Partículas de células troncales mesenquimatosas.

Exosoma aislado a partir de una célula troncal mesenquimatosa y que presenta un tamaño de entre 50 nm y 100 nm según se determina mediante microscopía electrónica,

comprendiendo el exosoma por lo menos una propiedad biológica de una célula troncal mesenquimatosa, tal como una actividad biológica de un medio condicionado por una célula troncal mesenquimatosa (CMM-MC).

Partículas de células troncales mesenquimatosas Campo La presente invención se refiere a los campos de la biología del desarrollo, biología celular, biología molecular y genética. Más particularmente, la invención se refiere a exosomas y a procedimientos para obtener exosomas a partir de células troncales ("stem cells") mesenquimatosas.

Antecedentes Las células troncales, al contrario que las células diferenciadas, presentan la capacidad de dividirse y autorrenovarse o diferenciarse en células hija fenotípica y funcionalmente diferentes (Keller, Genes Dev. 19:11291155, 2005; Wobus y Boheler, Physiol. Rev. 85:635-678, 2005; Wiles, Methods in Enzymology 225:900-918, 1993; Choi et al., Methods Mol. Med. 105:359-368, 2005) .

Las células troncales mesenquimatosas (CMM) son células troncales multipotentes con evidencia documentada de eficacia terapéutica en el tratamiento de lesiones musculoesqueléticas, mejorando la función cardiaca en las enfermedades cardiovasculares y mejorando la gravedad de la EICH (Le Blanc y Pittenger, 2005) . Al estar restringidos al linaje, presentan un potencial limitado aunque robusto de diferenciación en tipos celulares mesenquimales, por ejemplo adipocitos, condrocitos y osteocitos, y un riesgo insignificante de formación de teratomas. El rechazo inmunológico del huésped de las CMM trasplantadas se evita rutinariamente mediante el trasplante autólogo o alogénico. Las CMM pueden aislarse a partir de varios tejidos adultos, incluyendo la médula ósea (MO) , los tejidos adiposos (adp) , la sangre del cordón umbilical y expandirse ex vivo.

Las células troncales mesenquimatosas han sido utilizadas en aplicaciones clínicas y preclínicas para tratar una amplio abanico de enfermedades1, 2, incluyendo la bioingeniería de tejido musculoesquelético3, 4 y las enfermedades cardiovasculares5, 6 . La capacidad terapéutica de las CMM para tratar un amplio espectro de enfermedades en aplicaciones clínicas y preclínicas de tratamiento de un amplio abanico de enfermedades [A1, A2], por ejemplo EICH [A1] en bioingeniería de tejido musculoesquelético [A3, A4] y en enfermedades cardiacas [A5, A6] se ha atribuido a su potencial de diferenciación en muchos tipos celulares reparadores diferentes.

Sin embargo, la disponibilidad de tejidos para su aislamiento sigue siendo limitativa y requiere procedimientos invasivos y peligrosos, y la expansión ex vivo de las CMM, aunque significativa, es sin embargo finita. Sin embargo, la eficiencia de las CMM trasplantadas en la diferenciación en células reparadoras funcionales en los tejidos u órganos daños y en número terapéuticamente relevante nunca ha sido adecuadamente documentada o demostrada.

Algunos informes recientes sugieren que algunos de estos efectos de reparación podrían estar mediados por factores paracrinos secretados por las CMM7. Se ha planteado que estos factores estimulan la arteriogénesis mediante mecanismos paracrinos8, prestan soporte a las criptas de células troncales en el intestino9, protegen frente a las lesiones isquémicas renales10, 11, miocárdicas12-15 y de tejido de las extremidades16; apoyan y mantienen la hematopoyesis17, apoyan la formación de megacariocitos y proplaquetas18 .

Existe una necesidad no satisfecha de una opción terapéutica a base de CMM lista para usar, a un coste económico, con un mejor control de la calidad y consistencia. Es un requisito para la protección urgente frente lesiones tales como los daños por reperfusión en pacientes con IM agudo.

Sumario Se describe una partícula secretada por una célula troncal mesenquimatosa y que comprende por lo menos una propiedad biológica de una célula troncal mesenquimatosa.

Según un primer aspecto de la presente invención, es proporcionado un exosoma aislado a partir de una célula troncal mesenquimatosa y que presenta un tamaño de entre 50 nm y 100 nm determinado mediante microscopía electrónica, comprendiendo el exosoma por lo menos una propiedad biológica de una célula troncal mesenquimatosa.

La propiedad biológica puede comprender una actividad biológica de un medio condicionado para células troncales mesenquimatosas (MC-CMM) . La actividad biológica puede comprender la cardioprotección. El exosoma puede ser capaz de reducir el tamaño del infarto.

La reducción del infarto puede someterse a ensayo en un modelo de ratón o de cerdo de isquemia miocárdica y daño por reperfusión.

El exosoma puede ser capaz de reducir el estrés oxidativo. La reducción del estrés oxidativo puede someterse a

ensayo en un ensayo in vitro de muerte celular inducida por peróxido de hidrógeno (H2O2) .

El exosoma puede contener por lo menos 70% de proteínas en un medio condicionado para células troncales mesenquimatosas (MC-CMM) . Las proteínas pueden seleccionarse de la lista mostrada en la Tabla D1 o E2 o pueden ser productos génicos de los genes mostrados en la Tabla D2 o que comprenden uno o más miARN tal como se muestra en la Tabla E3.

El exosoma puede comprender un complejo de peso molecular>100 kDa. El complejo de peso molecular>100 kDa puede comprender proteínas de <100 kDa. El exosoma puede comprender un complejo de peso molecular>300 kDa. El complejo de peso molecular>300 kDa puede comprender proteínas de <300 kDa.

El exosoma puede comprender un complejo de peso molecular>1.000 kDa. El tamaño del exosoma puede determinarse mediante filtración frente a un filtro de 0, 2 µm y la concentración, frente a una membrana con un valor de corte molecular de 10 kDa.

El exosoma puede comprender un radio hidrodinámico inferior a 100 nm. Puede comprender un radio hidrodinámico de entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 70 nm. Puede ser de entre aproximadamente 40 nm y aproximadamente 60 nm, tal como de entre aproximadamente 45 nm y aproximadamente 55 nm. El exosoma de la célula troncal mesenquimatosa puede comprender un radio hidrodinámico de aproximadamente 50 nm. El radio hidrodinámico puede determinarse mediante difracción láser o dispersión dinámica de la luz.

El exosoma puede comprender un lípido seleccionado de entre el grupo que consiste en fosfolípido, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilcolina, shingomielina, ceramidas, glucolípido, cerebrósido, esteroides y colesterol. La proporción de colesterol-fosfolípido peude ser superior a 0, 3-0, 4 (mol/mol) . El exosoma puede comprender una balsa lipídica.

El exosoma puede ser insoluble en detergente no iónico, preferentemente Triton-X100. En el exosoma las proteínas de los pesos moleculares indicados podrían permanecer sustancialmente dentro de los complejos de los pesos moleculares indicados tras el tratamiento del exosoma con un detergente no iónico.

El exosoma puede ser sensible a la ciclodextrina, preferentemente ciclodextrina 20 mM. El tratamiento con ciclodextrina del exosoma puede causar una disolución sustancial de los complejos indicados.

El exosoma puede comprender ácido ribonucleico (ARN) . El exosoma puede presentar una proporción de absorbancias de 1, 9 (260:280 nm) . El exosoma puede comprender un antígeno de superficie seleccionado de entre el grupo que consiste en CD9, CD109 y thy-1.

Se describe un procedimiento para producir una partícula tal como se ha indicado anteriormente, comprendiendo el procedimiento el aislamiento de la partícula a partir de un medio condicionado para células troncales mesenquimatosas (MC-CMM) .

Según un segundo aspecto de la presente invención, es proporcionado un procedimiento para producir un exosoma tal como se ha indicado anteriormente, comprendiendo el procedimiento: (a) obtener un medio condicionado para células troncales mesenquimatosas (MC-CMM) , (b) concentrar el medio condicionado para células troncales mesenquimatosas, (c) someter el medio condicionado para células troncales mesenquimatosas concentrado a cromatografía de exclusión por tamaño, y (d) seleccionar las fracciones absorbentes de UV.

El tamaño puede seleccionarse de entre los tamaños indicados anteriormente.

Se describe además un procedimiento para producir una partícula tal como se ha indicado anteriormente. El procedimiento puede comprender la obtención de un medio condicionado para células troncales mesenquimatosas (MC-CMM) . Puede comprender la concentración del medio condicionado para células troncales mesenquimatosas. El medio condicionado para células troncales mesenquimatosas puede concentrarse mediante ultrafiltración a través de una membrana de >1.000 kDa. El procedimiento puede comprender someter el medio condicionado para células troncales mesenquimatosas concentrado a cromatografía de exclusión por tamaño. Puede utilizarse una precolumna TSK SWXL de 6x40... [Seguir leyendo]

1. Exosoma aislado a partir de una célula troncal mesenquimatosa y que presenta un tamaño de entre 50 nm y 100 nm según se determina mediante microscopía electrónica, comprendiendo el exosoma por lo menos una propiedad biológica de una célula troncal mesenquimatosa, tal como una actividad biológica de un medio condicionado por una célula troncal mesenquimatosa (CMM-MC) .

2. Exosoma según la reivindicación 1, en el que la actividad biológica comprende la cardioprotección.

3. Exosoma según la reivindicación 1 o 2, que puede reducir el tamaño del infarto por ejemplo tal como se somete a ensayo en un modelo de ratón o cerdo de isquemia miocárdica y daño por reperfusión, o que puede reducir el estrés oxidativo, por ejemplo tal como se somete a ensayo en un ensayo in vitro de muerte celular inducida por peróxido de hidrógeno (H2O2) .

4. Exosoma según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el exosoma comprende por lo menos 70% de proteínas en un medio condicionado por células troncales mesenquimatosas (CMM-MC) , tal como las seleccionadas de la lista representada en la Tabla D1 o E2 o son productos génicos de los genes representados en la Tabla D2 o que comprenden uno o más miARN como los representados en la Tabla E3.

5. Exosoma según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el exosoma comprende: (a) un complejo de peso molecular >100 kDa, por ejemplo que comprende proteínas de <100 kDa; (b) un complejo de peso molecular >300 kDa, por ejemplo que comprende proteínas de <300 kDa; o (c) un complejo de peso molecular >1.000 kDa.

6. Exosoma según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el exosoma presenta un tamaño de entre 50 nm y 100 nm según se determina mediante filtración con un filtro de 0, 2 µm y concentración con una membrana con un valor de corte de peso molecular de 10 kDa, o un radio hidrodinámico inferior a 100 nm, tal como entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 70 nm, entre aproximadamente 40 nm y aproximadamente 60 nm, tal como entre aproximadamente 45 nm y aproximadamente 55 nm, tal como aproximadamente 50 nm, por ejemplo tal como se determina mediante difracción láser o dispersión dinámica de la luz.

7. Exosoma según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el exosoma comprende un lípido seleccionado de entre el grupo que consiste en: fosfolípido, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilcolina, esfingomielina, ceramidas, glucolípido, cerebrósido, esteroides, colesterol, por ejemplo en el que la proporción de colesterol-fosfolípido es superior a 0, 3-0, 4 (moles/moles) .

8. Exosoma según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el exosoma comprende una balsa lipídica, o en el que el exosoma es insoluble en detergente no iónico, preferentemente Triton-X100 o en el que el exosoma es tal que las proteínas de los pesos moleculares especificados en la reivindicación 4 permanecen sustancialmente en los complejos de los pesos moleculares especificados en dichas reivindicaciones cuando el exosoma es tratado con un detergente no iónico, o en el que el exosoma es sensible a la ciclodextrina, preferentemente ciclodextrina 20 mM, de manera que por ejemplo el tratamiento con ciclodextrina causa una disolución sustancial de los complejos especificados en la reivindicación 5.

9. Exosoma según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el exosoma comprende ácido ribonucleico (ARN) , preferentemente en el que el exosoma presenta una proporción de absorbancia de 1, 9 (260:280 nm) , o en el que el exosoma comprende un antígeno de superficie seleccionado de entre el grupo que consiste en: CD9, CD109 y thy-1.

10. Procedimiento para producir un exosoma según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo el procedimiento: (a) obtener un medio condicionado por células troncales mesenquimatosas (CMM-MC) ; (b) concentrar el medio condicionado por células troncales mesenquimatosas; (c) someter el medio condicionado por células troncales mesenquimatosas concentrado a una cromatografía de exclusión por tamaño; y (d) seleccionar las fracciones absorbentes de UV.

11. Composición farmacéutica que comprende un exosoma según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 conjuntamente con un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. Exosoma según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o composición farmacéutica según la reivindicación 11 para la utilización en un método de tratamiento de una enfermedad.

13. Utilización de un exosoma según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de una enfermedad, en la que la enfermedad se selecciona de entre el grupo que consiste en: insuficiencia cardiaca, enfermedad de la médula ósea, enfermedad de la piel, quemaduras y enfermedades degenerativas tales como la diabetes, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, el cáncer, el infarto de miocardio, una herida cutánea, un trastorno dermatológico, una lesión

dermatológica, la dermatitis, la soriasis, el condiloma, las verrugas, el hemangioma, los queloides, el cáncer de piel, la dermatitis atópica, la enfermedad de Behcet, la enfermedad granulomatosa crónica, el linfoma cutáneo de linfocitos T, la ulceración, un estado patológico caracterizado por que presenta lesión inicial que induce inflamación y desregulación inmunológica que conduce al remodelado crónico de los tejidos, incluyendo fibrosis y pérdida de función, la lesión isquémica renal, la fibrosis quística, la sinusitis y la rinitis o una enfermedad ortopédica.

14. Sistema de administración para administrar un exosoma, que comprende un exosoma según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 conjuntamente con un dispensador que puede hacerse funcionar para administrar el exosoma a una diana.