Procesado y uso de fluidos del tracto reproductivo para mejorar la producción in vitro de embriones de mamífero.

Procesado y uso de fluidos del tracto reproductivo (biofluidos) para mejorar la producción in vitro de embriones de mamífero que comprende las siguientes etapas:

a) fraccionamiento y procesado de los biofluidos mediante un tratamiento de selección, purificación, liofilización y su posterior almacenamiento; b) método de capacitación espermática en un medio de cultivo suplementado con biofluidos; c) fecundación in vitro en un medio enriquecido con biofluidos y d) posterior cultivo embrionario con desarrollo in vitro de los embriones obtenidos hasta cualquier fase del desarrollo preimplantacional en medios suplementados con biofluidos.

Procesado y uso de fluidos del tracto reproductivo para mejorar la producción in 5 vitro de embriones de mamífero Objeto de la invención La presente invención contempla un método para aumentar la calidad embrionaria mediante el uso de técnicas de fecundación in vitro (FIV) , opcionalmente con preincubación de los ovocitos en fluidos biológicos naturales de fases específicas del ciclo reproductivo, combinado con un método de separación espermática en medio de cultivo suplementado con dichos fluidos y la posterior fecundación y cultivo embrionario (CE) en medios suplementados con fluidos.

Sector de la técnica Esta invención pertenece de forma general, al campo de la Reproducción Asistida en mamíferos, en concreto a las técnicas de Capacitación espermática, Fecundación in vitro y Cultivo embrionario.

Antecedentes de la invención y estado de la técnica El procedimiento actualmente conocido para la obtención in vitro de un embrión supone la realización de distintas técnicas de reproducción asistida (ARTs) que difieren entre laboratorios y especies, y comprende los siguientes pasos: 1) la obtención y maduración in vitro (MIV) de los gametos femeninos (ovocitos) ; 2) la preparación y capacitación de los gametos masculinos (espermatozoides) ; 3) el proceso de fecundación in vitro en sí mismo ya sea mediante el cocultivo de los gametos o la microinyección asistida de un espermatozoide en el interior del ovocito, y 4) el CE para que los cigotos alcancen el estadio de desarrollo deseado, generalmente el de blastocisto.

Una estrategia para incrementar la eficiencia de estas ARTs ha sido imitar en el laboratorio las condiciones que los gametos-cigotos-embriones encuentran in vivo 30 donde, tras la ovulación, el ovocito maduro es captado por el oviducto (trompas de Falopio) contactando con su medio natural, el fluido oviductal (FO) . Por su parte los espermatozoides -nadan" desde la vagina o el cérvix (según la especie) hasta el lugar de la fecundación (oviducto) contactando durante su paso por el útero con el fluido uterino (FU) y luego, cuando se encuentran ya en las proximidades del ovocito, con el FO. Una vez ambos gametos están en el oviducto se produce la fecundación y el desarrollo embrionario temprano siendo el FO el medio natural en el que ocurren estos eventos reproductivos. Posteriormente el embrión pasa al útero, siendo el FU el medio fisiológico donde se desarrollará hasta que ocurre la implantación y placentación. Por ello, COn el objetivo de formular ylo adaptar nuevos medios de cultivo empleados in vitro y mejorar los resultados de fecundación y desarrollo embrionario, numerosos trabajos han estudiado la composición de estos fluidos naturales (Iritan; et al. 1974, J Anim Sci 39: 582-588; Leese el al. 2008, Reprod Fertil Oev 20: 1-8) . Sin embargo, no se han realizado investigaciones dirigidas a reproducir de una forma combinada y completa el ambiente fisiológico diseñando sistemas de cultivo integrales (desde la FIV hasta el CE) con medios más próximos a la composición de los fluidos biológicos naturales (FO y FU) . Incluso a pesar de que, como se ha comprobado en la especie humana, la adición al medio de cultivo de una ·simple~ proteína oviductal incrementa en más de un 8% los nacimientos (Meinljes el al. 2009, Hum Reprod 24: 782-789) .

Sin duda, las secreciones oviductales y uterinas proporcionan mejores condiciones para la fecundación y el desarrollo embrionario que los sistemas in vitro convencionales ya que la composición de estos medios naturales varía a lo largo de las diferentes fases del ciclo reproductivo de la hembra proporcionando al ovocito, cigoto y/o embrión las condiciones idóneas para su desarrollo en cada momento (Kiffian el al. 1989, J Reprod Fertil 86: 419-426; Leese el al. 2008, Reprod Fertil Oev

20: 1-8) . De forma genérica los biofluidos contienen sales, electrolitos, aminoácidos, componentes energéticos y proteínas. Entre las más de 150 proteínas oviductales que se han conseguido identificar (Avilés el al. 2010, Mol Human Reprod. 16: 89&-906) , algunas ya se encuentran disponibles comercialmente y se utilizan como suplemento a los medios de cultivo in vitro (Hao el al. 2006, Biol Reprod 75: 726-733; Meintjes et al. 2009, Hum Reprod 24: 782-789) . Sin embargo, se desconoce la composición completa y la concentración exacta de todos los componentes de los biofluidos por lo que la adición directa de los mismos a los medios de cultivo artificiales supone la estrategia más económica, rápida y fiable de suplementarios Can todo aquello que los gametos, cigotos y/o embriones precisan en cada una de las etapas.

En mamíferos, incluida la especie humana, los FO y/o FU se obtienen mediante distintas técnicas y generalmente se procesan con una unica centrifugación y posterior congelación de la fracción líquida (Carrasco el al. 2ºo8a, Reprod Fertil Oev 20: 80881 7; Carrasco el al. 2008b, Reproduction 136: 833-842; Faulkner el al. 2012, 5 Proteomics 12: 2014-223; Lippes y Wagh 1993, Fertil Sleril59: 157-162;Velazquez el al. 2010. Theriogenology 73: 758-767) . Estos biofluidos mejoran las tasas de fecundación y aumentan la calidad embrionaria (Aitken 1977, J Embr y ol Exp Morphol

41: 295-3OO;Cebrian-Serrano el al. 2013, ReprodOomeslAnim 48: 331-338; Coy el al. 2ºo8a, PNAS 105: 15809-15814; L10yd el al. 2009, Reproduction 137: 679-687) . A 10 pesar de estos resultados alentadores, hasta la fecha no se han empleado los biofluidos como aditivos en las ARTs humanas lo que abre un campo nuevo de investigación, especialmente si consideramos que, en la mayoría de ocasiones, el efecto beneficioso sobre gametos y embriones es interespecifico, es decir, que los biofluidos de una especie de mamífero pueden utilizarse para las ARTs de otra especie diferente (Mondéjar el al. 2013, HumReprod 28: 718-728; Rondeau el al. 1996, Can J Vel Res 60:14-20) . Hasta ahora el procesado de los biofluidos, el almacenamiento y el transporte de las muestras requieren una temperatura controlada para mantener la cadena de fria, condicionando la implementación y extensión de su uso en el campo de la biología reproductiva.

Se ha descrito el efecto beneficioso del contacto de los gametos con los componentes del FO antes de la FIV (Coy el al. 2008b, Reproduction 135: 19-27; Coy el al. 2010, Theriogenology 74: 632-642) y se ha comprobado que los espermatozoides recogidos mediante Swim-up muestran una mayor integridad del ADN y un menor porcentaje de 25 morfoanomalias que los obtenidos con centrifugaciones tipo Percoll (Menkveld el al. 1990, Andrologia 22: 152-158; Zini el al. 2000, Urology 56: 1081-1084) . Aunque el proceso de capacitación espermática pueda parecer un mero trámite en las ARTs (dura apenas 45-60 minutos) , el estrés que sufren los espermatozoides se transmite a la descendencia con alteraciones metabólicas y de comportamiento (Gapp el al. 2014,

Nal Neurosci 17; 667-669) .

Se han encontrado 5 documentos relacionados con el uso de sustancias específicas en los protocolos de FIV y/o CE pero ninguna describe el uso combinado de FO y FU de fases especificas del ciclo en la generación de embriones. Tampoco se describe en estas patentes ningún método de purificación o fraccionamiento de biofluidos ni su uso en métodos de capacitación espermática.

Patente-1 (ES 2 323 993 A1 , Pilar Coy Fuster y Manuel Avilés Sánchez) , donde se describe un Método para aumentar la monospermia en la FIV.

Patente-2 (ES 2 439424 A1 , Ignacio Santiago Álvarez Miguel y Mario Javier Perianes Carrasco) donde se describe un Método para aumentar el potencial implantatorio de 5 embriones de mamíferos obtenidos por FIV.

Palenle-3 (W02006/012177 , Randall Pralher) "Melhod lo decrease Ihe rale 01 polyspenny in IVF".

Palenle-4 (US 2013/0344595 A1 , David K. Gardner, Mark G. Larman y Donald Linck) "Culture media ter developmental cells containing elevated concentrations af lipaie 10 acid".

Palenle-5 (CN103333855 (A) , ZouXiangang y Zhao Yatin) "Sheep embr y onic cell culture f1uid~.

Descripción detallada de la invención La presente invención contempla un método para aumentar la calidad de los embriones mamíferos obtenidos in vitro mediante un sistema que incluye la adición de fluidos biológicos naturales (FO y/o FU) de fases específicas del ciclo reproductivo en las fases de capacitación espermática, FIV y CE.

Los autores de la presente invención han desarrollado por un lado, un sistema de capacitación espermática que no requiere centrifugaciones, empleando como aditivo proteico los FO y/o FU, que supone grandes ventajas a la hora de reducir el estrés al que se ven sometidos los gametos masculinos durante el procedimiento de separación del plasma seminal, y que ayuda así a seleccionar aquellos... [Seguir leyendo]

1. Método para aumentar la calidad biológica y la supelVivencia de los embriones de mamífero producidos in vitro mediante la incorporación de biofluidos de fases específicas del ciclo a los medios de cultivo caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

i) Fraccionamiento y procesado de los fluidos oviductal y uterino de cada una

de las fases del ciclo mediante un proceso de selección, doble

centrifugación con posterior liofilización, opcionalmente pasteurización y

refrigeración para su uso en técnicas de reproducción asistida o para

biotecnología en general.

ii) Procesado de los espermatozoides en un medio de cultivo suplementado

con los biofluidos obtenidos en i) caracterizado porque la selección de los

espermatozoides para fecundación in vitro se basa en su capacidad

fisiológica de nadar libremente atravesando dicho medio de cultivo que

contiene agua, sales inorgánicas, compuestos energéticos, antibióticos y

fluido oviductal fraccionado y tratado, obtenido durante la fase folicular

tardla del ciclo.

iii) Fecundación in vitro utilizando los espermatozoides obtenidos en ii) en un

medio enriquecido con fluido oviductal.

iv) Cultivo de los embriones obtenidos en ¡ii) hasta cualquier fase del desarrollo

preimplantacional en medios suplementados con fluido oviductal en una

primera fase (variable desde 24 hasta 72 horas) y con fluido uterino en una

segunda fase (variable desde 48 hasta el estadio de mórula o blastocito) .

2. Método según la reivindicación 1 ii) , caracterizado porque en el medio de cultivo la concentración de sales inorgánicas está comprendida entre 90 y 130 mM, la concentración de sustratos energéticos está comprendida entre 120 y 160 mM y la concentración de fluido oviductal fraccionado y tratado está comprendida entre 0.1 y 5%.

3. Mélodo según la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración de fluido oviductal fraccionado y tratado de fase folicular tardia o luteal temprana del ciclo reproductor en el medio de fecundación in vitro está comprendida entre 0.1 y 5%.

4. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa iv) se realiza cultivando los embriones durante las primera.

2. 72 horas desde la fecundación en medio de cultivo suplementado con fluido oviductal fraccionado y tratado, obtenido preferentemente durante la fase luteal temprana del ciclo a una concentración entre 0.1 y 5%.

5. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa iv) se realiza cultivando los embriones hasta estadio de mórula o blastocisto en medio de cultivo suplementado con fluido uterino fraccionado y tratado, obtenido preferentemente durante la fase luteal del ciclo a una concentración entre 0.1 y 5%.

6. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los biofluidos se obtienen de mamíferos.

7. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque los gametos, cigotos o embriones se obtienen de mamíferos.

8. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde los biofluidos utilizados son de la misma o de distintas especies.

9. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde los biofluidos utilizados pueden ser de un mismo sujeto o de un sujeto diferente (donante) .

10. El uso de biofluidos fraccionados y tratados en la elaboración de medios de cultivo, suplementos o medicamentos para mejorar la funciona lidad espermática, la fecundación in vitro, el cultivo embrionario, la criopreservación de gametos o embriones o la transferencia embrionaria a una hembra receptora según las reivindicaciones anteriores.