Las alquilaminas mejoran la detección de compuestos en muestras biológicas fijadas con formaldehído.

Un método para el análisis de uno o más compuestos de una muestra biológica entrecruzada con formaldehído,

y

el método incluye

(1) la puesta en contacto de la muestra a temperatura ambiente con una cantidad suficiente de unaalquilamina seleccionada a partir del grupo que incluye etilendiamina, etanolamina, y propilamina para liberar,al menos, una parte del compuesto entrecruzado y así mejorar la accesibilidad de uno o más compuestospara el análisis,

(2) la sustracción sustancial de la alquilamina de la muestra con anterioridad al paso de detección, y

(3) la detección del(de los) compuesto(s), en el que los compuestos son ácidos nucleicos.

Las alquilaminas mejoran la detección de compuestos en muestras biológicas fijadas con formaldehído.

Antecedentes de la invención Durante cientos de años los patólogos han preservado rutinariamente las muestras biológicas, tales como las muestras tisulares, mediante la fijación con formaldehído. Mientras que el tratamiento con formaldehído preserva las características celulares del tejido, el tratamiento con formaldehído también da como resultado entrecruzamientos químicos que provocan que la detección cuantificación y caracterización de muchos de los compuestos biológicos de la muestra resulten inaccesibles o difícilmente accesibles. El formaldehído preserva o fija el tejido o las células mediante el entrecruzamiento de grupos amina primarios de las proteínas con otros átomos de nitrógeno cercanos en la proteína o el DNA mediante un enlace -CH2-. Así, por ejemplo, mientras que la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es útil para detectar y cuantificar los ácidos nucleicos en las muestras biológicas, la PCR tiene una efectividad pobre o nula en relación al análisis de los ácidos nucleicos en las muestras entrecruzadas con formaldehído, especialmente cuando se desean resultados cuantitativos.

Por consiguiente, el entrecruzamiento de los ácidos nucleicos con compuestos celulares mediante la acción del formaldehído presenta dificultades relacionadas con la detección de varios compuestos celulares, incluyendo la detección de ácidos nucleicos y proteínas. Tales métodos se describen en la patente WO 9404906, la patente US 20040029184 o la patente WO 2006 066039, que describen tales dificultades. Mientras que algunos han descrito formas de mejorar la amplificación de ácidos nucleicos de las muestras entrecruzadas con formaldehído, habitualmente las mejoras incluyen la mera degradación de las proteínas en la muestra o la adición de detergentes que no suelen cambiar los enlaces covalentes que forman los entrecruzamientos. La presente invención se relaciona con este y otros problemas.

Breve resumen de la invención

La presente invención proporciona métodos para el análisis de uno o más compuestos de una muestra biológica entrecruzada con formaldehído. En algunas realizaciones, los métodos incluyen la puesta en contacto de la muestra con una cantidad suficiente de una alquilamina para liberar, al menos, una parte del compuesto entrecruzado y así mejorar la accesibilidad de tal uno o más compuestos para su análisis.

En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra tisular de un animal.

En algunas realizaciones, la cantidad de alquilamina es de entre el 0, 01% (aproximadamente 2 mM) y el 5% (aproximadamente 800 mM) .

En realizaciones preferibles, la muestra y la alquilamina se calientan durante un periodo de tiempo.

En algunas otras realizaciones preferibles, los métodos también incluyen la detección del compuesto.

En algunas realizaciones, la alquilamina se sustrae sustancialmente de la muestra antes del paso de detección. En algunas realizaciones, la concentración de alquilamina se reduce a menos de aproximadamente el 0, 5% (aproximadamente 80 mM) (por ejemplo, menos de aproximadamente el 0, 2% o el 0, 1%) antes del paso de detección.

En algunas realizaciones, el paso de detección incluye la cuantificación del compuesto.

El compuesto es un ácido nucleico. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es DNA. En algunas realizaciones, el compuesto es RNA.

En algunas realizaciones, los métodos también incluyen la detección del ácido nucleico. En algunas realizaciones, el paso de detección incluye la amplificación del ácido nucleico. En algunas realizaciones, el compuesto del ácido nucleico se pone en contacto con una sonda bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre la sonda y el ácido nucleico, y la detección de la presencia del dúplex. En algunas realizaciones, la sonda se enlaza a un soporte sólido. En algunas realizaciones, el paso de amplificación incluye la reacción en cadena de la polimerasa.

En algunas realizaciones no reivindicadas, el compuesto es una proteína. En algunas realizaciones, los métodos también incluyen la detección de la proteína. En algunas realizaciones, el paso de detección incluye la espectrometría de masas o electroforesis. En algunas realizaciones, la espectrometría de masas incluye la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) .

En algunas realizaciones, la muestra se embebe en parafina antes del paso de contacto.

En algunas realizaciones, la alquilamina se selecciona a partir del grupo que incluye etilendiamina, etanolamina, y propilamina.

En algunas realizaciones, la parte del compuesto disponible para el análisis aumenta, al menos, al doble en comparación a la parte accesible para el análisis si no se lleva a cabo en paso de contacto. En algunas realizaciones, la parte del compuesto disponible para el análisis incrementa, al menos, unas diez veces en comparación a la parte accesible para el análisis si no se lleva a cabo en paso de contacto.

En algunas realizaciones, los métodos también incluyen la puesta en contacto de la muestra con una proteasa para degradar la proteína en la muestra y así hacer que los ácidos nucleicos estén más disponibles para el análisis.

La presente invención también proporciona un equipo para la mejora de la disponibilidad de uno o más compuestos de una muestra biológica entrecruzada con formaldehído. En algunas realizaciones, el equipo incluye una alquilamina y medios para la sustracción de la alquilamina de una muestra biológica, por ejemplo, una proteasa o un reactivo o un aparato.

En algunas realizaciones, el equipo incluye un reactivo o un aparato para sustraer la alquilamina de una muestra biológica. En algunas realizaciones, el aparato es una columna para la purificación de ácidos nucleicos.

En algunas realizaciones, el equipo incluye una proteasa. En algunas realizaciones, la proteasa es la proteinasa K.

En algunas realizaciones, el equipo también incluye nucleótidos y/o una polimerasa termoestable. En algunas realizaciones, la polimerasa termoestable es la Taq polimerasa.

La presente invención también proporciona mezclas de reacción. En algunas realizaciones, las mezclas de reacción incluyen una muestra biológica entrecruzada con formaldehído, y una cantidad suficiente de una alquilamina para liberar al menos una parte del compuesto entrecruzado.

En algunas realizaciones, la cantidad de alquilamina es de entre el 0, 01% y el 5%. En algunas realizaciones, la alquilamina se selecciona a partir del grupo que incluye etilendiamina, etanolamina, y propilamina. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra tisular de un animal.

Definiciones Una "muestra biológica entrecruzada con formaldehído" hace referencia a una muestra biológica que se ha tratado con formaldehído de modo que se forma un entrecruzamiento entre un nitrógeno de una proteína y otras proteínas y/o ácido nucleico que contiene nitrógeno. Habitualmente, una muestra biológica contiene células. La muestra biológica puede ser, por ejemplo, una muestra tisular de un animal. Muchas muestras tratadas con formaldehído se almacenan embebidas en parafina.

Tal y como se utiliza aquí, el término "alquilamina" hace referencia a una molécula lineal o ramificada, saturada o insaturada de 1-10 o más átomos de carbono y uno o más grupos amino. La parte alquilo de la alquilamina puede ser metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, isopropilo, isobutilo, secbutilo, terbutilo, etc. Los grupos amino pueden ser primarios o secundarios. La alquilamina puede sustituirse adicionalmente con no más de dos (es decir, 0, 1 o 2) sustituyentes que incluyen, pero no se limitan a, uno o más grupos hidroxilo. Las alquilaminas útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, etilamina, propilamina, isopropilamina, etilendiamina y etanolamina. Los expertos en la materia apreciarán que se pueden utilizar otras alquilaminas en la presente invención.

La oración "la detección del compuesto" hace referencia a la determinación de, al menos, la presencia o ausencia del compuesto y puede incluir también la cuantificación u otra caracterización del compuesto o parte del compuesto.

Un "compuesto" de una muestra biológica hace referencia a una clase de molécula (por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, etc.) o una diana específica tal como una proteína específica o una secuencia de ácido nucleico que se quiere detectar.

Tal y como se utiliza aquí, el término "ácido nucleico" hace referencia a polímeros de desoxirribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa)... [Seguir leyendo]

1. Un método para el análisis de uno o más compuestos de una muestra biológica entrecruzada con formaldehído, y el método incluye

(1) la puesta en contacto de la muestra a temperatura ambiente con una cantidad suficiente de una alquilamina seleccionada a partir del grupo que incluye etilendiamina, etanolamina, y propilamina para liberar, al menos, una parte del compuesto entrecruzado y así mejorar la accesibilidad de uno o más compuestos para el análisis,

(2) la sustracción sustancial de la alquilamina de la muestra con anterioridad al paso de detección, y

(3) la detección del (de los) compuesto (s) , en el que los compuestos son ácidos nucleicos.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la cantidad de alquilamina es de entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 800 mM.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la concentración de la alquilamina se reduce a menos de aproximadamente 80 mM antes del paso de detección

4. El método de la reivindicación 1, en el que el paso de detección incluye la amplificación del ácido nucleico.

5. El método de la reivindicación 1, en el que el compuesto de ácido nucleico se pone en contacto con una sonda bajo condiciones para permitir la formación de un complejo entre la sonda y el ácido nucleico, y la detección de la presencia del dúplex.

6. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra se embebe en parafina antes del paso de puesta en contacto.

7. El método de la reivindicación 1, en el que la parte disponible de los ácidos nucleicos para el análisis aumenta, al menos, aproximadamente el doble en comparación a la parte accesible para el análisis si no se lleva a cabo el paso de puesta en contacto.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que también incluye la puesta en contacto de la muestra con una proteasa para degradar la proteína de la muestra y así hacer que los ácidos nucleicos estén más disponibles para el análisis.

9. Un equipo para mejorar la disponibilidad de uno o más compuestos de ácido nucleico de una muestra biológica entrecruzada con formaldehído, y el equipo incluye

(1) una alquilamina seleccionada a partir del grupo que incluye etilendiamina, etanolamina, y propilamina;

(2) un medio de sustracción de la alquilamina de la muestra biológica, en el que dicho medio de sustracción es una columna para la purificación de ácidos nucleicos; y

(3) un reactivo para la detección o la mejora de la detección de dichos compuestos de ácido nucleico.

10. El equipo de la reivindicación 9, que también incluye nucleótidos y/o una polimerasa termoestable.

11. Una mezcla de reacción que incluye la muestra biológica entrecruzada con formaldehído; y una cantidad suficiente de una alquilamina seleccionada a partir del grupo que incluye etilendiamina, etanolamina, y propilamina para liberar, al menos, una parte de un compuesto entrecruzado de ácidos nucleicos, en el que la cantidad de alquilamina es de entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 800 mM.