SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS Y PROTEINAS DE GENES SERRATE DE VERTEBRADOS Y METODOS BASADOS EN LAS MISMAS.

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A LAS SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS DE GENES SERRATE DE VERTEBRADOS,

A LAS SECUENCIAS DE AMINOACIDOS DE LAS PROTEINAS CODIFICADAS POR LOS MISMOS, ASI COMO A DERIVADOS (P. EJ., FRAGMENTOS) Y ANALOGOS DE LOS MISMOS. EN UNA PRESENTACION ESPECIFICA, LA PROTEINA SERRATE ES UNA PROTEINA HUMANA. LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A FRAGMENTOS (Y DERIVADOS Y ANALOGOS DE LOS MISMOS) DE UNA SERRATE DE VERTEBRADOS QUE COMPRENDA UNO O MAS DOMINIOS DE LA PROTEINA SERRATE, INCLUIDOS, AUNQUE NO LIMITADOS A, EL DOMINIO INTRACELULAR, DOMINIO EXTRACELULAR, DOMINIO DSL, DOMINIO RICO EN CISTEINA, REGION TRANSMEMBRANA, REGION ASOCIADA A MEMBRANA, O UNA O MAS DE LAS REPETICIONES SIMILARES A EGF DE UNA PROTEINA SERRATE, O CUALQUIER COMBINACION DE LOS ANTERIORES. SE PROPORCIONAN ADICIONALMENTE LOS ANTICUERPOS CONTRA SERRATE DE VERTEBRADOS, SUS DERIVADOS Y ANALOGOS. TAMBIEN SE PROPORCIONAN METODOS PARA LA PRODUCCION DE PROTEINAS SERRATE DE VERTEBRADOS, DERIVADOS Y ANALOGOS, P. EJ., POR MEDIOS RECOMBINANTES. SE PROPORCIONAN METODOS TERAPEUTICOS Y DE DIAGNOSTICO Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS. COMO EJEMPLOS ESPECIFICOS, SE PROPORCIONAN LOS GENES SERRATE AISLADOS DE POLLO, RATON, XENOPUS Y SER HUMANO

Secuencias de nucleótidos y proteínas de genes Serrate de vertebrados y métodos basados en las mismas.

Esta invención se realizó en parte con ayuda del gobierno gracias a las subvenciones de número GM 29093 y NS 26084 concedidas por el Department of Health and Human Services. El gobierno tiene determinados derechos en la invención.

1. Introducción

La presente invención se refiere a los genes Serrate de vertebrado y sus productos proteicos codificados, así como a los derivados de los mismos. También se da a conocer la producción de proteínas Serrate de vertebrado, derivados y anticuerpos. La invención además se refiere a composiciones terapéuticas.

2. Antecedentes de la invención

Los análisis genéticos en Drosophila han sido muy útiles para diseccionar la complejidad de las vías de desarrollo y para identificar los locus que interaccionan. Sin embargo, la comprensión precisa de la naturaleza de los procesos que subyacen a las interacciones genéticas requiere un conocimiento de los productos proteicos de los genes en cuestión.

Las pruebas embriológicas, genéticas y moleculares indican que las etapas tempranas de la diferenciación ectodérmica en Drosophila dependen de las interacciones celulares (Doe y Goodman, 1985, Dev. Biol. 111: 206-219; Technau y Campos-Ortega, 1986, Dev. Biol. 195: 445-454; Vässin et al., 1985, J. Neurogenet. 2: 291-308; de la Concha et al., 1988, Genetics 118: 499-508; Xu et al., 1990, Genes Dev. 4: 464-475; Artavanis-Tsakonas, 1988, Trends Genet. 4:95-100). Los análisis con mutaciones han puesto de manifiesto un grupo pequeño de genes que actúan en el cigoto, el denominado locus neurógeno, que alteran la elección que las células ectodérmicas hacen entre las vías epidérmica y neural (Poulson,1937, Proc. Natl. Acad. Sci., 23: 133-137; Lehmann et al., 1983, Wilhelm Roux's Arch. Dev. Biol. 192: 62-74; Jürgens et al., 1984, Wilhelm Roux's Arch. Dev. Biol. 193: 283-295; Wieschaus et al., 1984, Wilhelm Roux's Arch. Dev. Biol. 193: 296-307; Nüsslein-Volhard et al., 1984, Wilhelm Roux's Arch. Dev. Biol. 193: 267-282). Las mutaciones nulas en cualquiera de los locus neurógenos cigóticos -Notch (N), Delta (D1), mastermind (mam), Enhancer of Split (E(spl), neuralized (neu) y big brain (bib)- dan lugar a la hipertrofia del sistema nervioso a expensas de las estructuras epidérmicas ventrales y laterales. Este efecto se debe al enrutamiento erróneo de las células precursoras epidérmicas en una vía neuronal, e implica que se necesita que los genes neurógenos funcionen para desviar las células dentro de la región neurógena de un destino neuronal a un destino epitelial. Se ha identificado que Serrate es una unidad genética capaz de interaccionar con el locus Notch (Xu et al., 1990, Genes Dev. 4: 464-475). Estas observaciones genéticas y de desarrollo han conducido a la hipótesis de que los productos proteicos del locus neurógeno funcionan como componentes de un mecanismo de interacción celular necesario para el desarrollo epidérmico adecuado (Artavanis-Tsakonas, S., 1988, Trends Genet. 4:95-100).

Los análisis mutacionales también revelan que la acción de los genes neurógenos es pleótropo y no se limita únicamente a la embriogénesis. Por ejemplo, la formación del omatidio, de los pelos y de las alas, que se sabe que también depende de las interacciones celulares, está afectada por mutaciones neurógenas (Morgan et al., 1925, Bibliogr. Genet. 2: 1-226; Welshons, 1956, Dros. Inf. Serv. 30: 157-158; Preiss et al., 1988, EMBO J. 7:3917-3927, Shellenbarger y Mohler, 1978, Dev. Biol. 62: 432-446; Technau y Campos-Ortega, 1986, Wilhelm Roux's Dev. Biol. 195: 445-454; Tomlison y Ready, 1987, Dev. Biol. 120: 366-376; Cagan y Ready, 1989, Genes Dev. 3: 1099-1112).

Los análisis de secuencias (Wharton et al., 1985, Cell 43: 567-581; Kidd y Young, 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 3094-3108; Vässin et al., 1987, EMBO J. 6: 3431-3440; Kopczynsky et al., 1988, Genes Dev. 2: 1723-1735) han demostrado que dos de los locus neurógenos, Notch y Delta, codifican proteínas transmembranarias que atraviesan la membrana una única vez. El gen Notch codifica una proteína de 300 kDa (utilizamos "Notch" para denominar esta proteína) con un gran dominio extracelular en el extremo amino que incluye 36 repeticiones en tándem similares al factor de crecimiento epidérmico (FCE) seguidas de otras tres repeticiones ricas en cisteína, designadas repeticiones Noch/lin-12 (Wharton et al., 1985, Cell 43: 567-581; Kidd y Young, 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 3094-3108; Yochem et al., 1988, Nature 335: 547-550). Delta codifica una proteína de ~100 kDa (utilizamos "Delta" para designar a DLZM, el producto proteico de los transcritos cigótico y materno predominantes; Kopczynski et al., 1988, Genes. Dev. 2: 1723-1735) que tiene nueve repeticiones similares al FCE dentro de su dominio extracelular (Vässin et al., 1987, EMBO J, 6: 3431-3440; Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2: 1723-1735). Los estudios moleculares han conducido a sugerir que Notch y Delta constituyen elementos de un mecanismo de comunicación celular implicado en las decisiones de desarrollo temprano (Fehon et al., 1990, Cell, 61: 523-534) que interaccionan bioquímicamente.

El motivo de tipo FCE se ha encontrado en numerosas proteínas, incluidas las de la cascada de coagulación sanguínea (Furie y Furie, 1988, Cell 53: 505-518). En particular, se ha encontrado este motivo en proteínas extracelulares tales como los factores IX y X de la coagulación sanguínea (Rees et al., 1988, EMBO J. 7: 2053-2061; Furie y Furie, 1988, Cell 53: 505-518), en otros genes de Drosophila (Knust et al., 1987 EMBO J. 761-766; Rothberg et al., 1988, Cell 55: 1047-1059) y en algunas proteínas receptoras de la superficie celular, tales como la trombomodulina (Suzuki et al., 1987, EMBO J. 6: 1891-1897) y del receptor de las LDL (Sudhof et al., 1985, Science 228: 815-822). Se ha cartografiado un sitio de unión a proteínas en el dominio de repeticiones del FCE en la trombomodulina y la urocinasa (Kurosawa et al., 1988, J. Biol. Chem. 263: 5993-5996; Appella et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 4437-4440). Se ha clonado y caracterizado el gen Serrate de Drosophila (publicación de patente internacional PCT WO 93/12141 registrada el 24 de junio de 1993). Sin embargo, antes de la presente invención, a pesar de los intentos de conseguir lo mismo, no se disponía de ningún gen Serrate en los vertebrados.

La citación de las referencias anteriores no será interpretada como una admisión de que tales referencias son una técnica anterior para la presente invención.

3. Compendio de la invención

La presente invención se refiere a las secuencias nucleotídicas de genes Serrate de vertebrado (Serrate humanos y genes relacionados en otras especies) y las secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas, así como derivados (por ejemplo, fragmentos) de las mismas. También se dan a conocer ácidos nucleicos hibridables o complementarios a las secuencias nucleotídicas precedentes. En una realización específica, la proteína Serrate es una proteína humana.

La invención se refiere a los derivados de la Serrate de vertebrado de la invención que son funcionalmente activos, es decir, pueden mostrar una o más de las actividades funcionales conocidas asociadas a una proteína Serrate de longitud completa (de tipo salvaje). Tales actividades funcionales incluyen, pero sin limitarse a ellas, antigenicidad [capacidad de unirse (o competir con Serrate por la unión) a un anticuerpo anti-Serrate], inmunogenia (capacidad para generar anticuerpos que se unen a Serrate), capacidad de unirse (o competir con Serrate por la unión) a Notch u otras proteínas toporrítmicas o fragmentos de las mismas ("adherencia"), capacidad de unirse (o competir con Serrate por la unión) a un receptor para Serrate. Las "proteínas toporrítmicas" tal y como se utilizan en la presente memoria, se refieren a los productos proteicos de Notch, Delta, Serrate, Enhancer of split y Deltex así como otros miembros de esta familia de genes interaccionantes que se pueden identificar,...

1. Proteína Serrate purificada de vertebrado que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un primer ácido nucleico, hibridándose dicho primer ácido nucleico en condiciones de hibridación a un segundo ácido nucleico o su complemento, consistiendo dicho segundo ácido nucleico en la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos humana representada en las figuras 1A a 1G (SEQ ID n.º 1), la secuencia de nucleótidos de pollo representada en las figuras 3A a 3B (SEQ ID n.º 5), la secuencia de nucleótidos de ratón de SEQ ID n.º 13 y la secuencia de nucleótidos de ratón de SEQ ID n.º 15, siendo dichas condiciones de hibridación unas condiciones muy rigurosas que comprenden la hibridación en un tampón que consiste en SSC a 6X, Tris-HCl a 50 mM (pH 7,5), EDTA a 1 mM, PVP al 0,02%, Ficoll al 0,02%, SAB al 0,02% y ADN de esperma de salmón desnaturalizado a 100 µg/ml, durante 48 horas a 65ºC, el lavado en una disolución que consiste en SSC a 2X, PVP al 0,01%, Ficoll al 0,01% y SAB al 0,01%, durante 1 hora a 37ºC, y el lavado en una disolución que consiste en SSC a 0,1 X, durante 45 minutos a 50ºC, y en la que dicha proteína es capaz de unirse a una proteína Notch.

2. Proteína según la reivindicación 1, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos representada en las figuras 1A a 1G (SEQ ID n.º 2), la secuencia de aminoácidos representada en las figuras 4A a 4B (SEQ ID n.º 6), la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n.º 14 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n.º 16.

3. Proteína según la reivindicación 1, que es una proteína de mamífero.

4. Proteína según la reivindicación 1, que es una proteína de humano.

5. Proteína según la reivindicación 1, cuyo segundo ácido nucleico es la secuencia de nucleótidos humana representada en las figuras 1A a 1G (SEQ ID n.º 1).

6. Proteína según la reivindicación 4, comprendiendo la proteína de humano la secuencia de aminoácidos representada en las figuras 1A a 1G (SEQ ID n.º 2).

7. Proteína según la reivindicación 4, comprendiendo la proteína de humano la secuencia de aminoácidos representada en las figuras 2A a 2G (SEQ ID n.º 4).

8. Proteína según la reivindicación 4, consistiendo la proteína de humano en la secuencia de aminoácidos representada en las figuras 1A a 1G (SEQ ID n.º 2).

9. Proteína según la reivindicación 4, consistiendo la proteína de humano en la secuencia de aminoácidos representada en las figuras 2A a 2G (SEQ ID n.º 4).

10. Proteína según la reivindicación 1, cuyo segundo ácido nucleico consiste en la secuencia de nucleótidos de humano del plásmido pBS39, estando depositado dicho plásmido en la ATCC y habiéndosele asignado el número de acceso 97068.

11. Proteína según la reivindicación 4, que comprende la secuencia de aminoácidos de Serrate codificada por el plásmido pBS15, estando depositado dicho plásmido en la ATCC y habiéndosele asignado el número de acceso 97459.

12. Proteína según la reivindicación 4, que comprende la secuencia de aminoácidos de Serrate codificada por el plásmido pBS3-2, estando depositado dicho plásmido en la ATCC y habiéndosele asignado el número de acceso 97460.

13. Fragmento purificado de la proteína Serrate de vertebrado según una cualquiera de las reivindicaciones 5, 6, 8 y 10, consistiendo dicho fragmento en al menos 10 aminoácidos y siendo dicho fragmento capaz de unirse a una proteína Notch.

14. Fragmento según la reivindicación 13, en el que el fragmento consiste en al menos 20 aminoácidos.

15. Fragmento según la reivindicación 14, en el que la proteína Serrate de vertebrado es la proteína según la reivindicación 6.

16. Fragmento según la reivindicación 13 ó 14, que consiste en el dominio extracelular o el dominio DSL.

17. Molécula que comprende el fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16.

18. Proteína purificada que comprende el fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16.

19. Fragmento según la reivindicación 13, careciendo dicho fragmento del dominio transmembranario y del dominio intracelular de la proteína.

20. Fragmento según la reivindicación 13, que carece de las repeticiones de tipo factor de crecimiento epidérmico de la proteína.

21. Proteína quimérica purificada que comprende la proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 8 y 10, o el fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 y 19 a 20, fusionada mediante un enlace covalente a una secuencia de aminoácidos de una segunda proteína, en la que la segunda proteína no es una proteína Serrate de vertebrado.

22. Proteína quimérica según la reivindicación 21, cuyo fragmento es un fragmento de una proteína Serrate humana.

23. Ácido nucleico aislado que codifica una proteína Serrate de vertebrado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 8, 10, un fragmento de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 y 19 a 20 o una proteína quimérica según la reivindicación 21 o 22.

24. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 23, que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos de humano representada en las figuras 1A a 1G (SEQ ID n.º 1), la secuencia de nucleótidos de pollo representada en las figuras 3A a 3B (SEQ ID n.º 5), la secuencia de nucleótidos de ratón de SEQ ID n.º 13 y la secuencia de nucleótidos de ratón de SEQ ID n.º 15.

25. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 23, que consiste en la secuencia de nucleótidos de humano en el plásmido pBS39, estando dicho plásmido depositado en la ATCC y habiéndosele asignado el número de acceso 97068.

26. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 23, que comprende la secuencia de nucleótidos de Serrate de humano contenida en el plásmido pBS39, estando dicho plásmido depositado en la ATCC y habiéndosele asignado el número de acceso 97068.

27. Vector de expresión de ácido nucleico, que comprende el ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26.

28. Célula recombinante transformada con el vector de ácido nucleico según la reivindicación 27.

29. Método para producir una proteína Serrate de vertebrado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 8, 10, un fragmento de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 y 19 a 20 o una proteína quimérica según la reivindicación 21 o 22, que comprende cultivar la célula recombinante según la reivindicación 28 de tal forma que la proteína, fragmento o proteína quimérica sea expresada por la célula, y recuperar la proteína, fragmento o proteína quimérica expresada.

30. Anticuerpo purificado que se une a la proteína Serrate de vertebrado según la reivindicación 8, o que se une al fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 y 19 a 20, si depende de la reivindicación 8.

31. Anticuerpo según la reivindicación 30, que es monoclonal.

32. Anticuerpo según la reivindicación 30, que es policlonal.

33. Método para producir un anticuerpo según la reivindicación 30, que comprende inmunizar un animal hospedador con una proteína según la reivindicación 8 o un fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, si es dependiente de la reivindicación 8, y seleccionar un anticuerpo que se une a dicha proteína o fragmento.

34. Fragmento del anticuerpo de la reivindicación 30, uniéndose dicho fragmento a la proteína Serrate de vertebrado.

35. Anticuerpo o fragmento del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32 y 34, que no se une a una proteína Serrate de Drosophila.

36. Anticuerpo purificado o fragmento de anticuerpo que se une a la proteína Serrate de humano según la reivindicación 9, siendo dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico contra dicha proteína Serrate de humano.

37. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo según la reivindicación 36, uniéndose dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo al dominio extracelular o DSL de dicha proteína Serrate de humano.

38. Derivado de una proteína Serrate de vertebrado según la reivindicación 8, o de un fragmento de una proteína Serrate de vertebrado según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 y 19 a 20, cuyo derivado tiene la secuencia de aminoácidos de dicha proteína, o fragmento, Serrate de vertebrado, en la que se sustituye un resto de aminoácido dentro de la secuencia por otro aminoácido de una polaridad parecida que actúa como un equivalente funcional que da lugar a una modificación silenciosa, siendo dicho derivado capaz de unirse a una proteína Notch.

39. Anticuerpo según la reivindicación 30, que no se une a una proteína Serrate de Drosophila.

40. Anticuerpo según la reivindicación 30 o 31, siendo dicho anticuerpo un anticuerpo humano o quimérico.

41. Anticuerpo según la reivindicación 36, siendo dicho anticuerpo un anticuerpo de humano o quimérico.

42. Oligonucleótido aislado que es antisentido y complementario a una porción de al menos 10 nucleótidos de SEQ ID n.º 1.

43. Método para inhibir la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína Serrate de vertebrado en una célula, que comprende dotar a la célula in vitro de una cantidad del oligonucleótido según la reivindicación 42 eficaz para inhibir la expresión de dicho ácido nucleico, estando dicha proteína Serrate de vertebrado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 8 y 10.

44. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, 34, 35, 39 y 40, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

45. Composición según la reivindicación 44, para utilizarla como un medicamento.

46. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 36, 37 y 41, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

47. Composición según la reivindicación 46, para utilizarla como un medicamento.