASA GEN
INDICADOR
PHENOSENSE™ HIV: ENSAYO CELULAR
ADN
ADN pHIVluc∆U3
pHIVenv TRANSFECCIÓN INFECCIÓN INHIBIDORES
DE ENTRADA
DE VIRUS AÑADIDOS
ESTRATEGIAS DE EXPRESIÓN
DE ENVOLTURA DE
VIH
DETECCIÓN DE
TROPISMO
POR EL CORRECEPTOR
CÉLULAS
QUE
EXPRESAN
CCR5
REPLICA 1
REPLICA
SIN FÃ?RMACO
INHIBIDOR
CCR5
INHIBIDOR
CXCR4
SIN FÃ?RMACO
INHIBIDOR
CCR5
INHIBIDOR
CXCR4
CÉLULAS
QUE
EXPRESAN
CXCR4
INTERPRETACIÓN
DE
ENSAYO
DE TROPISMO POR
EL
CORRECEPTOR
CÉLULAS
R5
CÉLULAS
X4
SIN FÃ?RMACO
SIN FÃ?RMACO
INHIBIDOR DE
R5
INHIBIDOR DE
R5
INHIBIDOR DE X4
INHIBIDOR DE X4
% INHIB.
POR INHIBIDOR
DE
R5
% INHIB.
POR
INHIBIDOR
DE
R5
% INHIB.
POR
INHIBIDOR
DE
X4
% INHIB.
POR INHIBIDOR
DE
X4
DUAL O
MIXTO
NO
VIABLE
LÃ?MITE
RLU
ACTIVO
LÃ?MITE
RATIO
TROPISMO
SIN FÃ?RMACO
SIN FÃ?RMACO
INHIBIDOR DE
R5
INHIBIDOR DE
R5
INHIBIDOR DE X4
INHIBIDOR DE X4
% INHIB. POR INHIBIDOR DE
R5
% INHIB.
POR
INHIBIDOR
DE
R5
% INHIB.
POR INHIBIDOR DE
X4
% INHIB.
POR
INHIBIDOR
DE
X4
HOJA ALTERNATIVA (NORMA 26) 50
SUSCEPTIBILIDAD AL
INHIBIDOR DE
ENTRADA:
INHIBIDOR
DE FUSIÓN
CONCENTRACIÓN
DE FÃ?RMACO
% INHIBICIÓN
SUSCEPTIBILIDAD
REDUCIDA:
INHIBIDOR DE FUSIÓN
CONCENTRACIÓN
DE FÃ?RMACO
% INHIBICIÓN
SUSCEPTIBILIDAD AL INHIBIDOR DE ENTRADA: INHIBIDOR DE CCR5
FÃ?RMACO:
INHIBIDOR DE R5CÉLULA: CD4/CCR5
% INHIBICIÓN
SUSCEPTIBILIDAD AL INHIBIDOR DE ENTRADA: INHIBIDOR DE CXCR4
FÃ?RMACO:
INHIBIDOR DE X4 CÉLULA: CD4/CXCR4
% INHIBICIÓN
AMPLIFICACIÓN
DE SECUENCIA DE ENVOLTURA
NP: plasma negativo VIH
Nº de
aislados Tropismo por el correceptor
Indefinido Subtipo
Nº de
aislados VARIANTE
de envoltura
A VARIANTE
B VARIANTE
C VARIANTE
D VARIANTE
E
EXPRESIÓN
DE CORRECEPTOR
Y RECEPTOR
DE
CÉLULA
DIANA
HOJA ALTERNATIVA (NORMA 26)
CÉLULAS CCR5 + CXCR4
CÉLULAS CCR5
CÉLULAS
CXCR4
INHIBICIÓN
POR ANTAGONISTAS
DE
CORRECEPTOR
FÃ?RMACO: INHIBIDOR
DE X4 FÃ?RMACO:
INHIBIDOR
DE X4 FÃ?RMACO:
INHIBIDOR
DE
X4
CORRECEPTOR: X4, R5
CORRECEPTOR:
R5
CORRECEPTOR:
X4
FÃ?RMACO: INHIBIDOR
DE
R5 FÃ?RMACO:
INHIBIDOR
DE R5 FÃ?RMACO:
INHIBIDOR
DE
R5
CORRECEPTOR: X4, R5
CORRECEPTOR:
R5
CORRECEPTOR:
X4
% INHIBICIÓN
% INHIBICIÓN
% INHIBICIÓN % INHIBICIÓN HOJA ALTERNATIVA (NORMA 26)
PÉPTIDOS INHIBIDORES
DE FUSIÓN
EXTRACELULAR
INTRACELULAR
PÉPTIDOS
VIRUS DE PACIENTE V.
ANTICUERPOS
DE PACIENTE
FECHA PLASMA
(ANTICUERPO)
VIRUS DE REFERENCIA
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