POLIANIÓN PARA LA AMPLIFICACIÓN MEJORADA DE ÁCIDOS NUCLEICOS.

Polianión para la amplificación mejorada de ácidos nucleicos La presente invención se refiere al ámbito de las reacciones de extensión con cebador catalizadas con polimerasa dependientes de molde, por ejemplo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Más precisamente, la presente invención proporciona un método nuevo para realizar una PCR hot start caracterizada porque se evita la amplificación inespecífica de dímeros del cebador añadiendo un polianión definido antes de la reacción de amplificación. Antecedentes de la invención Un problema importante de la amplificación de ácido nucleico y más especialmente de la PCR es la generación de productos de amplificación inespecíficos. En muchos casos, esto se debe a un cebado inespecífico de oligonucleótidos y al posterior acontecimiento de extensión con cebador antes del procedimiento de termociclado propiamente dicho, ya que las polimerasas de DNA termoestables son también moderadamente activas a temperatura ambiente. Por ejemplo, se observan a menudo productos de amplificación debidos a la dimerización del cebador que puede ocurrir fortuitamente y posterior extensión de los dímeros. Con el fin de superar este problema, es bien conocida en la técnica la realización de una PCR llamada hot start, en la que se separa de la mezcla reaccionante un componente esencial para la reacción de amplificación o bien se mantiene este componente en estado inactivo hasta que la temperatura de la mezcla reaccionante se eleva una primera vez. Dado que la polimerasa no puede funcionar en estas condiciones, no se produce elongación del cebador durante el período en el que los cebadores se pueden unir de modo no específico. Con el fin de conseguir este efecto, se han aplicado diversos métodos: a) Separación física de la polimerasa de DNA La separación física puede conseguirse por ejemplo con una barrera de cera sólida, que separa el compartimento que contiene la polimerasa de DNA del compartimento que contiene el grueso de reactivos restantes. Durante el primer paso de calentamiento se funde la cera automáticamente y se mezclan los compartimentos líquidos (Chou, Q. y col., Nucleic Acids Res. 20, 1717-23, 1992, US-5,411,876). Como alternativa se inmoviliza por afinidad la polimerasa de DNA sobre un soporte sólido antes de la reacción de amplificación y solamente se libera a la mezcla de reacción cuando el calor provoca dicha liberación (Nilsson, J. y col., Biotechniques 22, 744-51, 1997). Sin embargo, ambos métodos requieren mucha dedicación de tiempo (personal) y son muy laboriosos de ejecución. b) Modificación química de la polimerasa de DNA Para este tipo de PCR hot start, la polimerasa de DNA se inactiva de modo reversible como resultado de una modificación química. Más en concreto, se introducen grupos de bloqueo, lábiles al calor, en la polimerasa de DNA Taq, con lo cual se inactiva la enzima a temperatura ambiente (US 5,773,258). Estos grupos de bloqueo se eliminan a temperatura elevada durante el paso previo de la PCR, con lo cual se activa la enzima. Esta modificación lábil al calor se obtiene por ejemplo por condensación del anhídrido citracónico o del anhídrido aconítico con los restos lisina de la enzima (US 5,677,152). Las enzimas que llevan este tipo de modificaciones ya son productos comerciales, por ejemplo el Amplitaq Gold (Moretti, T. y col., Biotechniques 25, 716-22, 1998) o la polimerasa de DNA FastStart (Roche Molecular Biochemicals). Sin embargo, la introducción de los grupos de bloqueo se efectúa mediante una reacción química que puede tener lugar arbitrariamente en cualquiera de los restos lisina estéricamente disponibles. Por consiguiente, la reproducibilidad y la calidad de las preparaciones de enzimas modificadas químicamente pueden variar y es muy difícil de controlar. c) Modificación recombinante de la polimerasa de DNA ES 2 367 469 T3 Se han obtenido por ingeniería genética mutantes de la polimerasa Taq sensibles al frío. Estas mutantes difieren de la enzima de tipo salvaje por carecer del extremo N (US 6,241,557). A diferencia de la polimerasa Taq recombinante de tipo nativo o salvaje, estas mutantes son completamente inactivas por debajo de 35ºC, de modo que pueden utilizarse en algunos casos para realizar una PCR hot start. Sin embargo, la forma mutante truncada por el extremo N y sensible al frío requiere condiciones de tampón salino bajo, se procesa peor que la enzima de tipo salvaje y por ello solo puede utilizarse para la amplificación de ácidos nucleicos diana cortos. Además, debido a que la forma truncada carece de actividad de exonucleasa 5-3, no puede utilizarse para los ensayos de PCR en tiempo real, basados en el formado de detección TaqMan. d) Inhibición de la polimerasa de DNA con aditivos de ácido nucleico Se ha demostrado que la extensión de cebadores fusionados de modo no específico puede inhibirse con la adición de fragmentos cortos de DNA de doble hebra (Kainz, P. y col., Biotechniques 28, 278-82, 2000). En este caso, la extensión del cebador se inhibe a temperaturas inferiores al punto de fusión del fragmento corto de DNA de doble hebra, pero de modo independiente de la secuencia del DNA competidor propiamente dicho. Sin embargo no se sabe en qué medida influye el exceso de DNA competidor en el rendimiento de la reacción de amplificación de ácido nucleico. 2 Como alternativa pueden utilizarse aptámeros de oligonucleótido que tengan una secuencia específica que se traduce en una estructura secundaria definida. Estos aptámeros pueden seleccionar empleando la tecnología SELEX para conseguir una afinidad muy elevada con respecto a la polimerasa de DNA (US 5,693,502, Lin, Y. y Jayasena, S.D., J. Mol. Biol. 271, 100-11, 1997). La presencia de estos aptámeros dentro de la mezcla de amplificación antes del proceso de termociclado propiamente dicho se traduce a su vez en una gran afinidad de fijación sobre la polimerasa de DNA y por consiguiente en la inhibición lábil al calor de su actividad (US 6,020,130). Sin embargo, debido al proceso de selección, todos los aptámeros disponibles solo podrán utilizarse en combinación con una polimerasa concreta de DNA. e) Anticuerpos de DNA Taq Una estrategia alternativa para conseguir una inhibición lábil al calor de la polimerasa de DNA Taq consiste en la adición de anticuerpos monoclonales dirigidos contra la enzima purificada (Kellogg, D.E. y col., Biotechniques 16, 1134-7, 1994; Sharkey, D.J. y col., Biotechnology (N Y) 12, 506-9, 1994). Al igual que los aptámeros de oligonucleótidos, el anticuerpo se fija sobre la polimerasa de DNA Taq con una gran afinidad a temperatura ambientes en modo inhibidor (US 5,338,671). El complejo se destruye en el paso de precalentamiento previo al proceso de termociclado propiamente dicho. Esto una prolongación que requiere mucha dedicación de tiempo en su conjunto, en especial si se aplican métodos de termociclado rápido (WO 97/46706). En la patente US 5,985,619 se describe una forma específica de ejecución para realizar la PCR empleando un anticuerpo hot start, en ella, aparte de la polimerasa Taq se añade p.ej. la exonucleasa III de la E. coli como suplemento de la mezcla de amplificación con el fin de digerir los compuestos intermedios de dímeros de cebador inespecíficos. Tal como se ha mencionado antes, la exonucleasa III reconoce el DNA de doble hebra como sustrato, al igual que por ejemplo los híbridos diana/cebador o de diana/producto de extensión de cebador. La digestión tiene lugar mediante la rotura del enlace de fosfodiéster del extremo 5 del resto desoxinucleótido terminado en 3. Este tipo de exonucleasa es activa a temperatura ambiente, por lo tanto se digerirán todos los cebadores y los productos de extensión de cebador fusionados de modo inespecífico. De aquí derivan algunas formas de ejecución, en las que se logra una especificidad incluso mayor de la reacción de amplificación. Es más, la digestión de los cebadores inespecíficos dependiente de la duración del período de preincubación puede conducirse a una disminución sustancial e incontrolada de la concentración de cebador, que a su vez puede afectar a la reacción de amplificación propiamente dicha. f) Uso de cebadores modificados solos o en combinación con exonucleasas En los documentos EP 0 799 888 y GB 2293238 se describe la adición de oligonucleótidos bloqueados en el extremo 3 a las reacciones PCR. Debido al bloqueo del extremo 3, estos oligonucleótidos no pueden actuar como cebadores. Los oligonucleótidos bloqueados se diseñan para competir/interaccionar con los cebadores de la PCR, lo cual se traduce en una reducción de los productos no específicos. Otra alternativa consiste en el uso de cebadores oligonucleótido fosforotioato en combinación con una exonucleasa III en las mezclas de las reacciones PCR (EP 0 744 470). En este caso, una exonucleasa 3, que normalmente... [Seguir leyendo]

[Xx - (CH2)m - fosfato - Yy]n caracterizado porque 3 m 6, 30 n 60 cada x e y con independencia entre sí son el número 0 ó 1, cada X e Y con independencia entre sí son una entidad elegida entre el grupo formado por restos nucleósido, restos (desoxi)nucleósido y análogos de nucleósido o de (desoxi)nucleósido, con la condición de que cada uno de m, x e y se elija con independencia para cada unidad [Xx - (CH2)m - fosfato - Yy] y además con la condición de que el X terminal pueda ser también un grupo -OH o un grupo fosfato y además con la condición de que el Y terminal pueda ser también -H o un grupo (CH2)m - OH. 2. Una composición que contiene - un compuesto según la reivindicación 1, - una polimerasa de DNA, - y desoxi-oligonucleótidos. 3. Una composición según la reivindicación 2 que contiene además un oligonucleótido 5-8-ámero aleatorio, caracterizada porque dicho oligonucleótido contiene una modificación con un resto orgánico hidrófobo. 4. Un kit que contiene: - un compuesto o composición según las reivindicaciones 2-3, - una polimerasa de DNA, - y desoxi-oligonucleótidos. 5. Un kit según la reivindicación 4, que contiene además un oligonucleótido 5-8-ámero aleatorio, caracterizado porque dicho oligonucleótido contiene una modificación con un resto orgánico hidrófobo. 6. Un método que consta de los pasos siguientes: ES 2 367 469 T3 - aportar una muestra que contenga un ácido nucleico, - proporcionar una composición según la reivindicación 3, - proporcionar por lo menos un primer oligonucleótido cebador, - efectuar una reacción de extensión de cebador catalizada por una polimerasa. 7. Un método según la reivindicación 6, en el que dicho ácido nucleico es un RNA y dicha polimerasa de DNA tiene actividad de transcriptasa inversa. 8. Un método según las reivindicaciones 6-7, en el que dicha polimerasa es una polimerasa termoestable y se hace el seguimiento de la reacción en tiempo real. 9. Método según la reivindicación 8, caracterizado porque el producto que se genera en dicha amplificación se somete a un análisis de curva de fusión. 17 ES 2 367 469 T3 18 ES 2 367 469 T3 19 ES 2 367 469 T3 ES 2 367 469 T3 21 ES 2 367 469 T3 22