Microdispositivo de separación y extracción selectiva y no invasiva de partículas en suspensiones polidispersas,

procedimiento de fabricación y sus aplicaciones.

La presente invención describe un microdispositivo de separación y extracción no invasiva y selectiva de partículas en suspensiones polidispersas mediante el uso estratégico de ultrasonidos, flujo laminar y efectos de onda estacionaria establecidos en un canal realizado en microtecnología en un chip. Este dispositivo tipo lamda cuartos modificado permite canalizar y separar las partículas en un flujo interior del canal del sustrato sin tocar las paredes del dispositivo, por lo que son menos dañadas. Este microdispositivo puede utilizarse en el campo de la biomedicina y/o biotecnología para la separación y concentración de células, preferentemente humanas, útiles para procedimientos de investigación y médicos de diagnóstico y tratamiento

Microdispositivo de separación y extracción selectiva y no invasiva de partículas en suspensiones polidispersas, procedimiento de fabricación y sus aplicaciones.

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a un dispositivo en el que se combinan microtecnología y ondas ultrasónicas como método no invasivo para realizar separación selectiva y extracción de partículas en suspensiones polidispersas, conteniendo microelementos con diferentes características físicas (tamaño, densidad o compresiblidad) y para cualquier nivel de concentración, siendo sus aplicaciones principales en el campo biomédico y biotecnológico.

Estado de la técnica

Durante la última década se han propuesto diversas técnicas para manipulación o separación de partículas en suspensión en diversos campos de aplicación tecnológica, entre los cuales se destaca la biotecnología y la medicina. La separación de partículas es de especial interés en la actualidad médica para aplicaciones relacionadas con donaciones de sangre, procesos de diálisis y análisis de laboratorio, así como reciclado y/o lavado de sangre tras operaciones quirúrgicas.

La aplicación de ondas acústicas estacionarias sobre suspensiones produce efectos de conducción de las partículas hacia determinadas zonas de equilibrio relacionadas con la distribución de nodos y máximos de presión acústica que establece la onda estacionaria generada en el medio. Sobre cada partícula se ejerce una fuerza de radiación primaria inducida acústicamente, cuya magnitud varía proporcionalmente a la frecuencia de operación. El camino que debe recorrer una partícula sometida a esta fuerza para alcanzar la posición de equilibrio acústico más próxima es menor cuanto menor sea la distancia entre nodos y máximos de presión acústica. Estos están definidos por la longitud de onda, que es inversamente proporcional a la frecuencia acústica. Por ello, es más sencillo desde el punto de vista teórico concentrar partículas a frecuencias más elevadas.

Este mecanismo de conducción no invasiva es ampliamente conocido en la disciplina de los ultrasonidos y ha dado lugar durante la última década al desarrollo de un número de intentos para manipulación y/o separación de partículas. Se han propuesto diversas técnicas usando este fenómeno para separar partículas de un líquido u otro fluido. Típicamente el fluido circula a través de un conducto o canal en el que se establece una onda acústica estacionaria transversal a la longitud del canal. De acuerdo a ello, las partículas se desplazan para formar bandas de concentración a lo largo de las posiciones de equilibrio de la onda dentro de estos conductos.

sqbullet En la reciente patente WO 2007/044642 A2, "DEVICE AND METHOD FOR COMBINED MICROFLUIDIC-MICROMAGNETIC SEPARATION OF MATERIAL IN CONTINUOUS FLOW" (Ingber Donald, Xia Shannon, Tom Hunt, Peter Westervelt), se presenta un dispositivo de separación celular en flujo continuo basado en la aplicación de campos magnéticos. El principio de operación es completamente diferente al de la presente invención, ya que no se basa en la aplicación de energía mecánica sino electromagnética y, a diferencia de la presente invención, es una tecnología invasiva que requiere la inserción de micropartículas inorgánicas ajenas a la suspensión a tratar. Estas, susceptibles al campo magnético, se adhieren y arrastran a determinadas células de la suspensión, conduciéndolas magnéticamente hacia los lugares de equilibrio pre-seleccionados. Por tratarse de un método invasivo, la viabilidad de las células separadas se ve parcialmente alterada para la realización de estudios posteriores, una vez extraídas del medio. Estas dos características del dispositivo hacen la patente fuertemente diferente al de la presente invención, aunque ambas coincidan en la utilización de doble lecho de flujo en régimen laminar con una interfase.

sqbullet En la publicación J. Statis. Mech.: "THEORY AND EXPERIMENTS", 2006, "CONTINUOUS PARTICLE SIZE SEPARATION AND SE SIZE SORTING USING ULTRASOUND IN A MICROCHANNEL" (Sergey Kapishnikov, Vasily Kantsler, Victor Steingberg) se presentan dos dispositivos para la separación y clasificación de partículas y células en suspensión mediante ultrasonidos. El primero de ellos es un resonador conocido como "lamda medios" (siendo lamda la longitud de onda acústica), en el que se establece una onda estacionaria con un nodo de presión en el centro del canal, hacia donde las partículas son conducidas y concentradas durante la aplicación del campo acústico, y a lo largo del cual continúan su circulación hasta alcanzar la salida. De este modo, la suspensión enriquecida de partículas concentradas ultrasónicamente abandona el dispositivo a través de un canal central de salida, mientras el resto de la suspensión lo hace mayoritariamente por otros dos canales laterales de salida dispuestos simétricamente respecto al central. En el dispositivo no es posible realizar una separación absoluta de las partículas colectadas acústicamente respecto al resto de elementos presentes en la suspensión, los cuales circulan distribuidos uniformemente en todo el espacio que permite el canal. Al no estar afectados por el campo ultrasónico su disposición espacial no se ve alterada durante la aplicación acústica, de manera que abandonan el dispositivo por los tres canales de salida, aunque mayoritariamente lo hagan a través de los canales laterales. Esto se debe a que por el canal central se produce una salida masiva de las células concentradas ultrasónicamente. Para lograr una separación selectiva, denominada por los autores como "clasificación celular", el artículo presenta también el desarrollo de un resonador "lamda cuartos" en el que el ancho del canal es aproximadamente un cuarto de la longitud de onda y el nodo de presión se establece junto a una de las paredes laterales del canal, hacia donde son conducidas y colectadas las células seleccionadas. A diferencia de la presente invención, este dispositivo requiere la utilización de dos transductores ultrasónicos colocados a ambos lados de la sección del canal de tratamiento, externos al mismo, paralelos y enfrentados, emitiendo trenes de onda temporales con un desfase variable. Este dispositivo, siendo el más parecido al de la presente invención, muestra importantes diferencias que, en su caso, provocan ciertas restricciones de actuación, tales como la imposibilidad de aplicación de onda continua, así como limitaciones físicas sobre la zona de actuación, determinadas por el espacio contenido entre las dos fuentes de emisión ultrasónica y por la disposición geométricamente simétrica de los canales de entrada y salida respecto al canal central de tratamiento, limitando fuertemente la zona de actuación ultrasónica. A diferencia de la presente invención, este dispositivo lamda cuartos trabaja en torno a f=4 MHz y presenta importantes restricciones tanto en el volumen de tratamiento, cuya sección es inversamente proporcional a la frecuencia (aproximadamente 4 veces inferiores a las de nuestra invención), como en la precisión exigida en las medidas del canal, como consecuencia de lo anterior.

sqbullet En la patente WO/2002/072236) PARTICLE SEPARATION (ERYSAVE AB, JÖNSSON Henrik, LAURELL Thomas, ALLERS Mats, PERSSON Hans), se describe un dispositivo para separar materia particulada (especialmente para tratamientos de soluciones de sangre) en un dispositivo resonante con un número elevado de nodos de presión acústica para la formación de múltiples bandas de concentración de partículas. Se trata de un dispositivo muy diferente al de la presente invención en cuanto al diseño y actuación. El campo acústico se ejerce sobre una cámara de tratamiento bien diferente a los canales resonadores lamda medios o lamda cuartos, con dimensiones muy superiores a las de éstos para permitir el establecimiento de una onda estacionaria con distribución espacial de múltiples nodos y máximos de presión acústica.

sqbullet En la patente europea EP1365849, también publicada como patente Americana U.S. Pat. US6929750, US 2004069717 y WO02072235, "DEVICE AND METHOD FOR SEPARATION", (LAURELL Thomas, ALLERS Mats, JÖNSSON Henrik, PERSSON Hans), se describe un dispositivo de microfluídica para separación ultrasónica en resonadores de media longitud de onda dispuestos en paralelo formando una estructura de distribución espacial conocida como "array". Cada uno de estos elementos contiene un canal resonador "lamda medios" en el que se procede a una conducción y colección acústica de ciertas células hacia el centro del mismo. Como en los demás resonadores de este tipo, al final del proceso...

1. Microdispositivo de separación y extracción no invasiva y selectiva de partículas en suspensiones polidispersas caracterizado porque comprende, integrados en un chip-sustrato de material acústicamente blando, los siguientes componentes:

a) un sistema de microcanales de flujo de distribución espacial asimétrica de las ramas de canalización de salida desde el canal central de tratamiento (110) que comprende (ver Figura 1):

y,

b) un actuador o transductor ultrasónico en una de sus paredes laterales (190)

- externo y paralelo al canal central de tratamiento (110), que transmite la energía acústica al microcanal de tratamiento a través del sustrato y del material en el que está desarrollada la canalización, capaz de establecer una onda estacionaria en el interior del canal de tratamiento entre sus paredes laterales, produciendo un nodo de presión a una distancia de la pared reflectora de aproximadamente 1/3 y 2/3 del ancho del canal, respectivamente, y de producir un gradiente de presiones generado acústicamente en el interior del canal central con un efecto de conducción de ciertas partículas dentro del mismo hacia la región de equilibrio acústico definida en el nodo, donde la fuerza de radiación se anula, y

- cuya actuación incluye no sólo el canal central de tratamiento sino también la zona de bifurcación hacia los dos microcanales de salida con el objeto de aumentar al máximo la eficiencia de separación selectiva y extracción.

2. Microdispositivo según la reivindicación 1 caracterizado porque el material acústicamente blando del chip-sustrato es un material cuya impedancia no supera en tres veces la impedancia de los medios líquidos, en un rango de variabilidad oscilante entre 0.8 MRayls y 2.6 MRayls.

3. Microdispositivo según la reivindicación 1 caracterizado porque el material acústicamente blando del chip-sustrato es un material acrílico.

4. Microdispositivo según la reivindicación 1 caracterizado porque el material acrílico es un epoxy de resina SU-8 sobre el que se realiza el canal y el sustrato acrílico es PMMA "Polimetacrilato de Metilo", presentan una impedancia acústica de 3.3 MRayls, y donde el transductor ultrasónico b) consiste en una pequeña cerámica piezoeléctrica, preferentemente, un dispositivo de la marca PZT26.

5. Procedimiento de fabricación del microdispositivo según las reivindicaciones 1 a la 4 mediante técnica de XXXX de acuerdo al diseño descrito en la Figura 1 y que comprende las siguientes etapas (ver Figura 10):

6. Procedimiento de fabricación del microdispositivo según las reivindicaciones 1 a la 4 mediante la técnica de estampación en caliente combinadas con un proceso de pegado posterior, que comprende las siguientes etapas:

7. Uso del microdispositivo según las reivindicaciones 1 a la 4 en un procedimiento de separación no invasiva selectiva, lavado y/o clasificación de partículas en suspensiones polidispersas.

8. Uso del microdispositivo según la reivindicación 7 caracterizado porque las partículas consisten en células, preferentemente, virus, priones, células procariotas (por ejemplo, bacterias, levaduras, hongos y algas) y células eucariotas.

9. Uso del microdispositivo según la reivindicación 8 caracterizado porque las células eucariotas son, preferentemente células humanas, más preferentemente células tumorales, células sanguíneas, células troncales o células madre, ya sean somáticas o embrionarias, u de otro tipo presentes en fluidos corporales, como por ejemplo: sangre, orina, líquido cefalorraquídeo o presentes en otros tipos de muestras biológicas.

10. Uso del microdispositivo según la reivindicación 9 caracterizado porque dicho procedimiento de separación de células eucariotas tiene por objeto el tratamiento de enfermedades humanas pertenece al siguiente grupo: donaciones de sangre, plasmaféresis, procesos de diálisis y análisis de laboratorio, así como reciclado y/o lavado de sangre tras operaciones quirúrgicas.

11. Uso del microdispositivo según la reivindicación 9 caracterizado porque dicho procedimiento de separación de células eucariotas tiene por objeto el diagnóstico y pronóstico de cáncer en seres humanos para la separación selectiva y extracción de células tumorales circulantes en sangre periférica (CTC) de pacientes oncológicos.

12. Uso del microdispositivo según la reivindicación 9 caracterizado porque dicho procedimiento de separación de células eucariotas tiene por objeto el diagnóstico y/o tratamiento de enfermedades humanas para la separación selectiva y extracción de células dañadas o alteradas de pacientes, las cuales pueden ser reparadas ex vivo y administradas de nuevo al paciente.

13. Uso del microdispositivo según la reivindicación 9 caracterizado porque dicho procedimiento de separación de células eucariotas tiene por objeto el aislamiento de células madre humanas o animales provenientes de distintos tejidos o fluidos.