Vectores para la expresión de múltiples genes.

Vector que comprende por lo menos una primera molécula de ácido nucleico que codifica un primer polipéptido yuna segunda molécula de ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido,

en el que:

- dichas primera y segunda moléculas de ácido nucleico se obtienen respectivamente a partir de una primera yuna segunda secuencias de ácido nucleico nativo que presentan un porcentaje de homología deaproximadamente 80% o superior a 80% en una porción de 40 o más nucleótidos continuos, y

- dicha primera molécula de ácido nucleico y/o dicha segunda molécula de ácido nucleico comprendidas en elvector se modifican a fin de reducir dicho porcentaje de homología a menos de 75%; y

en el que dicha primera molécula de ácido nucleico y dicha segunda molécula de ácido nucleico codifican por lomenos el mismo polipéptido obtenido a partir de serotipos de VPH estrechamente relacionados.

Vectores para la expresión de múltiples genes.

La presente invención se refiere a un vector recombinante diseñado para expresar de forma independiente múltiples secuencias de nucleótidos de interés que se obtienen a partir del mismo organismo o de organismos estrechamente relacionados. La presente invención pertenece al sector de la tecnología del ácido nucleico recombinante para la expresión de múltiples secuencias de nucleótidos que presentan homología entre sí en diversos sistemas in vitro procariotas y eucariotas, o en un individuo animal o humano, con fines terapéuticos o profilácticos. La presente invención es particularmente útil en el campo de la inmunoterapia, especialmente en el tratamiento o la prevención de estados patológicos causados por organismos infecciosos como el virus del papiloma o el virus de la hepatitis.

La tecnología del ADN recombinante ha hecho posible la expresión de secuencias de nucleótidos en células hospedadoras cultivadas o en organismos vivos. Se han generado y utilizado diversos ADN plasmídicos y vectores víricos para una variedad de propósitos, incluidos la vacunación, la terapia génica, la inmunoterapia y la expresión en células cultivadas. Los vectores, como los vectores adenovíricos y poxvíricos, tienen la ventaja de que poseen una gran capacidad de clonación, con capacidad para expresar múltiples secuencias de nucleótidos en una amplia gama de células hospedadoras. La expresión de múltiples secuencias de nucleótidos puede resultar ventajosa para mejorar la eficacia terapéutica proporcionada por los polipéptidos codificados (por ejemplo, combinando la inmunidad humoral y la celular) . En lugar de producir una serie de vectores recombinantes diseñados por separado para expresar cada una de las secuencias de nucleótidos deseadas, sería ventajoso producir un único vector recombinante, por lo menos, para facilitar las etapas de producción y la aprobación de la autoridad competente.

Por ejemplo, en el caso de las infecciones por el virus del papiloma, sería deseable expresar polipéptidos inmunógenos de diversos genotipos del virus del papiloma con el fin de ampliar o reforzar la respuesta inmunitaria del hospedador, especialmente en sujetos con riesgo de infecciones múltiples, por ejemplo de VPH-16 y VPH-18. Sin embargo, las secuencias de nucleótidos que codifican dichos polipéptidos inmunógenos son altamente homólogas entre los genotipos relacionados del VPH. Por ejemplo, las secuencias E6 de VPH-16 y E6 de VPH-18, que muestran una homología global del 63% en el nivel de los nucleótidos, comprenden, sin embargo, regiones concretas con una homología muy alta, mayor del 75%, lo que puede llegar a impedir la expresión de los genes de VPH-16 y VPH-18 a partir de un único vector.

Por otro lado, cuando se expresan polipéptidos de origen vírico, también pueden surgir secuencias de nucleótidos homólogas a causa de la organización global del genoma vírico. Es bastante frecuente que un virus utilice la misma secuencia de nucleótidos para codificar dos proteínas diferentes a través de mecanismos biológicos tales como la iniciación de la traducción interna o el desplazamiento del marco de lectura, es decir, que la misma secuencia de ADN se traduce en más de un marco de lectura. Por ejemplo, en el genoma de VPH-16, los genes adyacentes E1 y E2 se solapan en más de 59 nucleótidos que se traducen en diferentes marcos de lectura. Dicho de otro modo, los últimos 59 nucleótidos del gen E1 se solapan con los primeros 59 nucleótidos del gen E2.

Sin embargo, se prevé que la presencia de secuencias homólogas en un vector influya negativamente en su estabilidad, especialmente durante las etapas de producción del mismo, provocando la pérdida de secuencias génicas debido a eventos de recombinación que se producen entre las secuencias homólogas. Por consiguiente, la expresión de los genes E1 y E2 de VPH-16 en un único vector implica la presencia de una porción común de 59 nucleótidos que podría provocar potencialmente eventos de recombinación homóloga y, en última instancia, la pérdida de las secuencias comprendidas entre las secuencias homólogas de E1 y E2. Este tipo de eventos de recombinación homóloga no deseados también pueden tener lugar cuando se expresan las secuencias génicas de VPH-16 y VPH-18 en el mismo vector. Este problema de inestabilidad puede hacer que la reserva de vector sea inservible, especialmente para ensayos clínicos en humanos.

En este sentido, el documento WO 92/16636 propone insertar en el vector recombinante las secuencias de nucleótidos homólogas en una orientación recíprocamente opuesta, con el fin de reducir la probabilidad de que se produzcan eventos de recombinación. Sin embargo, esta estrategia se ha descrito en referencia a un vector del virus de la vaccinia, no para otros vectores recombinantes, como los adenovirus. Por otro lado, la disposición en una orientación opuesta no siempre es posible debido a la posible interferencia de promotores y restricciones constructivas.

En la técnica hay una necesidad de generar vectores recombinantes capaces de expresar en una célula hospedadora o en un individuo secuencias de nucleótidos obtenidas a partir del mismo organismo o de organismos estrechamente relacionados, que, en el contexto nativo, contienen porciones con una homología elevada. La presente invención aborda esta necesidad dando a conocer una nueva estrategia diseñada para minimizar la probabilidad de que se produzcan eventos de recombinación mediante la alteración de una o ambas secuencias de nucleótidos homólogas utilizando la degeneración del código genético para hacer que sean menos homólogas que antes de la modificación, a la vez que no se altera, o no de forma significativa, la secuencia de aminoácidos codificada. La presente invención permite eludir el efecto nocivo de la recombinación homóloga que se produce entre secuencias homólogas, especialmente durante las etapas de producción de los vectores, y que provocan la pérdida de secuencias de nucleótidos contenidas entre las mismas. Se ha puesto de manifiesto que el vector según la presente invención es sorprendentemente eficaz en la expresión de los genes E1 y E2 del virus del papiloma, que en el contexto nativo comparten una porción 100% homóloga de 59 nucleótidos, y es sorprendentemente estable durante las etapas de producción. También se ha puesto de manifiesto que el vector según la presente invención es sorprendentemente eficaz en la expresión de los genes E6 y E7 obtenidos a partir de los genotipos estrechamente relacionados VPH-16 y VPH-18.

Este problema técnico se resuelve mediante la disposición de las formas de realización tal como se definen en las reivindicaciones.

Otros aspectos, características y ventajas, distintos y adicionales, de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción de las formas de realización preferidas de la misma. Dichas formas de realización se indican a efectos divulgativos.

De este modo, en un primer aspecto, la presente invención da a conocer un vector que comprende, por lo menos, una primera molécula de ácido nucleico que codifica un primer polipéptido y una segunda molécula de ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido, en el que:

- dichas primera y segunda moléculas de ácido nucleico se obtienen, respectivamente, a partir de una primera y una segunda secuencias de ácido nucleico nativo que presentan un porcentaje de homología de aproximadamente el 80% o mayor del 80% en una porción de 40 o más nucleótidos continuos, y

- dicha primera molécula de ácido nucleico y/o dicha segunda molécula de ácido nucleico comprendidas en el vector se modifican a fin de reducir dicho porcentaje de homología a menos del 75%.

Tal como se utilizan a lo largo de la presente solicitud, los términos “un”, “uno” y “una” se refieren a “por lo menos uno”, “por lo menos un primer”, “uno o más” o “una pluralidad” de los compuestos o etapas a los que se hace referencia, a menos que el contexto indique lo contrario. Por ejemplo, en el término “una célula” se incluye una pluralidad de células, incluida una mezcla de las mismas.

Allí donde se utilice en la presente memoria, la expresión “y/o” incluye los significados de “y”, “o” y “todos los elementos conectados por dicho término o cualquier otra combinación de los mismos”. Por ejemplo, “la primera molécula de ácido nucleico y/o la segunda molécula de ácido nucleico” se refiere a la primera molécula de ácido nucleico, o bien a la segunda molécula de ácido nucleico, o bien... [Seguir leyendo]

1. Vector que comprende por lo menos una primera molécula de ácido nucleico que codifica un primer polipéptido y una segunda molécula de ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido, en el que:

- dichas primera y segunda moléculas de ácido nucleico se obtienen respectivamente a partir de una primera y una segunda secuencias de ácido nucleico nativo que presentan un porcentaje de homología de aproximadamente 80% o superior a 80% en una porción de 40 o más nucleótidos continuos, y

- dicha primera molécula de ácido nucleico y/o dicha segunda molécula de ácido nucleico comprendidas en el vector se modifican a fin de reducir dicho porcentaje de homología a menos de 75%; y

en el que dicha primera molécula de ácido nucleico y dicha segunda molécula de ácido nucleico codifican por lo menos el mismo polipéptido obtenido a partir de serotipos de VPH estrechamente relacionados.

2. Vector según la reivindicación 1, en el que el patrón de uso de codones de la primera molécula de ácido nucleico o de la segunda molécula de ácido nucleico, o de la primera y la segunda moléculas de ácido nucleico se modifica por lo menos en dicha (s) porción/porciones homóloga (s) de 40 o más nucleótidos continuos con el fin de reducir el porcentaje de homología a menos de 75%.

3. Vector según la reivindicación 2, en el que el patrón de uso de codones se modifica en el nivel de los nucleótidos y dichas modificaciones son silenciosas en el nivel de los aminoácidos.

4. Vector según la reivindicación 2 o 3, en el que el patrón de uso de codones se modifica de tal manera que las porciones homólogas entre la primera y la segunda moléculas de ácido nucleico se limitan a menos de 8, preferentemente menos de 5, nucleótidos consecutivos.

5. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho vector es un vector adenovírico, preferentemente un vector adenovírico defectuoso en la replicación.

6. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho vector es un vector poxvírico, preferentemente obtenido a partir de un virus de la vaccinia seleccionado de entre el grupo constituido por la cepa Copenhagen, la cepa Wyeth, NYVAC y la cepa Ankara modificada (MVA) altamente atenuada.

7. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la primera y la segunda moléculas de ácido nucleico se obtienen de manera independiente a partir de un virus del papiloma de alto riesgo seleccionado de entre el grupo constituido por VPH-16, VPH-18, VPH-30, VPH-31, VPH-33, VPH-35, VPH-39, VPH-45, VPH-51, VPH-52, VPH-56, VPH-58, VPH-59, VPH-66, VPH-68, VPH-70 y VPH-85.

8. Vector según la reivindicación 7, en el que la primera y la segunda moléculas de ácido nucleico codifican un polipéptido precoz del virus del papiloma seleccionado de entre el grupo constituido por E1, E2, E6 y E7.

9. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho mismo polipéptido obtenido a partir de organismos estrechamente relacionados es un polipéptido E2.

10. Vector según la reivindicación 9, en el que los serotipos de VPH estrechamente relacionados son VPH-16, VPH18, VPH-33 y/o VPH-52.

11. Vector según la reivindicación 10, en el que dicho vector comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido E2 de VPH-16, una segunda molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido E2 de VPH-18, una tercera molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido E2 de VPH-33 y una cuarta molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido E2 de VPH-52.

12. Vector según la reivindicación 11, en el que dicho polipéptido E2 de VPH-16 comprende la secuencia de aminoácidos presentada en la SEC ID nº: 7, dicho polipéptido E2 de VPH-18 comprende la secuencia de aminoácidos presentada en la SEC ID nº: 8, dicho polipéptido E2 de VPH-33 comprende la secuencia de aminoácidos presentada en la SEC ID nº: 70 y dicho polipéptido E2 de VPH-52 comprende la secuencia de aminoácidos presentada en la SEC ID nº: 71.

13. Vector según la reivindicación 11 o 12, en el que dicha primera molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos indicada en la SEC ID nº: 12; dicha segunda molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos indicada en la SEC ID nº: 13; dicha tercera molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos presentada en la SEC ID nº: 67 y dicha cuarta molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos presentada en la SEC ID nº: 69.

14. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y 10, en el que dicho mismo polipéptido obtenido a partir de

organismos estrechamente relacionados es un polipéptido E6, un polipéptido E7 o ambos polipéptidos E6 y E7.

15. Vector según la reivindicación 14, en el que la primera molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido E6 de

VPH-16 y la segunda molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido E6 de VPH-18, en el que la segunda 5 molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos presentada en SEC ID nº: 14.

16. Vector según la reivindicación 14, en el que la primera molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido E7 de VPH-16 y la segunda molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido E7 de VPH-18, en el que la segunda molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos presentada en SEC ID nº: 15.

17. Vector según la reivindicación 15 o 16, en el que dicho vector es un vector de MVA, la primera molécula de ácido nucleico se dispone bajo el control del promotor 7.5K del virus de la vaccinia y la segunda molécula de ácido nucleico se coloca bajo el control del promotor H5R del virus de la vaccinia, y la primera y la segunda moléculas de ácido nucleico están insertadas en la deleción III de dicho vector de MVA.

18. Vector según la reivindicación 14, en el que dicho vector comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido E6 de VPH-16, una segunda molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido E6 de VPH-18, una tercera molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido E7 de VPH-16 y una cuarta molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido E7 de VPH-18, en el que dichas primera, segunda, tercera y cuarta moléculas de ácido nucleico no comprenden una porción de 40 o más nucleótidos continuos que presenten un porcentaje de homología de 75% o superior a 75%.

19. Molécula de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia de nucleótidos presentada en cualquiera de entre las SEC ID nº: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 66, 67, 68 o 69. 25

20. Célula hospedadora que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 19 o el vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

21. Composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula de ácido

nucleico según la reivindicación 19, el vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, o la célula hospedadora según la reivindicación 20, un vehículo farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente uno o más adyuvantes adecuados para la administración sistémica o mucosa a humanos, preferentemente un compuesto de imidazoquinolina.

22. Utilización de la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 19, del vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, de la célula hospedadora según la reivindicación 20 o de la composición según la reivindicación 21, para la preparación de un fármaco destinado al tratamiento o a la prevención de enfermedades infecciosas, cánceres o enfermedades de inmunodeficiencia.

23. Utilización según la reivindicación 22 para el tratamiento preventivo o curativo de una afección asociada con la infección por un virus del papiloma, tal como una infección persistente, lesiones premalignas y malignas.

24. Utilización según la reivindicación 22 o 23, en la que dicha utilización se lleva a cabo según una modalidad

terapéutica de sensibilización y refuerzo, y en la que dicho vector o composición se utiliza para sensibilizar o 45 reforzar, o para sensibilizar y reforzar, una respuesta inmunitaria en un individuo.