Vacuna para peces.

Una composición que comprende material biológico derivado de un cultivo de Photobacterium damselae caracterizado en que las células bacterianas han sido cultivadas en un medio de cultivo que contiene al menos dos veces la cantidad de hierro como en un caldo triptona soja estándar,

en donde dicho material biológico incluye: una proteína de membrana exterior de aproximadamente 97 kDa como se evalúa por SDS-PAGE bajo condiciones no-reductoras, que se involucran en la entrada en células huésped y/o una proteína extracelular de aproximadamente 55 kDa como se evalúa por SDS-PAGE bajo condiciones no-reductoras y en donde la proteína se expresa a niveles al menos dos veces del nivel de expresión como en un caldo triptona soja estándar.

Vacuna para peces.

La presente invención se relaciona con composiciones novedosas para ser utilizadas como vacunas y medicamentos para el tratamiento profiláctico de los peces para la infección por organismos bacterianos, y particularmente para la protección de los peces de una infección por bacterias tal como Photobacterium damselae subesp. piscicida.

La Photobacterium damselae subesp. piscicida, previamente la Photobacterium damsela subesp. piscicida se reclasificó, y previamente se reportó como Pasteurella piscicida y se reasignó a la familia vibrionaceae basándose en su homología de ARN ribosomal 16s de la subunidad pequeña (Gaulthier et al (1995) Int. J. Syst. Bacteriol. 45:139-144) . P. damselae causa graves enfermedades fatales, comúnmente llamadas pseudotuberculosis, en peces marinos de agua caliente que infectan los órganos y tejidos principales resultando en pseudotubérculos o lesiones características en la musculatura.

La apariencia de resistencia antibiótica acoplada con la observación de que los peces dejan de comer cuando se infectan, y de esta manera no consumen los alimentos medicados con antibióticos, se han sido sugerido como razones para la falla quimioterapéutica. Adicionalmente, existe un creciente cuerpo de evidencia para sugerir una fase de supervivencia intracelular durante la colonización del huésped (Barnes et al. (1999) Microbiology 145: 483-494) . Por consiguiente, la profilaxis a través de la inmunización parece ser el medio más conveniente para controlar esta enfermedad.

Diversas estrategias de vacunación han sido sugeridas, basándose en las bacterias muertas con formalina (bacterinas) , sin embargo, muchas de estas han fallado en producir una eficacia protectora reproducible (Romalde & Magarinos (1997) Fish Vaccinology, Karger, Basel, Switzerland, pp167-177) . Esto puede reflejar la baja respuesta de anticuerpo, del huésped al agente infeccioso (Arijo et al. (1997) Fish Shellfish Immunol. 8: 63-72) . Adicionalmente, poco se conoce de los antígenos protectores contenidos en estas preparaciones. Las preparaciones basadas en proteínas de membrana exterior restringidas de hierro (IROMPs) y bacterinas enriquecidas con productos extracelulares (ECP) han sido descritas (Magarinos et al. (1994) Bull. Eur. Ass. Fish Pathol.14:120-122) pero no han sido efectivas en situaciones comerciales.

Es un hecho establecido que la bacteria tiene una exigencia absoluta de hierro, y P. damselae no es la excepción. Se ha demostrado que bajo condiciones en las cuales el hierro es limitante, ya sea por no incluir suficiente en el medio, o por incluir agentes quelantes que reducen su disponibilidad, una variedad de sistemas de absorción de hierro, de alta afinidad se expresan (Magarinos et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 2990-2998) . Estos incluyen sideróforos portadores de hierro y proteínas de membrana exterior restringidas de hierro (IROMPS) . En otras especies bacterianas tales como Aeromonas salmonicida (Hirst & Ellis (1994) Fish Shellfish Immunol. 4:29-45) y Pasteurella haemolytica (UK patent specification 8805253 W Donachie, UK) las IROMPs han sido explotadas como antígenos protectores en vacunas exitosas. Sin embargo estas no parecen ser protectoras en la P. damselae, (Romalde & Magari-os (1997) Fish Vaccinology, Karger, Basel, Switzerland, pp167-177) . Esta falta de protección puede reflejar la estrategia para la infección por P. damselae. bajo limitación de hierro, P. damselae produce incremento de la actividad de la proteasa (Bakopolous (1997) J. Fish Dis. 20: 297-305) e incremento del polisacárido capsular. El polisacárido capsular incrementa la resistencia a la aniquilación del suero y previene la fagocitosis por macrófagos huésped (Arijo et al. (1998) Fish Shellfish Immunol. 8: 63-72.) . Es significante como la P. damselae no es resistente al ataque por fagocitos (Skarmeta et al. (1995) Dis. Aquat. Org. 23: 51-57) como resultado a su falta de respuesta adaptativa a la muerte por especies de oxígeno reactivo producidas durante el despliegue respiratorio de macrófagos (Barnes et al. (1999) Microbiology 145: 483-495) . Sin embargo, el incremento de la actividad proteolítica es capaz de liberar el hierro en la forma de hemo a través de la lisis de glóbulos rojos. El hemo se absorbe por la cápsula (Ana Do Vale, Pers. Comm.) y el hierro trasladado a través de la membrana por las IROMPs. De esta manera con el polisacárido capsular que actúa como el primer nivel de absorción de hierro de las IROMPs no se exponen durante el proceso de la enfermedad. Como los niveles de hierro incrementan, producción capsular disminuye, las IROMPs se apagan y la actividad proteolítica llega a ser indetectable (Bakopolous (1997) J. Fish Dis. 20: 297-305) . Esto dejaría P. damselae susceptible a los anticuerpos y ataque macrófago.

Sin embargo, en este punto el organismo es capaz de adherirse a (Yoshida et al. (1997) J. Fish Dis. 20: 77-80) y entrar a las células de peces no-fagocíticas (Magari-os et al. (1996) FEMS Microbiology Lett. 138: 29-34) de esta manera evitando el ataque por anticuerpos o fagocitos.

Es una finalidad de la presente invención proporcionar una vacuna para la protección de los peces de una infección por bacterias tal como Photobacterium damselae.

Es otra finalidad de la invención, proporcionar un proceso para la producción de dicha vacuna.

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De acuerdo con la presente invención se proporciona una vacuna y/o composición terapéutica que comprende material biológico derivado de un cultivo de Photobacterium damselae, caracterizado en que las células bacterianas han sido cultivadas en un medio de cultivo que contiene exceso de hierro sobre el que se necesita para el crecimiento normal de la bacteria.

Por "que contiene exceso de hierro" el medio de cultivo debería contener al menos dos veces la cantidad de hierro en el caldo triptona soja estándar (Oxoid) . Preferiblemente el medio de cultivo contiene entre 0.5 µM y 1mM de hierro. Más preferiblemente el medio contiene entre 10µM y 500µM de hierro.

Más preferiblemente el medio contiene entre 25µM y 500 µM de hierro. Usualmente una proteína de membrana exterior, que se puede involucrar en la entrada en las células huésped o invasina o la adhesión, se expresa en niveles más altos que aquellos en un medio de cultivo normal.

Por "expresado en niveles más altos que aquellos en medio de cultivo normal" la proteína o invasina o la adhesión se expresa a al menos dos veces los niveles de expresión normales. Los niveles de expresión normales son niveles de expresión en el caldo triptona soja estándar (Oxoid) .

Usualmente una proteína extracelular serológicamente relacionada con la invasina se expresa a niveles más altos que

en el cultivo normal. Usualmente un complejo de proteína extracelular de 55Kda y/o una proteína de membrana exterior de 97Kda se expresa a niveles más altos que aquellos en un medio de cultivo normal.

La invención también proporciona proteínas purificadas como se describe, para utilizar como vacunas o en la preparación de vacunas.

La invención también proporciona anticuerpos con las proteínas purificadas. La invención también proporciona un método para la producción en donde las células se cultivan en un medio de cultivo que contiene suficiente hierro de tal manera que las células se cargan con hierro al punto donde la absorción lineal del hierro a partir del medio de cultivo no ocurre más.

Preferiblemente las células se saturan con hierro. Preferiblemente el hierro se suministra al medio en la forma de una sal férrica. Preferiblemente las bacterias ha sido inactivada después del cultivo. Preferiblemente la inactivación se realiza utilizando una composición de formaldehído. La invención además proporciona células o membranas celulares o productos celulares de la bacteria cultivada. El material biológico preferiblemente se proporciona en un portador fisiológicamente aceptable. La composición de la invención preferiblemente incluye un adyuvante apropiado para mejorar la respuesta

inmunológica.

De esta manera se proporciona, una composición de una vacuna para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de los peces para la infección por bacterias, particularmente por el organismo Photobacterium damelae subesp. piscicida. La composición comprende los componentes producidos por un cultivo del organismo. El cultivo se trata para matar el

1. Una composición que comprende material biológico derivado de un cultivo de Photobacterium damselae caracterizado en que las células bacterianas han sido cultivadas en un medio de cultivo que contiene al menos dos veces la cantidad de hierro como en un caldo triptona soja estándar, en donde dicho material biológico incluye: una proteína de membrana exterior de aproximadamente 97kDa como se evalúa por SDS-PAGE bajo condiciones noreductoras, que se involucran en la entrada en células huésped y/o una proteína extracelular de aproximadamente 55kDa como se evalúa por SDS-PAGE bajo condiciones no-reductoras y en donde la proteína se expresa a niveles al menos dos veces del nivel de expresión como en un caldo triptona soja estándar.

2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 en donde la proteína de membrana exterior es la invasina y/o la proteína extracelular serológicamente se relaciona con la invasina.

3. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 en donde la proteína de membrana exterior es la adesina.

4. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 en donde la proteína de membrana exterior es una proteína de membrana exterior de 97kDa.

5. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 en donde la proteína extracelular es una proteína extracelular de 55kDa.

6. Una composición de acuerdo con la reivindicación 5 en donde dicho material biológico que comprende dicha proteína de membrana de aproximadamente 97kDa y dicha proteína extracelular de aproximadamente 55 kDa es producida por cultivo de Photobacterium clamselae MT1415 depositado bajo el número de acceso 41062 en NCIMB en Aberdeen, Reino Unido, y en donde la proteína extracelular de 55 kDa es un complejo proteínico extracelular que comprende: (i) una proteína bloqueada en N-terminal (ii) proteína con la secuencia AMKRHGLDNYRGYSLGNWVC (iii) una proteína con la secuencia NVVLHGDNFDSTXVXVKAV.

7. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 en donde dicha composición comprende una proteína de membrana exterior de 97kDa y una proteína extracelular de 55kDa.

8. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 en donde dicha composición consiste de una proteína de membrana exterior de 97kDa y una proteína extracelular de 55kDa.

9. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, 7 y 8 en donde dicha composición comprende los componentes producidos por cultivo de Photobacterium damselae MT1415 depositado bajo el No. de acceso 41062 en NCIMB en Aberdeen, UK.

10. Uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en la fabricación de una vacuna para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de los peces infectados por el organismo Photobacterium damselae.

11. Uso de una composición de acuerdo con la reivindicación 10 en la fabricación de una vacuna para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de los peces infectados por la subespecie piscicida del organismo Photobacterium damselae.

12. Uso de una composición de acuerdo con la reivindicación 10 u 11 para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de pseudotuberculosis en los peces.

13. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-12 en donde los peces son peces marinos de agua caliente.

14. Uso de acuerdo con la reivindicación 13 en donde las especies de peces, se seleccionan de la trucha arco iris, besugo de mar o róbalo de mar.

15. Proceso para preparar una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para utilizar en una vacuna para peces que comprende: (i) cultivo de células de Photobacteria damselae en un medio de cultivo que contiene al menos dos veces la cantidad de hierro como en el caldo triptona soja estándar y (ii) aislamiento de una proteína de membrana exterior de Photobacteria damselae que es aproximadamente 97kDa como se evalúa por SDS-PAGE bajo condiciones no-reductoras que se involucra en la entrada en células huésped y/o una proteína extracelular del Photobacterium damselae que es aproximadamente 55kDa como se evalúa por SDS-PAGE bajo condiciones noreductoras.

16. Proceso de acuerdo con la reivindicación 15 en donde en la etapa (ii) la proteína de membrana exterior de 97kDa y/o una proteína extracelular de 55kDa se aísla en la preparación de una vacuna para peces.

17. Proceso de acuerdo con la reivindicación 15 o la reivindicación 16 en donde se adiciona un adyuvante apropiado para mejorar la respuesta inmunológica.

18. Anticuerpo construido contra una proteína de membrana exterior del Photobacteria damselae que es aproximadamente 97kDa como se evalúa por SDS-PAGE bajo condiciones no-reductoras o construido contra una proteína extracelular del Photobacterium damselae que es aproximadamente 55kDa como se evalúa por SDS-PAGE bajo condiciones no-reductoras de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

19. Composición de la vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para el uso profiláctico y/o terapéutico en peces infectados por la bacteria.

20. Composición de la vacuna de acuerdo con la reivindicación 19 que adicionalmente comprende un adyuvante apropiado para mejorar la respuesta inmunológica.