Un método de hidrólisis de péptidos, uso de una composición como agente bacteriostático y bactericida y los usos de la forma activa de LytM de S. aureus.

Un método de hidrólisis de péptidos que comprende la etapa en que la forma activa de LytM se pone en contacto con sustrato peptídico,

en entorno acuoso de conductividad inferior a 2 mS/cm, y en donde la forma activa de LytM es al menos un 95% homóloga al fragmento LytM180-316 que corresponde a los residuos 180-316 de secuencia SEC ID Nº1 o a LytM185-316 de secuencia SEC ID Nº 2, preferentemente la forma activa de LytM se selecciona entre el fragmento LytM180-316 que corresponde a los residuos 180-316 de secuencia SEC ID Nº 1 o LytM185-316 de secuencia SEC ID Nº 2; y en donde la forma activa de LytM tiene actividad glicilglicina endopeptidasa del dominio catalítico LytM185-316 que corresponde a los residuos 185-316 de secuencia SEC ID Nº 1 frente al sustrato, que está compuesto por al menos cuatro glicinas en una fila,

y en el cual el contacto se realiza preferentemente a un intervalo de temperatura de aproximadamente 0ºC a aproximadamente 37ºC, preferentemente a una temperatura por debajo de 10ºC.

Un método de hidrólisis de péptidos, uso de una composición como agente bacteriostático y bactericida y los usos de la forma activa de LytM de S. aureus 5

Campo técnico

[1] La presente invención se refiere a un método de hidrólisis de péptidos y una peptidasa capaz de escindir las paredes celulares de bacterias Gram-positivas, el uso de una composición como agente bacteriostático y

bactericida (por ejemplo, como bacteriolftico), y usos de la forma activa de LytM de S. aureus.

Técnica antecedente

[2] Las infecciones causadas por Staphylococci, en particular Staphylococcus aureus, son cada vez más 15 difíciles de tratar debido a la resistencia a fármacos de rápida emergencia. Por esta razón es incluso más importante

no solo desarrollar nuevas terapias para combatir infecciones por estafilococos, para eliminar el germen portador, en particular entre el personal médico, sino también diseñar métodos más eficaces para eliminar estas bacterias del entorno, incluyendo hospitales. Uno de estos nuevos enfoques es la lisis de células bacterianas usando enzimas líticas.

[3] Existen peptidoglucano hidrolasas conocidas, tales como lisostafina y LytM que escinden los puentes cruzados pentaglicina característicos en peptidoglucanos de Staphylococcus, por ejemplo, S. aureus y son, por lo tanto, de interés como agentes potenciales antiestafilococos.

[4] El papel biológico de la lisostafina está bien establecido. La lisostafina es una bacteriocina secretada por Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus. La proteína madura es inactiva contra el organismo productor pero altamente efectiva en la escisión de las paredes celulares de S. aureus.

La lisostafina madura es una proteína monomérica con actividad óptima a temperaturas de aproximadamente 37- 4°C, pH 7,5 y tiene un punto isoeléctrico pl de 9,5 (Browder H. P. et al., 1965, Biochem. Biophys. Res. Commun., 3 19:383-389 e Iversen O. et al., 1973, Eur. J. Biochem., 38:293-3). La lisostafina se ha usado para alterar biopelículas de S. aureus y S. epidermidis en superficies artificiales y también se ha ensayado como recubrimiento para catéteres. En un modelo de ratón, se ha usado lisostafina para erradicar biopelículas de S. aureus de vena yugular cateterizada y también para el tratamiento de Infecciones sistémicas. En un modelo de rata algodonera, una crema de lisostafina ha demostrado ser efectiva para erradicar colonización nasal de S. aureus. En seres humanos, 35 se ha usado lisostafina en una base experimental para tratar endocarditis de válvula aórtica por S. aureus resistente a meticilina.

[5] Se sabe que Staphylococcus, en particular S. aureus a menudo puede causar envenenamiento de alimentos debido a la producción de enterotoxlnas peptídicas termoestables que conducen a Intoxicación. Debido a

la gran escala de producción de alimentos, el uso de enzimas que destruyan las células de estafilococos para mejorar la calidad microbiológica del alimento es posible solamente si dichas enzimas son fácilmente accesibles y barato. Además, las enzimas estafilolítlcas usadas en la Industria alimentarla deben ser eficaces en un amplio intervalo de temperaturas, en particular en regímenes de baja temperatura de almacenamiento de alimentos y durante el proceso de producción, manteniendo al mismo tiempo su actividad a baja concentración salina, es decir, 45 en agua que se usa para retirar las bacterias de las Instalaciones de tuberías de producción y otras superficies. La lisostafina disponible en el mercado no cumple dichas demandas.

[6] Existen métodos conocidos de lisis de células bacterianas o para dañar las paredes celulares bacterianas que necesitan la desintegración de la estructura de pared celular por enzimas bacterianas específicas. Esto es

particularmente cierto para bacterias Gram-positivas a causa de la estructura particular de sus paredes celulares. Por ejemplo, se usa lisostafina para Usar las células S. aureus. Los métodos de lisis celular conocidos requieren que la reacción se realice en condiciones que se parecen a condiciones fisiológicas y se realice a elevadas temperaturas de aproximadamente 3-37°C. En dichas condiciones, los componentes celulares aislados, tales como proteínas o ácidos nucleicos, pueden degradarse por las enzimas liberadas, cuya actividad es habltualmente la más alta en 55 condiciones fisiológicas. Dicha degradación podría evitarse si la lisis celular efectiva pudiera realizarse en condiciones no fisiológicas, tales como baja concentración de sal o un amplio Intervalo de temperaturas, en particular en bajas temperaturas. Existen kits conocidos que contienen lisostafina que se usan para aislar protoplastos, enzimas, proteínas, componentes celulares o ácidos nucleicos de bacterias Gram-positivas, por ejemplo, de especies de Staphylococcus.

[7] LytM es una autolisina producida por S. aureus. El gen de LytM de S. aureus se clonó y secuencló (Ramadurai L. et al., 1997, J. Bacteriol. 179:3625-31). La proteína se sintetiza con un péptldo señal (LytMi.25), seguido por un dominio N-terminal que no tiene similitud con el dominio N-terminal de lisostafina. El dominio C- terminal de LytM puede dividirse en una región ocluyente y una región de alta similitud con el dominio catalítico de

lisostafina. El análisis de la estructura de LytM sugiere que LytM de longitud completa no puede tener actividad

significativa, porque el sitio activo está ocluido mientras que el dominio catalítico solo debe ser más activo que la proteína de longitud completa. Se sabe que las paredes celulares de las bacterias Gram-positivas difieren en la cantidad y forma de aminoácidos presentes en los puentes interpeptídlcos de los peptidoglucanos. Las gllcllglicina endopeptldasas pueden requerir cierta cantidad de glicinas en los puentes interpeptídicos que escinden. Se ha 5 demostrado que LytM escinde tetra y pentagliclna pero no una triglicina (Firczuk M. et al., 25, J.Mol Blol. 354:578- 59, Odintsov S. G. et al., 24, J Mol Biol 335:775-8).

[8] Bardelang et al. (29, Biochem. J. 418:615-624 han demostrado que LytM puede escindir no solamente peptidoglucanos o péptidos sino también proteínas.

[9] Odinstov S G et al: "Latent LytM at 1.3A Resolution", JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, ACADEMIC PRESS, REINO UNIDO, vol. 335, n° 3, 16 de enero de 24 (24-1-16), pág. 775-785, XP448547 describieron la forma activa de LytMi8s-3i6 e indican que degrada las paredes celulares de S. carnosus y degrada de forma efectiva pentaglicina en contraste con LytM de longitud completa, en una mezcla de reacción en conductividad por

encima de 1 mS/cm.

[1] Firczuk et al: Characterization of a chromosomally encoded glycylglycine endopeptidase of Staphylococcus aureus", MICROBIOLOGY, vol. 145, n° 4, 1 de abril de 1999 (1999-4-1), pág. 81-88, XP5533113 describe el uso de lisostafina, una endopeptidasa diferente secretada por Staphylococcus sp. como agente antiestafilococos.

[11] El documento WO21/92333 A1 describe el uso de LytM para detectar patógenos.

[12] El documento WO 27/13655 A2 describe el uso de LytM en la preparación de un desinfectante o una composición para tratar una infección bacteriana.

Las proteínas recombinantes se producen en muchos casos como proteínas de fusión con marcas adheridas (péptido o proteína) que simplifican su posterior purificación. Sin embargo, es necesario retirar por escisión dichas marcas usando una proteasa específica. Dicha enzima tiene que ser muy efectiva pero también altamente específica para evitar escisión indeseable de la proteína. Las proteasas más habitualmente usadas son: factor Xa, PreScision y proteasas TEV. Son bastante caras y actúan de forma efectiva solamente en condiciones fisiológicas de 3 conductividad aumentada e intervalo de temperatura de 3-4°C. En dichas condiciones, la proteína purificada se expone a la actividad degradante de proteasas presentes en la muestra, que incluso en cantidades residuales podría tener un efecto nocivo sobre la integridad de la proteína.

Descripción de la invención

[13] A la luz del estado de la técnica descrito, el objeto de la invención presentada es superar las desventajas indicadas y suministrar una enzima lítica con una actividad glicilglicina endopeptidasa activa contra bacterias Gram- positivas, en particular S. aureus, que se producirá de forma efectiva, estable, y proporcionará una alta especificidad contra el sustrato y alta actividad en condiciones no fisiológicas de baja concentración salina, que también será

efectiva en un amplio intervalo de temperaturas, incluyendo bajas temperaturas.

[14] Un objeto adicional de la invención es proporcionar una nueva herramienta útil en biológica molecular... [Seguir leyendo]

1. Un método de hidrólisis de péptidos que comprende la etapa en que la forma activa de LytM se pone en contacto con sustrato peptídico, en entorno acuoso de conductividad inferiora 2 mS/cm, y en donde la forma activa de LytM

es al menos un 95% homologa al fragmento LytM-iso-316 que corresponde a los residuos 18-316 de secuencia SEC ID N°1 o a LytMi85-3i6 de secuencia SEC ID N° 2, preferentemente la forma activa de LytM se selecciona entre el fragmento LytMiso-316 que corresponde a los residuos 18-316 de secuencia SEC ID N° 1 o LytMiss-316 de secuencia SEC ID N° 2; y en donde la forma activa de LytM tiene actividad glicilglicina endopeptidasa del dominio catalítico LytMi85-3i6 que corresponde a los residuos 185-316 de secuencia SEC ID N° 1 frente al sustrato, que está compuesto 1 por al menos cuatro glicinas en una fila,

y en el cual el contacto se realiza preferentemente a un intervalo de temperatura de aproximadamente °C a aproximadamente 37°C, preferentemente a una temperatura por debajo de 1°C.

2. Un método de hidrólisis de péptidos in vitro de las paredes celulares de bacterias Gram-positivas, en el que la 15 forma activa de LytM se pone en contacto con las paredes celulares de bacterias Gram-positivas, en entorno acuoso

de conductividad inferior a 2 mS/cm, y en el que la forma activa de LytM es al menos un 95% homologa al fragmento LytMi8o-3i6 que corresponde a los residuos 18-316 de secuencia SEC ID N°1 o a LytMiss-3i6 de secuencia SEC ID N° 2,

en donde la forma activa de LytM se selecciona preferentemente entre el fragmento LytMi8o-3i6 que corresponde a 2 los restos 18-316 de secuencia SEC ID N° 1 o LytMi85-3i6 de secuencia SEC ID N° 2;

y en donde la forma activa de LytM tiene actividad glicilglicina endopeptidasa del dominio catalítico LytMi8s-3i6 que corresponde a los residuos 185-316 de secuencia SEC ID N° 1 frente al sustrato, que está compuesto por al menos cuatro glicinas en una fila;

en donde preferentemente las bacterias Gram-positivas son bacterias que pertenecen al género Staphylococcus o 25 Micrococcus, más preferentemente especies seleccionadas entre el grupo que comprende: S. aureus, S.

epidermidis, S. roseus, S. carnosus, S. lactis, S. saprophyticus y M. caseolyticus, M. candidans, M. naucinus, M.

vernae;

y en donde preferentemente el contacto se realiza a un intervalo de temperatura de aproximadamente °C a aproximadamente 37°C, preferentemente a una temperatura por debajo de 1°C.

3. Un uso de una composición que comprende la forma activa de LytM, como agente bacteriostático o bactericida o para desinfectar la superficie, contra bacterias Gram positivas, en particular contra el género Staphylococcus o Micrococcus, y en donde la composición se usa en entorno acuoso de conductividad inferior a 2 mS/cm,

y en donde la forma activa de LytM es al menos un 95% homologa al fragmento LytMiso-316 que corresponde a los 35 residuos 18-316 de secuencia SEC ID N° 1 o a LytMi8s-3i6 de secuencia SEC ID N° 2, en dondepreferentemente la

forma activa de LytM se selecciona entre el fragmento LytMiso-316 que corresponde a los residuos 18-316 de

secuencia SEC ID N° 1 o LytMi8s-3i6 de secuencia SEC ID N°2;

y en donde la forma activa de LytM tiene actividad glicilglicina endopeptidasa del dominio catalítico LytMi85-3ie que corresponde a los residuos 185-316 de secuencia SEC ID N° 1 frente al sustrato, que está compuesto por al menos 4 cuatro glicinas en una fila;

y en el cual preferentemente la composición se usa a una temperatura por debajo de 1°C.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la forma activa de LytM se usa como agente bacteriostático o bactericida en industria alimentaria, preferentemente el agente se usa como un aditivo para alimento a seres

humanos y animales o para descontaminar superficies.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la forma activa de LytM se usa como agente bacteriostático o bactericida en medicina, veterinaria, diagnóstico y/o en cosmética, preferentemente el agente se usa para desinfectar la superficie de herramientas y equipos usados en medicina, veterinaria, diagnóstico y/o en industria

cosmética o para desinfectar las superficies en hospitales y laboratorios.

6. Un uso de la forma activa de LytM, para aislar componentes celulares de bacterias Gram-positivas que comprenden ADN, ARN, proteínas, péptidos, glucopéptidos, lípidos, elementos celulares y metabolitos útiles, en la condiciones de reacción de conductividad inferior a 2 mS/cm, y en donde la forma activa de LytM es al menos un

95% homologa al fragmento LytMi8-3i6 que corresponde a los residuos 18-316 de secuencia SEC ID N°1 o a LytMi85.3i6 de secuencia SEC ID N° 2, preferentemente la forma activa de LytM se selecciona entre el fragmento LytMi8o-3i6 que corresponde a los residuos 18-316 de secuencia SEC ID N° 1 o LytMiss-316 de secuencia SEC ID N° 2;

y en donde cual la forma activa de LytM tiene actividad glicilglicina endopeptidasa del dominio catalítico LytMi85-3i6 6 que corresponde a los residuos 185-316 de secuencia SEC ID N° 1 frente al sustrato, que está compuesto por al menos cuatro glicinas en una fila;

y en donde cual preferentemente el aislamiento de los componentes celulares se realiza a una temperatura por debajo de 1°C.

7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que las bacterias Gram-positivas son bacterias que pertenecen al

género Staphylococcus o Micrococcus, preferentemente especies seleccionadas entre el grupo que comprende S. aureus, S. epidermidis, S. roseus, S. carnosus, S. lactis, S. saprophyticus y M. caseolyticus, M. candidans, M. naucinus, M. vernae.

8. Un uso de la forma activa de LytM en diagnóstico de bacterias Gram-positivas, preferentemente bacterias que pertenecen al género Staphylococcus o Micrococcus, en el cual el diagnóstico se realiza en condiciones de reacción de conductividad inferior a 2 mS/cm,

y en donde la forma activa de LytM es al menos un 95% homologa al fragmento LytMiso-316 que corresponde a los residuos 18-316 de secuencia SEC ID N° 1 o a LytMi85-3i6 de secuencia SEC ID N° 2, preferentemente la forma 1 activa de LytM se selecciona entre el fragmento LytMiso-316 que corresponde a los residuos 18-316 de secuencia SEC ID N° 1 o LytM-185-316 de secuencia SEC ID N° 2;

y en donde la forma activa de LytM tiene actividad glicilglicina endopeptidasa del dominio catalítico LytMi85-3i6 que corresponde a los restos 185-316 de secuencia SEC ID N° 1 frente al sustrato, que está compuesto por al menos cuatro glicinas en una fila;

y en donde preferentemente la forma activa de LytM se usa en la temperatura por debajo de 1°C.

9. Un uso de la forma activa de LytM para impregnar o para recubrir una superficie expuesta a bacterias Gram- positivas, en donde la forma activa de LytM es al menos un 95% homóloga al fragmento LytMiso-3i6 que corresponde a los residuos 18-316 de secuencia SEC ID N° 1 o a LytMi85-3i6 de secuencia SEC ID N° 2,

preferentemente la forma activa de LytM se selecciona entre el fragmento LytMiso-3i6 que corresponde a los residuos 18-316 de secuencia SEC ID N° 1 o LytMi85-3i6 de secuencia SEC ID N° 2; y en donde la forma activa de LytM tiene actividad glicilglicina endopeptidasa del dominio catalítico LytMi85-3i6 que corresponde a los residuos 185-316 de secuencia SEC ID N° 1 frente al sustrato, que está compuesto por al menos cuatro glicinas en una fila, y en donde las condiciones en que dicha forma activa de LytM se usa como impregnación o como recubrimiento de superficie 25 tiene la conductividad inferior a 2 mS/cm;

y en el donde preferentemente la forma activa de LytM se usa a una temperatura por debajo de 1°C.

1. Un uso de la forma activa de LytM para la escisión de una marca de un sustrato proteico, preferentemente de una proteína de fusión, en donde la escisión tiene lugar en una posición de la secuencia del sustrato proteico donde

están presentes al menos cuatro o más glicinas en una fila y la escisión se realiza con una conductividad inferior a 2 mS/cm en una intervalo de temperatura de aproximadamente °C a aproximadamente 37°C, preferentemente a una temperatura por debajo de 1°C,

y en donde la forma activa de LytM es al menos un 95% homóloga al fragmento LytM-i8o-3i6 que corresponde a los residuos 18-316 de secuencia SEC ID N° 1 o a LytMi8s-3i6 de secuencia SEC ID N° 2, preferentemente la forma 35 activa de LytM se selecciona entre el fragmento LytMiso-316 que corresponde a los residuos 18-316 de secuencia SEC ID N° 1 o LytMi85-3i6 de secuencia SEC ID N° 2; y en donde la forma activa de LytM tiene actividad glicilglicina endopeptidasa del dominio catalítico LytMi85-3i6 que corresponde a los residuos 185-316 de secuencia SEC ID N° 1 frente al sustrato, que está compuesto por al menos cuatro glicinas en una fila.