Trasplante de células neurales humanas para el tratamiento de afecciones neurodegenerativas.

Un procedimiento in vitro para preparar una población de células madre neurales capaces de generar neuronas en una médula espinal del receptor que comprenda:

a) expandir al menos una célula madre neural obtenida directamente del tejido de mamífero en un recipiente de cultivo recubierto previamente con 0,1 μg/ml a 1 mg/ml de uno o más polímeros capaces de promover la adhesión de las células;

b) concentrar la población expandida, en el que la menos la célula madre neural se obtiene de fuentes de mamífero diferentes a embriones humano, en el que cultivar la célula madre neural en ausencia de suero, en el que expandir la célula madre neural incluye exponer la célula madre neural a al menos un factor de crecimiento y en el que la expansión celular excede las treinta duplicaciones de las células sin diferenciación.

Trasplante de células neurales humanas para el tratamiento de afecciones neurodegenerativas 5 INTRODUCCIÓN

[1] Los procedimientos descritos se refieren a procedimientos de preparación de células madre neurales para tratar trastornos mediante el trasplante de dichas células que son excepcionalmente beneficiosas para dichos procedimientos de tratamiento. En especial, los procedimientos descritos proporcionan procedimientos de

preparación de células madre neurales para tratar afecciones neurodegenerativas con células madre neurales (CMN).

[2] Los trastornos neurodegenerativos se caracterizan por condiciones que implican el deterioro de las neuronas como resultado de la enfermedad, afecciones hereditarias o lesiones, como una lesión traumática o

isquémica de la médula espinal o del cerebro.

[3] Los circuitos de la médula espinal que rigen la contracción de los músculos esqueléticos de las extremidades incluyen neuronas motoras excitadoras e interneuronas GABAérgicas (es decir, productores de GABA) y glicinérgica (es decir, productoras de glicina) inhibidoras. Una neurona motora es un nervio que se origina en el

cuerno anterior de la sustancia gris de la médula espinal. El axón de la neurona motora emerge de un segmento de la médula espinal como una fibra motora eferente que inerva las fibras musculares. Los impulsos conducidos por la neurona motora estimulan la contracción de las fibras musculares. El GABA, o ácido gamma-amino butírico, es un metabolito natural del sistema nervioso de mamíferos que actúa como un neurotransmisor que inhibe o suprime la conducción nerviosa del potencial eléctrico. La pérdida de interneuronas GABAérgicas tiene como resultado la 25 desrregulación de la tonalidad inhibitoria de las contracciones musculares evocadas por neuronas motoras. Sin el control ejercido por las interneuronas inhibidoras sobre las neuronas excitadoras, se produce un sobredisparo de las neuronas excitadoras que lleva a una contracción espasmódica incontrolada o a rigidez incontrolada de los músculos de las extremidades. La pérdida de neuronas motoras da lugar a una paraplejía flácida en la que los sujetos no pueden contraer los músculos y, por tanto, no pueden moverse.

[4] Un caso en que las interneuronas GABAérgicas estén dañadas en la médula espinal incluye una complicación asociada con un pinzamiento cruzado transitorio de la aorta torácica o toracoabdominal descendente. Dicho pinzamiento cruzado es un paso necesario en la cirugía vascular para reparar aneurismas de la aorta torácica o toracoabdominal. Durante el tiempo de pinzamiento cruzado, una parte de la médula espinal no recibe circulación

sanguínea y puede sufrir isquemia. Dependiendo de la duración del intervalo isquémico, la disfunción neurodegenerativa posterior puede expresarse desde un punto de vista neurodegenerativo como paraparesia o paraplejía espasmódica o flácida completamente desarrollada.

[5] Mientras que el mecanismo que lleva a la degeneración neuronal inducida por isquemia solo se 4 entiende parcialmente y puede implicar una excesiva liberación/actividad de aminoácidos, prostaglandias y/o

radicales libres de oxígeno excitadores, la población neuronal de la médula espinal afectada por la lesión isquémica transitoria están bien definida. Por ejemplo, el análisis histopatológico de la médula espinal obtenida de animales con paraplejía espasmódica completamente desarrollada muestra una pérdida selectiva de neuronas inhibidoras pequeñas; sin embargo, las neuronas motoras alfa persisten en segmentos espinales previamente isquémicos. Se 45 ha descrito una patología neuronal medular similar en humanos con una lesión isquémica medular.

[6] Por el contrario, en animales con paraplejía flácida, se observan cambios neurodegenerativos pan necróticos que afectan tanto a las interneuronas inhibidoras y excitadoras pequeñas como a las neuronas motoras ventrales. Durante el periodo de degeneración neuronal tras la isquemia medular, también se observa una activación

dependiente de la lesión de la microglía local y cambios inflamatorios, como infiltración con macrófagos, al igual que en la isquemia cerebral focal o global. Dependiendo del grado de la lesión, los cambios inflamatorios típicamente son máximos entre los dos y los siete días tras la lesión isquémica y, a continuación, muestran una pérdida gradual de elementos inflamatorios durante dos a cuatro semanas de periodo postisquémico.

[7] En las últimas dos o tres décadas se ha realizado un esfuerzo considerable para evaluar en modelos

animales el potencial terapéutico del injerto medular de diversos materiales. Por tanto, se han administrado líneas celulares o tejido fetal de la médula espinal completamente aislado a las regiones lesionadas y también se ha usado terapia génica medular directa para mejora las disfunciones neurodegenerativas en varios modelos de lesión medular, incluyendo lesión traumática mecánica, médula espinal químicamente lesionada o animales genéticamente

manipulados con degeneración progresiva de neuronas motoras a (ratones o ratas transgénicas con ELA).

[8] En general, los estudios demuestran una supervivencia a largo plazo y conservación de los fenotipos neuronales en injertos generados a partir de tejido fetal, pero no a partir de precursores neuronales expandidos in

vitro. De hecho, solo se ha demostrado la diferenciación neuronal limitada y la maduración de los precursores neurales expandidos in vitro e injertados mecánica o químicamente en la médula espinal lesionada. Las células se diferencian preferiblemente en tipos celulares no neuronales. Mientras que el mecanismo de esta diferenciación no neuronal preferente no se comprende por completo, se plantea la hipótesis de que probablemente está implicada una liberación local de citoquinas proinflamatorias (como TNFa o TGF(3) en el sitio de la lesión previa.

[9] La neurodegeneración representa un entorno biológico especialmente desafiante para la terapia celular y las señales de muerte celular presentes en la enfermedad neurodegenerativa establecida (Rothstein y col., 1992; Howland y col., 22; Turner y col., 25) pueden ser incompatibles con la supervivencia del injerto. Además, la médula espinal adulta se contempla como carente de células y/o señales que permitan la regeneración (Park y

col., 22) y la mayoría de los estudios de trasplante de CMN han mostrado una diferenciación escasa o restringida (Cao y col., 22; Yan y col., 23; Yan y col., 24).

[1] Uno de los principales problemas en las terapias celulares es la baja supervivencia celular (inferior al 5%) de las células injertadas. Todas las células injertadas hasta la fecha sufren una muerte celular significativa poco

después de su inyección in vivo. Por tanto, para administrar una dosis de células eficaz, debe inyectarse la dosis final al menos 2 veces. Esto requiere, a su vez, una obtención de células a una escala mucho más mayor, lo que supone obstáculos administrativos y económicos adicionales. Además, no ha sido posible mantener la tasa de supervivencia de estas células in vivo. La imposibilidad de demostrar la administración reproducible de dosis efectivas de terapia celular impide la aprobación de su uso por parte del gobierno o de agencias reguladoras como la 25 Food and Drug Administration.

[11] Se presentan desafíos adicionales cuando se tratan enfermedades y afecciones neurodegenerativas que se diseminan sobre una zona extensa de un cuerpo, tejido u órgano, como el sistema nervioso completo en lugar de una única zona localizada. Por ejemplo, en la ELA, la neurodegeneración supone la muerte lenta de

neuronas motoras a lo largo de toda la médula espinal, así como de las neuronas de la corteza motora. Igualmente, en la mayoría de las enfermedades lisosomales, la destrucción neuronal afecta a la mayoría de las regiones del cerebro y de la médula espinal. La enfermedad de Alzheimer afecta a la mayor parte del cerebro. Incluso en enfermedades neurodegenerativas más localizadas como el Parkinson y la enfermedad de Huntington, la zona afectada del núcleo estriado es bastante grande, mucho más grande que la zona injertada que puede conseguirse 35 mediante cirugía. Por tanto, se prevé que las terapias celulares para enfermedades neurodegenerativas requieran procedimientos de trasplante más extensos.

[12] Existe así una necesidad de procedimientos mejorados para tratar afecciones neurodegenerativas. También existe la necesidad de procedimientos de cultivo mejorados (véase Rappa y col., 24, Neuroscience 124,

823-83) y trasplante de células madre neurales y progenitores neurales humanos que una vez injertados superen todas las limitaciones... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento in vitro para preparar una población de células madre neurales capaces de generar

neuronas en una médula espinal del receptor que comprenda:

a) expandir al menos una célula madre neural obtenida directamente del tejido de mamífero en un recipiente de cultivo recubierto previamente con ,1 pg/ml a 1 mg/ml de uno o más polímeros capaces de promover la adhesión de las células;

b) concentrar la población expandida, en el que la menos la célula madre neural se obtiene de fuentes de mamífero diferentes a embriones humano, en el que cultivar la célula madre neural en ausencia de suero, en el que expandir la célula madre neural incluye exponer la célula madre neural a al menos un factor de crecimiento y en el que la expansión celular excede las treinta duplicaciones de las células sin diferenciación.

2. El procedimiento de la reivindicación 1,

en el que la población expandida es capaz de generar neuronas productoras de GABA in vivo\ o

en el que la población expandida es capaz de generar neuronas productoras de glicina in vivo\ o

en el que al menos el 4% de la población expandida es capaz de generar neuronas en la médula espinal; o

en el que al menos el 3% de la población expandida es capaz de diferenciarse en neuronas in vitro\ o

en el que el polímero se selecciona a partir del grupo compuesto por poli-D-lisian, poli-L/D-lisina, poli-L-lisina, poll-D- ornitina, poli-L-ornitina, fibronectina, lamina, colágeno y combinaciones de los mismos.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el factor de crecimiento se selecciona a partir del grupo compuesto por bFGF, EGF, TGF-alfa, aFGF y combinaciones de los mismos.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la célula madre neural se aísla a partir de una fuente

seleccionada entre el grupo compuesto por un sistema nervioso central, un sistema nervioso periférico, médula

ósea, sangre periférica, sangre de cordón umbilical y al menos un embrión.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el mamífero es un mamífero en desarrollo.

6. El procedimiento de la reivindicación 5 en el que la edad de gestación del mamífero en desarrollo está

entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 2 semanas.