Substrato blando para cultivo celular y procedimiento para preparar el mismo.

Un procedimiento de fabricación de un substrato blando, que comprende las etapas de:

(a) producir un polímero entre una capa base y una máscara de transparencia que comprende por lo menos un área transparente y opcionalmente por lo menos un área no transparente,

(b) exponer el polímero a UV profundo a través de la máscara,

(c) separar la máscara del polímero,

(d) poner en contacto el polímero con una biomolécula, y

(e) opcionalmente separar por lavado el exceso de biomolécula,

en el que el substrato tiene un módulo de Young en el intervalo de 0,1 a alrededor de 100 kPa,

en el que la polimerización se efectúa in situ, y

en el que la biomolécula es una proteína, un carbohidrato, un lípido, un ácido nucleico, o una de sus combinaciones.

Substrato blando para cultivo celular y procedimiento para preparar el mismo Campo de la invención La presente invención se refiere a un método para producir un substrato blando y al substrato blando producido por él, en particular un substrato blando microimpreso, siendo dicho substrato particularmente útil para el cultivo celular Antecedentes de la invención Las propiedades geométricas y mecánicas del micromedio celular tienen un profundo impacto en la morfogénesis y funciones celulares. Afectarán a la arquitectura del citoesqueleto celular, polaridad, migración, división, crecimiento y diferenciación. Se han preparado biomateriales para revelar estos efectos, investigar los mecanismos por los que regulan las funciones celulares y finalmente controlarlas para diseñar nuevas herramientas para aplicaciones de ingeniería de tejidos.

La geometría del micromedio se ha controlado con técnicas de microimpresión. Se usaron para controlar la localización de moléculas adhesivas de la matriz extracelular (ECM) y por ello controlar la posición y forma de la célula individual (Damljanovic V, et al., Biotechniques 2005; 39, 847-851) . El control de la forma celular usando micropatrones adhesivos es un método eficiente. De hecho, los micropatrones adhesivos revestidos con ECM permiten la normalización de la forma de células individuales y un control preciso de la distribución espacial de la adhesión focal y cables de actina (Parker et al., 2002, FASEB J 16, 1195-1204; Ther y et al., 2006, Cell Motil Cytoskeleton 63, 341-355; Ther y et al., 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103, 19771-19776) . Las geometrías apropiadas pueden imponer restricciones de orientación exigentes al ensamblaje de actina, y reducir la variabilidad célula-célula.

La mecánica del micromedio también se ha controlado con substratos blandos. Ambos parámetros, geometría y mecánica, se deben controlar sobre el mismo material para recapitular fielmente las condiciones fisiológicas que encuentran las células en el tejido y controlar totalmente las señales físicas a las que son sensibles. El control de la forma celular en substratos deformables se ha realizado usando varias herramientas microfabricadas en geles de poliacrilamida (PAA) o conjuntos de micropilares. Sellos micromoldeados (Damljanivic V, et al., supra) , estarcidos (Parker et al., 2002, FASEB J 16, 1195-1204; Wang et al., 2002, Cell Motil Cytoskeleton 52, 91-106) o canales microfluídicos (Engler AJ, et al., 2004, J Cell Biol, 166, 877-887) se usaron para depositar localmente proteínas del ECM sobre PA químicamente activada. La impresión por microcontacto se usó para imprimir proteínas de la ECM sobre conjuntos de micropilares (Liu et al., 2002, FASEB J, 16, 1195-1204; Ruiz et al., 2008, Stem Cells, 26, 29212927; Tan et al., 2003, Proc Natl Acad Sci USA, 100, 1484-1489; Fu et al., 2010, Nat Methods, 7, 733-736) . El documento WO 2010/011407 describe también métodos para generar substratos blandos impresos.

La geometría y mecánica del micromedio afectan a la arquitectura celular y funcionan notablemente modulando la producción celular de fuerzas. Las células se unen a su micromedio y ejercen fuerzas de tracción vía la contracción dependiente de miosina de su citoesqueleto de actina. En células no migratorias espacialmente confinadas, se forman fibras de tensión a lo largo de bordes celulares y se aplican fuerzas de tracción en los ápices celulares. Las fibras de tensión parecen más fuertes cuando no hay disponible ECM para la adhesión celular en ápices celulares. La rigidez del micromedio afectará a la magnitud de las fuerzas: cuanto más rígido el sustrato, mayores las fuerzas de tracción. El nivel de orientación de las fuerzas de tracción afecta a la organización intracelular, notablemente al posicionamiento del núcleo, posicionamiento del centrosoma, crecimiento del cilum primario y al tráfico intracelular. Por tanto, es un importante regulador de la polaridad celular. La contractilidad celular también gobierna la extensa remodelación del citoesqueleto durante la migración celular y la división. La contractilidad celular no sólo regula la arquitectura celular y la organización interna, sino también afecta el destino celular. Promueve el crecimiento celular y dirige la diferenciación de células madre. Considerando este amplio impacto de la contractilidad del citoesqueleto de actina en la fisiología celular, no es de extrañar que la mala regulación de la producción de fuerza esté implicada en la transformación tumoral. La desorientación de la polaridad, el posicionamiento celular desordenado y el crecimiento amplificado son características tumorales que se pueden inducir por la contractilidad celular elevada.

Dos métodos principales para medir fuerzas de tracción celular se basan en la deformación del substrato de cultivo celular. Sin embargo, ambos tienen limitaciones en la fabricación del sustrato y el análisis de la fuerza.

Entre los diferentes métodos que se están desarrollando para la medición de fuerza, la microscopía de fuerza de tracción (TFM) es uno de los más utilizados. Sin embargo, debido a su bastante complicada etapa de procesamiento de datos, esta técnica aún es exclusiva de algunos grupos especializados. No obstante todos los materiales necesarios para realizar TFM son casi equipos y reactivos de rutina en un laboratorio biológico ordinario.

La TFM clásica propuesta por Dembo and Wang (1999, Biophys J 76, 2307-2316) se realizaba en gel de poliacrilamida (PAA) . Básicamente, el gel de PAA se preparaba con micropartículas fluorescentes añadidas a la disolución. A continuación, el gel formado sobre un cubreobjetos activado se activaba con un reactivo bifuncional, Sulfo-SANPAH) y exposición a luz ultravioleta, El gel se revestía a continuación homogéneamente con proteína de matriz extracelular (ECM) para hacer el gel disponible para adhesión celular. Cuando las células se unían al gel, 2 10

debido a la fuerza de tracción ejercida por la célula, el substrato blando se deformaba y de este modo las partículas se desplazaban. Comparando la imagen de las partículas desplazadas y otra imagen de la posición original de las partículas tomada después de separar la célula (por ejemplo, por tratamiento con tripsina) , se puede obtener el campo de desplazamientos. La fuerza de tracción se podría por lo tanto obtener resolviendo un problema inverso desplazamiento-fuerza.

La activación del gel de PAA con sulfo-SANPAH es una etapa bastante variable que da como resultado una activación no homogénea y no reproducible del substrato Un segundo método, cultivo celular sobre pilares microfabricados, permite un cálculo de la fuerza mucho más simple y de este modo más rápido (du Roure et al., 2005, Proc Natl Acad Sci USA 102, 2390-2395; Tan et al., 2003, Proc Natl Acad Sci Usa 100, 1484-1489. Sin embargo el substrato requiere varias etapas de microfabricación no triviales. Además, los micropilares no soportan la desecación del disolvente, y la topografía del substrato puede afectar al comportamiento celular.

La microimpresión sobre gel de PAA se ha realizado con estarcidos (Parker et al., 2002, supra; Wang et al., 2002, Cell Motil Cytoskeleton 52, 91-106) , o sellos microestructurados (Engler et al., 2004, Cell 126, 677-689; Tan et al., 2003, supra) , pero la resolución de microimpresión es relativamente baja. En ambos casos, la microimpresión requiere varias etapas de microfabricación, haciendo todo el procedimiento largo y difícil de realizar.

Por consiguiente, el desarrollo de substrato con blandura ajustable, en particular substrato microimpreso, constituye un importante paso adelante hacia la fabricación de un micromedio controlado que es muy similar a las condiciones in situ.

Por lo tanto aún existe una necesidad en la técnica de métodos para producir geles blandos que se puedan diferenciadamente funcionalizar, microimprimir y activar homogéneamente, y que se puedan producir fácilmente con una reproducibilidad y resolución mejoradas.

Los inventores desarrollaron un nuevo método rápido y eficiente de microimpresión sobre substrato blando en el que no se requería herramienta microfabricada excepto la fotomáscara comercialmente disponible. El método ha sido validado controlando la forma, arquitectura del citoesqueleto y producción de fuerza de tracción de células epiteliales mamarias humanas.

Sumario de la invención El principal objetivo de esta invención es proporcionar nuevos substratos que permiten el cultivo celular, en particular el cultivo celular sobre substratos blandos microimpresos. Los substratos blandos de la presente invención presentan una mayor resolución espacial y permiten una mejor absorción de biomoléculas, tales como proteínas,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de fabricación de un substrato blando, que comprende las etapas de:

(a) producir un polímero entre una capa base y una máscara de transparencia que comprende por lo menos un área transparente y opcionalmente por lo menos un área no transparente,

(b) exponer el polímero a UV profundo a través de la máscara,

(c) separar la máscara del polímero,

(d) poner en contacto el polímero con una biomolécula, y

(e) opcionalmente separar por lavado el exceso de biomolécula, en el que el substrato tiene un módulo de Young en el intervalo de 0, 1 a alrededor de 100 kPa, en el que la polimerización se efectúa in situ, y en el que la biomolécula es una proteína, un carbohidrato, un lípido, un ácido nucleico, o una de sus combinaciones.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la capa base es vidrio silanizado.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que el polímero es poliacrilamida.

4. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que los reactivos de polimerización implementados para la producción del polímero de la etapa (a) se añaden en forma de una disolución sobre la máscara y a continuación se aplica sobre ella la capa base

5. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que la máscara es una placa de cuarzo revestida con una capa de cromo, en la que la capa de cromo está ausente sobre áreas específicas.

6. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que la máscara comprende entre 10 y 50.000 áreas transparentes/cm2.

7. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que la biomolécula es una proteína, en particular escogida entre proteínas fluorescentes, proteínas de la matriz extracelular, y proteínas que permiten que se fijen células a ella.

8. Un procedimiento según la reivindicación 7, en el que la proteína es fibronectina.

9. Un substrato blando obtenible por el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones previas.

10. Un uso de un substrato blando según la reivindicación 9, para cultivo celular.

11. Un método para ensayar una actividad celular o propiedades de una célula, que comprende proporcionar un substrato blando según la reivindicación 9, exponer dicho substrato a por lo menos una célula durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que la (s) célula (s) se una (n) al substrato blando, y medir la actividad celular o propiedades de dicha célula.

12. Un método para identificar una molécula que modula una actividad celular o propiedades de una célula que comprende proporcionar un substrato blando según la reivindicación 9, exponer dicho substrato a por lo menos una célula durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que la (s) célula (s) se una (n) al substrato blando, y medir la actividad celular o propiedades de dicha célula en presencia y en ausencia de la molécula, y determinar el efecto de la molécula sobre la actividad o propiedades celulares, en el que una modulación de la actividad o propiedades celulares indica que la molécula es capaz de modular la actividad celular o propiedades de la célula.