Polipéptidos multiméricos de HLA-G que incluyen monómeros alfa1-alfa3 y usos farmacéuticos de los mismos.

Multímeros, caracterizados por comprender al menos dos monómeros,

cada uno de dichos monómeros se selecciona del grupo que consiste en un péptido P2 de fórmula P1-X3 o X2-X3, en donde P1 es de fórmula X1-X2, en donde

• X1 representa un conector peptídico que comprende al menos 10-30 aminoácidos y hasta 100 aminoácidos e incluye una cisteína en su extremo amino, y

• X2 representa un dominio α1 (o péptido α1) de HLA-G y

• X3 representa un dominio α3 de HLA-G.

Polipéptidos multiméricos de HLA-G que incluyen monómeros α1-α3 y usos farmacéuticos de los mismos La presente invención se refiere a polipéptidos multiméricos y a los usos farmacéuticos de los mismos. La invención se refiere más específicamente a multímeros que comprenden los dominios α1 y α3 de un antígeno HLA-G. La invención también se refiere a los procedimientos para producir tales multímeros, composiciones farmacéuticas que los comprenden, así como sus usos para tratar diferentes enfermedades, entre ellas el rechazo de órganos o tejidos.

Los antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) se dividen en tres clases principales, a saber, antígenos de clase I, antígenos de clase II (HLA-DP, HLA-DQ y HLA-DR) y antígenos de clase III.

Los antígenos de clase I comprenden los antígenos clásicos, HLA-A, HLA-B y HLA-C, que muestran 3 dominios globulares (α1, α2 y α3) asociados a la microglobulina β2, así como los antígenos no clásicos HLA-E, HLA-F y HLA-

G.

El HLA-G es una molécula del HLA de clase I no clásico expresada por los trofoblastos extravellosos de la placenta normal de humano, las células epiteliales tímicas y la córnea. Los antígenos HLA-G se expresan esencialmente en las células citotrofoblásticas de la placenta y funcionan como agentes inmunomoduladores que protegen al feto frente al sistema inmunitario materno (ausencia del rechazo por la madre) . Se ha descrito la secuencia del gen de HLA-G [1, 2] y comprende 4396 pares de bases. Este gen se compone de 8 exones, 7 intrones y un extremo sin traducir en 3', que corresponden respectivamente a los siguientes dominios: exón 1: secuencia señal, exón 2: dominio extracelular α1, exón 3: dominio extracelular α2, exón 4: dominio extracelular α3, exón 5: región transmembranaria, exón 6: dominio citoplasmático I, exón 7: dominio citoplasmático II (sin traducir) , exón 8: dominio citoplasmático III y región sin traducir en 3'.

Se han identificado siete isoformas de HLA-G, entre las cuales 4 están unidas a la membrana (HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3 y HLA-G4) y 3 son solubles (HLA-G5, HLA-G6 y HLA-G7) (véase [3] para una revisión) .

La isoforma proteica madura HLA-G1 comprende los tres dominios externos (α1, α2 y α3) , la región transmembranaria y el dominio citoplasmático.

La isoforma proteica HLA-G2 no comprende el dominio α2, a saber, los dominios α1 y α3 están unidos directamente, seguidos por el dominio transmembranario y el dominio citoplasmático.

La isoforma proteica HLA-G3 carece de los dominios α2 y α3, a saber, comprende el dominio α1 directamente unido al dominio transmembranario y el dominio citoplasmático.

La isoforma proteica HLA-G4 carece del dominio α3, a saber, comprende el dominio α1, el dominio α2, el dominio transmembranario y el dominio citoplasmático.

Todas las isoformas solubles de HLA-G carecen de los dominios transmembranario y citoplasmático. Más en concreto:

 La isoforma proteica HLA-G5 contiene los dominios α1, α2 y α3, así como una secuencia peptídica adicional en el extremo carboxilo de 21 restos aminoacídicos codificados por el intrón 4 (como resultado de la retención del intrón 4 después del ayuste del transcrito y la maduración del ARN) .

 La isoforma proteica HLA-G6 corresponde a la HLA-G5 sin α2, a saber, HLA-G6 contiene los dominios α1 y α3, así como una secuencia peptídica adicional en el extremo carboxilo de 21 restos aminoacídicos codificados por el intrón 4 (como resultado de la retención del intrón 4 después del ayuste del transcrito y la maduración del ARN) .

 La isoforma proteica HLA-G7 contiene sólo el dominio α1, así como 2 restos aminoacídicos adicionales en el extremo carboxilo codificados por el intrón 2 (como resultado de la retención del intrón 2 después del ayuste del transcrito y la maduración del ARN) .

Todas estas isoformas se han descrito en [4, 5, 6] y en la solicitud de patente europea EP 0.677.582.

Los estudios previos han demostrado que las proteínas HLA-G son capaces de inhibir las respuestas alógenas, tales como la respuesta de los linfocitos T proliferativos, la citólisis mediada por los linfocitos T citotóxicos y la citólisis mediada por los linfocitos NK (citolíticos) [7, 8 9]. Los estudios más recientes han demostrado también que la HLA-G es capaz de inducir la diferenciación de los linfocitos T reguladores que, a continuación, consiguen inhibir las respuestas alógenas por sí mismos, y se sabe que participan en la tolerancia de los aloinjertos [10, 11]. Debido a esta amplia función inhibidora, se ha demostrado que la expresión de HLA-G está correlacionada con una mejor aceptación de los transplantes alógenos, tanto si la HLA-G se expresa en el injerto o si se detecta en el plasma de los pacientes, como una molécula soluble [12, 13, 14]. Como resultado, se han propuesto procedimientos basados en las HLA-G para tratar el rechazo de aloinjertos o xenoinjertos en los trasplantes de órganos o tejidos. También se ha propuesto que las proteínas HLA-G se usen para el tratamiento de cánceres (patente europea EP 1.054.688) ,

enfermedades inflamatorias (patente europea EP 1.189.627) y, más en general, enfermedades relacionadas con la inmunidad. También se ha propuesto que la fusión de las proteínas HLA-G a ligandos específicos dirigirá selectivamente las HLA-G a células o tejidos concretos (solicitud de patente internacional WO 2007/091078) . Sin embargo, se debe advertir que no se han proporcionado resultados o datos experimentales que demuestren que tales fusiones de acción selectiva sean activas.

Se ha demostrado que las HLA-G se unen a tres receptores principales: ILT2/LILRB1/CD85j, ILT4/LILRB2/CD85d y KIR2DL4. El ILT2 se expresa principalmente en los linfocitos T, linfocitos B, linfocitos NK, monocitos y células dendríticas. El ILT4 se expresa solo en las células mieloides, esto es, principalmente monocitos y células dendríticas. El KIR2DL4 se expresa principalmente en los linfocitos NK de la decidua y en un pequeño subconjunto de linfocitos NK periféricos. Debido al extenso patrón de expresión de sus receptores inhibidores, la HLA-G puede ejercer su función tolerógena en todos los efectores de las respuestas inmunitarias que son responsables de la inmunidad antivírica, reacciones autoinmunitarias, inmunidad antitumoral, enfermedades inflamatorias y rechazo de transplantes.

El KIR2DL4 es un receptor específico de la HLA-G. El KIR2DL4 se acopla al dominio α1 de HLA-G y, más en concreto, a los restos Met76 y Gln79 que son característicos de HLA-G [15]. Además se ha demostrado que estos dos restos son cruciales para la función inhibidora de HLA-G a través de KIR2DL4, y que al mutarlos se impedía que la HLA-G inhibiera in vitro la actividad citolítica de los linfocitos NK que expresaban el KIR2DL4. A pesar de su especificidad por HLA-G, es probable que el KIR2DL4 no desempeñe ningún papel significativo en la función inhibidora de HLA-G, excepto en el contexto del embarazo, principalmente debido a que su expresión está limitada a los linfocitos NK de la decidua y porque, in vitro e in vivo, se ha demostrado que los ILT desempeñan una función clave a través de la interacción con el dominio α3 de HLA-G. Es posible que el dominio α1 de HLA-G desempeñe un papel directo en la función de HLA-G, a través de KIR2DL4 u otro, así como algún receptor desconocido, pero las pruebas disponibles hasta la fecha apuntan a que la función tolerógena de HLA-G está mediada principalmente, o quizá completamente, por la interacción de su dominio α3 con las moléculas de ILT2 e ILT4.

ILT2 e ILT4 no son receptores específicos de HLA-G y se ha demostrado que se pueden unir a otras moléculas de HLA de clase I a través de su dominio α3 [16, 17, 18]. Se ha descrito con detalle la capacidad del dominio de clase I de HLA para fijarse a las moléculas de ILT. Se ha descrito que ILT2, en particular, se fija a «la mayoría, o quizá a todas» las moléculas de HLA de clase I.

Sin embargo, la HLA-G es el ligando que tiene más afinidad por ILT2 e ILT4, como se ilustra en la tabla 1 de Shiroishi et al [19].

Así pues, ILT2 e ILT4 se fijan a HLA-G con más fuerza que las moléculas del HLA de clase I clásico (véase [20, 21]) .

Esta mayor capacidad de fijación a ILT que tiene HLA-G en comparación con otras moléculas de HLA de clase I está particularmente bien ilustrada por el hecho de que la HLA-G de la superficie de las células tumorales, pero no las moléculas del HLA de... [Seguir leyendo]

1. Multímeros, caracterizados por comprender al menos dos monómeros, cada uno de dichos monómeros se selecciona del grupo que consiste en un péptido P2 de fórmula P1-X3 o X2-X3, en donde P1 es de fórmula X1-X2, en donde  X1 representa un conector peptídico que comprende al menos 10-30 aminoácidos y hasta 100 aminoácidos e incluye una cisteína en su extremo amino, y

 X2 representa un dominio α1 (o péptido α1) de HLA-G y

 X3 representa un dominio α3 de HLA-G.

2. Multímeros de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizados por que el péptido P1 comprende en el extremo carboxilo y/o en el extremo amino de X2 menos de 20, más preferiblemente menos de 15, y lo más preferiblemente menos de 10 o 5, aminoácidos adicionales que flanquean el dominio α1 de una isoforma nativa de HLA-G.

3. Multímeros de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizados por que dicha cisteína en el extremo amino está en las posiciones 1, 2, 3 o 4 desde el extremo amino.

4. Multímeros de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizados por que el monómero α1α3 se da a conocer en la SEQ ID n.º 4.

5. Multímeros de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizados por que están en la forma de un dímero α1-α3, con dos monómeros de SEQ ID n.º 4, asociados entre sí mediante el puente disulfuro entre los restos cisteína 42 del dominio α1.

6. Multímeros de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizados por que los monómeros α1-α3 están unidos a través de un espaciador o de un vehículo.

7. Composición farmacéutica que comprende un multímero de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

8. Multímeros de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, para tratar tumores líquidos, preferiblemente leucemia y tumores mieloides.