Proteínas de fusión basadas en Notch3 humanas como inhibidores señuelo de la señalización de Notch3.

Una proteína de fusión cuya secuencia (a) es idéntica a la secuencia de las repeticiones 1-X de EGF del dominio extracelular de la proteína receptora de Notch3 humana en la que X es cualquier número entero de 1 a 10 o de 12 a 33,

seguido de (b) una secuencia idéntica a la secuencia de una parte Fc de un anticuerpo, en la que (b) está localizada en el lado carboxi terminal de (a) y en la que (b) está unida a (a) bien directamente o mediante un conector.

Proteínas de fusión basadas en Notch3 humanas como inhibidores señuelo de la señalización de Notch3

A lo largo de esta descripción, se hace referencia a varias publicaciones por números arábigos en paréntesis o por autor y fecha de publicación en paréntesis. Las citas completas de estas publicaciones pueden encontrarse al final de la especificación.

Antecedentes de la invención Desarrollo vascular

Durante la embriogénesis de mamíferos, la formación del sistema vascular es un proceso temprano y esencial. En el embrión, el desarrollo vascular se inicia con el hemangioblasto pluripotente derivado del mesodermo de la placa paraxial y lateral. El hemangioblasto tiene el potencial de diferenciarse bien en un progenitor hematopoyético o un progenitor de células endoteliales, conocido como el angioblasto.

El desarrollo vascular empieza con un proceso conocido como vasculogénesis mediante el cual los angioblastos se diferencian en células endoteliales y migran conjuntamente para formar el plexo vascular primitivo. Esta red vascular inicial consiste en vasos que son homogéneos en tamaño y comprenden en su totalidad células endoteliales. El plexo vascular se remodela entonces mediante angiogénesis.

La angiogénesis implica la aparición de nuevos vasos, la migración de estos vasos a regiones avasculares, y el reclutamiento de células accesorias, pericitos y células de músculo liso (Gale y Yancopoulos, 1999) . Las células de músculo liso que se diferencian y forman las paredes de los vasos contráctiles se originan de múltiples progenitores incluyendo células de la cresta neural, células mesenquimales e incluso células endoteliales (Owens, 1995) . En los adultos, la angiogénesis está implicada en el desarrollo folicular, cicatrización de heridas, y procesos patológicos tales como angiogénesis tumoral y enfermedad cardiaca.

La familia Notch y ligandos Notch

Los estudios de Drosophila, C. elegans, pez cebra y mamíferos han demostrado que la ruta Notch es un mecanismo de señalización evolutivamente conservado que funciona para modular numerosas decisiones del destino celular. La señalización Notch se requiere para la formación del patrón apropiado de células que se originan de las tres capas germinales. Dependiendo del contexto celular, la señalización Notch puede tanto inhibir como inducir la diferenciación, inducir la proliferación, y estimular la supervivencia celular (Artavanis-Tsakonas et al., 1995; Lewis, 1998; Weinmaster, 1997) . En Drosophila, una única proteína Notch se activa por dos ligandos, Serrate y Delta. En mamíferos, estas familias se han expandido a cuatro genes Notch (Notch1, Notch2, Notch3 y Notch4) y cinco ligandos, 2 semejantes a Serrate (Jagged1-2) y 3 Delta (D11, 3, 4) (Bettenhausen et al., 1995; Dunwoodie et al., 1997; Gallahan y Callahan, 1997; Lardelli et al., 1994; Lindsell et al., 1995; Shawber et al., 1996a; Shutter et al., 2000a; Uyttendaele et al., 1996; Weinmaster et al., 1992; Weinmaster et al., 1991) . Durante la embriogénesis, los receptores y ligandos Notch se expresan en patrones espaciales y temporales dinámicos. Sin embargo, no se sabe si todos los ligandos activan todos los receptores.

Señalización y función de Notch

La señalización Notch influye en muchos tipos diferentes de decisiones del destino celular proporcionando señales inhibidoras, inductoras o proliferativas dependiendo del contexto medioambiental (revisado en Artavanis-Tsakonas et al., 1996; Greenwald, 1998; Robey, 1997; Vervoort et al., 1997) . Esta función pleyotrópica sugiere que Notch modula múltiples rutas de señalización de una manera espacio-temporal.

Consistente con la regulación por Notch de decisiones del destino celular, tanto los receptores como los ligandos son proteínas de la superficie celular con dominios transmembrana únicos (Figura 1) . El dominio regulador extracelular de las proteínas Notch consiste en gran medida en repeticiones semejantes a EGF organizadas en tándem que se requieren para la unión del ligando (Artavanis-Tsakonas et al., 1995; Weinmaster, 1998) . En el extremo C terminal de las repeticiones semejantes a EGF se encuentran tres repeticiones ricas en cisteína adicionales, designadas las repeticiones LIN12/Notch (LNR) (Greenwald, 1994) . Aguas abajo de LNR se encuentra la secuencia de escisión proteolítica (RXRR) que es reconocida por una convertasa semejante a furina. Para Notch1, la escisión en este sitio rinde un péptido extracelular de 180 kilodaltons y un péptido intracelular de 120 kilodaltons que se mantienen juntos para generar un receptor heterodimérico en la superficie celular (Blaumueller et al., 1997; Kopan et al., 1996; Logeat et al., 1998) .

El dominio intracelular de Notch (NotchICD, Figura 1) , rescata los fenotipos de pérdida de función de Notch lo que indica que esta forma de Notch produce la señal constitutivamente (Fortini y Artavanis-Tsakonas, 1993; Lyman y Young, 1993; Rebay et al., 1993; Struhl et al., 1993) .

El dominio citoplásmico de Notch contiene tres dominios identificables: el dominio RAM, el dominio de repetición de anquirina y el dominio PEST C terminal (Figura 1) . Después de la activación por el ligando, Notch experimenta dos escisiones proteolíticas adicionales que resultan en la liberación del dominio citoplásmico (Weinmaster, 1998) . Este

péptido Notch se transloca al núcleo e interacciona con los represores transcripcionales conocidos como CSL (CBF, Su (H) , Lag-2) y lo convierte en activador transcripcional. La interacción CSL/Notch depende de la presencia del dominio RAM de Notch; mientras, la actividad transcripcional también requiere la presencia de las repeticiones de anquirina (Hsieh et al., 1996; Hsieh et al., 1997; Roehl et al., 1996; Tamura et al., 1995; Wettstein et al., 1997) . Los estudios tanto in vivo como in vitro indican que los genes HES y Hey son dianas directas de la señalización dependiente de Notch/CSL (Bailey y Posakony, 1995; Eastman et al., 1997; Henderson et al., 2001; Jarriault et al., 1995; Nakagawa et al., 2000; Wettstein et al., 1997) . Los genes HES y Hey son represor transcripcional bHLH que se unen al ADN en las cajas N (Nakagawa et al., 2000; Sasai et al., 1992; Tietze et al., 1992) . Se ha propuesto que Notch señaliza por una ruta independiente de CSL. De hecho, sólo es necesaria y suficiente la expresión del dominio de repetición de anquirina para algunas formas de señalización de Notch (Lieber et al., 1993; Matsuno et al., 1997; Shawber et al., 1996b) .

Finalmente, el dominio PEST se ha implicado en la velocidad de recambio de proteínas por una ruta dependiente de SEL-10/ubiquitina (Greenwald, 1994; Oberg et al., 2001, Rogers et al., 1986; Wu et al., 1998; Wu et al., 2001) . De manera similar a los receptores, el dominio extracelular de los ligandos Notch también consiste en gran medida en repeticiones semejantes a EGF organizadas en tándem (Figura 1) . Aguas arriba de estas repeticiones se encuentra una repetición semejante a EGF divergente conocida como el DSL (Delta, Serrate, Lag-2) que se requiere para la unión del ligando y la activación de los receptores (Artavanis-Tsakonas et al., 1995) .

Señalización Notch y desarrollo vascular

Aunque se han identificado muchos de los genes que funcionan para inducir la vasculogénesis y angiogénesis, poco se sabe acerca de cómo las decisiones del destino celular se especifican durante el desarrollo vascular. Varias de las observaciones sugieren que la ruta de señalización Notch puede jugar un papel en la determinación y formación de patrones del destino celular del sistema vascular.

Notch1, Notch4, Jagged1 y D114 todos se expresan en la vasculatura en desarrollo, mientras Notch3 se expresa en las células del músculo liso accesorias (Krebs et al., 2000; Shuttler et al., 2000b; Uyttendaele et al., 1996; Villa et al., 2001; Xue et al., 1999) . Los ratones que carecen de Jagged1 son letales en el estadio embrionario y tienen defectos vasculares graves (Xue et al., 1999) . Los ratones nulicigotos para Notch1 son letales en el estadio embrionario y mueren de defectos neuronales graves, pero también tienen defectos en la angiogénesis (Krebs et al., 2000; Swalatek et al., 1994) . Los ratones que carecen de Notch4 nacen y parecen normales, pero los embriones que han perdido tanto Notch1 como Notch4 mueren en E9.5 de hemorragias graves y defectos en el patrón vascular indicando que Notch1 y Notch4 pueden ser funcionalmente redundantes durante el desarrollo vascular (Krebs et al., 2000) . La expresión exógena de una forma activada de Notch4 en el endotelio también resultó en defectos vasculares similares a los observados pata los ratones nulicigotos dobles Notch1/Notch4, sugiriendo que son críticos niveles apropiados de la... [Seguir leyendo]

1. Una proteína de fusión cuya secuencia (a) es idéntica a la secuencia de las repeticiones 1-X de EGF del dominio extracelular de la proteína receptora de Notch3 humana en la que X es cualquier número entero de 1 a 10 o de 12 a 33, seguido de (b) una secuencia idéntica a la secuencia de una parte Fc de un anticuerpo, en la que (b) está localizada en el lado carboxi terminal de (a) y en la que (b) está unida a (a) bien directamente o mediante un conector.

2. Una proteína de fusión que comprende la secuencia que (a) es idéntica a la secuencia de las repeticiones de EGF del dominio extracelular de la proteína receptora de Notch3 humana, en la que están presentes X repeticiones de EGF, en la que X es cualquier número entero de 12 a 33 seguido de (b) una secuencia idéntica a la secuencia de una parte Fc de un anticuerpo, en la que (b) está localizada en el lado carboxi terminal de (a) y en la que (b) está unida a (a) bien directamente o mediante un conector.

3. La proteína de fusión de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que la parte Fc del anticuerpo es la parte Fc de un anticuerpo humano.

4. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que (b) está unida a (a) mediante una secuencia conectora.

5. La proteína de fusión de la reivindicación 3, en la que (b) está unida directamente a (a) .

6. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para uso en el tratamiento de un trastorno metabólico.

7. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para uso en el tratamiento de un tumor.

8. La proteína de fusión de la reivindicación 7, en la que el tumor es un cáncer de ovario o un cáncer de mama.

9. La proteína de fusión de la reivindicación 6, en la que el trastorno metabólico es diabetes, obesidad, aterosclerosis, isquemia , ictus, o enfermedad cardiovascular.

10. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para uso en la inhibición de la angiogénesis, linfangiogénesis fisiológica, linfangiogénesis patológica, metástasis tumoral, crecimiento de un tumor secundario, o coopción de vasos sanguíneos.

11. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para uso en el tratamiento de un sujeto que padece un cáncer en el que la proteína de fusión se va a administrar además de (i) un inhibidor del Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular (VEGF) , (ii) un inhibidor del receptor de VEGF, (iii) un inhibidor de PDGF, (iv) un antagonista del receptor de PDGF, o (v) un inhibidor de HER2/neu.

12. La proteína de fusión de la reivindicación 11, en la que el inhibidor de VEGF es un inhibidor de VEGF-A, PGIF, VEGF-B, VEGF-C, o VEGF-D.

13. La proteína de fusión de la reivindicación 11, en la que el inhibidor del receptor de VEGF es un inhibidor de VEGFR-1 o un inhibidor de VEGFR-2.

14. La proteína de fusión de la reivindicación 11, en la que el inhibidor de PDGF es un inhibidor de PDGF-A o un inhibidor de PDGF-B.

15. La proteína de fusión de la reivindicación 11, en la que el antagonista del receptor de PDGF es un antagonista del receptor de PDGF B.

Expresión de proteínas y ligandos Notch en células endoteliales sanguíneas y linfáticas.

Se llevó a cabo RT-PCR para Notch1-4, DII1, DII4 y Jagged1 en ARN aislado de células endoteliales sanguíneas (BEC) y células endoteliales linfáticas (LEC) purificadas de HMVEC (Fig. 4A) . Notch1, Notch2, Notch4, DII4 y Jagged1 se expresaron tanto en BEC como LEC a un nivel similar. La expresión de Notch3 parece estar restringida a LEC lo que sugiere que la señalización de Notch3 funciona en el endotelio linfático.

Notch3 se co-expresa con los marcadores de células endoteliales linfáticas LYVE-1 y Prox1 en embriones e13.5. Se inmunotiñeron secciones seriadas de 10 micrómetros de embriones de ratón de 13.5 días embrionarios bien para LYVE-1, Prox1 y Notch3. Notch3 se expresaba en las células que también expresaban los marcadores de células endoteliales linfáticas, LYVE-1 y Prox1.

Prox1 induce la expresión de Notch3 en células endoteliales sanguíneas. A. Examinamos si la expresión ectópica de Prox1 alteraría la expresión de proteínas o ligandos Notch. Veinticuatro horas después de la infección adenoviral bien con Ad-Prox1 o Ad-LacZ, se aisló el ARN total de HUVEC y se llevó a cabo RT-PCR cuantitativa 5 para Notch1-4, DII4 y Jagged1. Prox-1 reguló al alza de manera robusta la expresión de Notch3. La expresión de Notch1, Notch2, Notch4, DII4 y Jagged1 no se vio afectada significativamente. B. El Compuesto E (cE) , inhibidor de presenilina que inhibe la señalización de Notch, se incubó durante 24 horas en HUVEC infectadas bien con Ad-LacZ

o Ad-Prox1. Se aisló el ARN total y se llevó a cabo RT-PCR cuantitativa para determinar la expresión de Notch3.

Prox1 indujo la expresión de Notch3 y esta inducción se inhibió por la adición del Compuesto E. Esto sugiere que la 10 inducción por Prox1 de Notch3 depende de la activación de la señal Notch.

Prox1 induce genes diana de Notch en células endoteliales sanguíneas. Se infectaron HUVEC con adenovirus que codifican, LacZ, Prox1, N1IC o N4/int-3 y se aisló el ARN total 24 horas después de la infección. Se llevó a cabo RT-PCR cuantitativa para los genes diana de Notch endoteliales, VEGFR-3, EfrinaB2, Hey1 y Hey2. De manera similar a la activación de la señal de Notch1 y Notch4, Prox1 indujo los cuatro genes (A y B) . Se desconoce la expresión de Hey1 y Hey2 en el endotelio linfático.

Prox1 induce genes diana de Notch de manera dependiente de la señalización de Notch en células endoteliales sanguíneas. Se infectaron HUVEC con adenovirus que codifican, LacZ, Prox1, N1IC o N4/int-3. El Compuesto E (cE) , inhibidor de presenilina que inhibe la señalización de Notch, se incubó durante 24 horas en HUVEC infectadas bien con Ad-LacZ o Ad-Prox1 y se aisló el ARN total. Se llevó a cabo RT-PCR cuantitativa para los genes diana de Notch endoteliales, VEGFR-3, EfrinaB2 y Hey2. La inducción mediada por Prox1 de los genes diana de Notch, efrinaB2, VEGFR-3 y Hey2 se inhibió por la adición del inhibidor de la señalización de Notch, Compuesto E. Así, Prox1 regula la expresión de efrinaB2, VEGFR-3 y Hey2 a través de Notch.