Métodos para la preservación de la complejidad de la secuencia del ADN genómico.

Un método para evitar la reducción del contenido total de C del ADN genómico durante el tratamiento con uno o más reactivos que convierten las bases de citosina no metiladas a uracilo o a otra base que se detecta diferente a la citosina en términos de propiedades de hibridación que comprende:



(a) tratar el dicho ADN genómico, o un fragmento del mismo, con una enzima o serie de enzimas que adicionan un grupo metilo a una citosina fuera de la secuencia de dinucleótidos CpG de el dicho ADN genómico, o un fragmento del mismo y

(b) tratar dicho ADN genómico de la etapa (a) o un fragmento de este con uno o más reactivos para convertir las bases de citosina no metiladas a uracilo o a otra base que se detecta diferente a la citosina en términos de propiedades de hibridación.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10171572.

Solicitante: EPIGENOMICS AG.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: Geneststrasse 5 10829 Berlin ALEMANIA.

Inventor/es: LEWIN, JOERN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/68 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

PDF original: ES-2534200_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Métodos para la preservación de la complejidad de la secuencia del ADN genómico Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos y estuches novedosos para la preservación de la complejidad de la secuencia del ADN genómico, y más particularmente con métodos y estuches novedosos para la preservación de la complejidad de la secuencia del ADN genómico dentro del ADN convertido químicamente y/o enzimáticamente por una enzima o serie de enzimas que adicionan una grupo metilo a la citosina fuera de la secuencia de dinucleótidos CpG de ADN genómico. Más aun, la presente invención se refiere a ácidos nucleicos de la complejidad de la secuencia de ADN genómico preservada y tratada. Adicionalmente, la presente invención se refiere al uso de dichos métodos, ácidos nucleicos, y/o estuches.

Técnica anterior

Se conoce bien en la técnica que el ADN así como el ARN pueden metilarse. La base 5-metilcitosina es la base modificada covalentemente más frecuente encontrada en el ADN de las células eucarióticas. La metilación del ADN juega un importante papel biológico en, por ejemplo, la regulación de la transcripción, la impronta genómica, y la tumorigenesis (para revisión ver, por ejemplo, Millar y otros: Five not four: Hlstory and significance of the fifth base; in The Epigenome, S. Beck y A. Olek (eds.), Wiley-VCH Publishers, Welnhelm 2003, págs. 3-20). La identificación de la 5-metilcitosina es de particular interés en el área del diagnóstico del cáncer. Pero la identificación de la metilación es difícil. La metilación de la citosina usualmente se encuentra en citosinas comprendidas por la secuencia de dinucleótidos CpG (Estados Unidos 2005/0196792). La citosina y la 5-metilcitosina tienen el mismo comportamiento de apareamiento de base, lo que hace a la 5-metilcitosina difícil de detectar por medio del uso de métodos particulares estándar. Los métodos de análisis de ADN convencionales basados en hibridación, por ejemplo, no son aplicables. Adicionalmente, la información de la metilación se pierde completamente por la amplificación por medio de PCR.

Por consiguiente, los métodos actuales para el análisis de la metilación de ADN se basan en al menos dos enfoques diferentes. El primer enfoque usa enzimas de restricción específicas de metilación para distinguir el ADN metilado, en base al clivaje del ADN específico de metilación. El segundo enfoque comprende la conversión química selectiva (por ejemplo, tratamiento con bisulfito; ver, por ejemplo, documento WO 2005/038051) de citosinas no metiladas a uracilo mientras las citosinas metiladas permanecen sin cambio. El uracilo tiene el mismo comportamiento de apareamiento de bases que la timina. Por lo tanto forma pares de bases con la adenina. En su lugar, la 5-metilcitosina híbrida con guanina aún después del tratamiento con bisulfito. Es con ello posible diferenciar entre citosinas metiladas y no metiladas. Alternativamente, la citosina se puede convertir por enzimas como por ejemplo la citidina-deaminasa que convierte la citosina no metilada más rápidamente que la citosina metilada. Una enzima apropiada se describe por Bransteitter y otros (Bransteitter y otros: "Activation-induced cytidine deaminase deaminates deoxycytidine on single-stranded ADN but requires the action of Rnase". PNAS 2003, 100(7): 4102-4107; documento WO 2005/005660).

El ADN pretratado enzimáticamente o químicamente generado en estos enfoques típicamente se secuencia y/o preamplifica y analiza en diferentes formas (ver, por ejemplo, documento WO 02/072880 págs. 1 ff; Fraga y Estella: DNA methylation: a profile of methods and applications; Biotechniques, 33:632, 634, 636-49, 2002). Existe una amplia variedad de métodos para detectar la metilación de ADN genómico, que incluyen enfoques para detectar los niveles de metilación en todo el genoma y de genes específicos. Algunas modalidades de estos métodos permiten además una cuantificación de la metilación es decir la determinación de la cantidad de moléculas de ADN que están metiladas o no metiladas en dicha posición CpG pre-definida dentro de una mezcla de moléculas de ADN. Una metilación preexistente se puede preservar por el uso de metil transferasa durante la amplificación de una molécula de ADN (documento WO 2009/010776).

Varios procedimientos de ensayos de metilación se conocen en la técnica, y pueden usarse junto con la presente invención. La mayoría de los métodos usados para analizar el estado o nivel de metilación de la secuencia específica se basan en la modificación con bisulfito del ADN u otros reactivos con el mismo comportamiento que el bisulfito. Después del tratamiento, el estado de metilación se puede evaluar como una diferencia en la secuencia por ejemplo por secuenciación directa, Pirosecuenciación, Secuenciación de próxima generación, extensión de iniciador, COBRA, MLA, MSP, MethyLight, HM, QM, y HQM.

Descripción de la invención El problema y su solución

Al menos un inconveniente que enfrentan los métodos de metilación y análisis mencionados anteriormente es que las citosinas no metilada se convierten químicamente y/o enzimáticamente a uracilos que tienen el mismo comportamiento de apareamiento de bases que las timinas a lo largo del ADN genómico, es decir, se convierten las citosinas no metiladas dentro de las secuencias de dinucleótidos CpG y fuera de las secuencias de dinucleótidos CpG. Como resultado, la secuencia de ADN genómico modificada mayormente se reduce a solo tres bases (A, T, G). Esta secuencia de ADN menos compleja crea problemas en la secuenciación de ADN, el diseño de ensayos de metilación, el mapeo de secuencias de referencia, y el análisis de la metilación.

La reducida complejidad de la secuencia de ADN resultante frecuentemente dificulta el desarrollo de los ensayos de metilación debido a una flexibilidad disminuida para el diseño de ensayos de PCR, Iniciadores de secuenciación, sondas y bloqueadores únicos de calidad y debido a reacciones de secuenciación de reducida fuerza de la señal o anormalmente formadas, en particular en un genoma a amplia escala.

Más aun, en los métodos de análisis de metilación la conversión de citosinas a timinas genera tramos poli- T que hacen ilegible la señal de secuencia y causa burbujas del colorante del PCR, fallo de la reacción de secuencia, caída repentina de la señal de secuencia, y sobre-estimación de la señal de fondo de la citosina. Por ejemplo, la pirosecuenciación puede ser inexacta cuando múltiples nucleótidos idénticos, en particular señales T, se repiten secuencialmente en una hebra de ADN.

Adicionalmente, la búsqueda de una secuencia tratada químicamente y/o enzimáticamente, en particular con bisulfito, aumenta significativamente con relación a la secuencias de referencia original. A diferencia de la secuenciación normal, las hebras sentido y anti-sentido de las secuencias tratadas no son complementarias entre si porque la conversión solamente ocurre en las citosinas. Como resultado, habrá cuatro hebras diferentes después de la amplificación por PCR. Durante la secuenciación y en particular los métodos de secuenciación aleatoria, una secuencia de bisulfito es casi igualmente probable que se derive de cualquiera de las cuatro hebras. Además, después de tratar químicamente o particularmente del tratamiento con bisulfito del ADN genómico, las Ts en las secuencia de bisulfito se pueden mapear ya sea a Cs o Ts en la referencia pero no vice versa. Además, en el genoma de mamíferos, la frecuencia de dinucleótidos CpG en genomas humanos es solamente 1 % (Scarano E, laccarino M, Gñppo P, Parisi E (1967). "The heterogeneity of thymine metil group orlgln ¡n DNA pyñmldlne ¡sostlchs of developlng sea urchin embryos". Proc. Nati. Acad. Sci. USA 57 (5): 1394-400). Debido a que la metilación de la citosina ocurre casi exclusivamente en los dinucleótidos CpG, la mayoría de las Cs en las hebras sentido y anti-sentido se convertirán a Ts. Por lo tanto, la mayoría de las lecturas de secuencias tratadas químicamente y/o enzimáticamente, particularmente con bisulfito de las dos hebras anteriores serán pobres en C. La drástica reducción en el contenido total de C de las secuencias químicamente tratadas, en particular con bisulfito y en última instancia las señales C causan problemas en la evaluación cuantitativa del genoma de ADN y particularmente en el genoma a amplia escala.

Sería deseable crear métodos para preservar la complejidad del ADN genómico, particularmente en el genoma a amplia escala, para reducir las señales poli T en el análisis de metilación del ADN genómico, para evitar la reducción en el contenido total de C de las secuencia de bisulfito y en última instancia las señales C con el fin de tener una evaluación... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para evitar la reducción del contenido total de C del ADN genómico durante el tratamiento con uno o más reactivos que convierten las bases de citosina no metiladas a uracilo o a otra base que se detecta diferente a la citosina en términos de propiedades de hibridación que comprende:

(a) tratar el dicho ADN genómico, o un fragmento del mismo, con una enzima o serie de enzimas que adicionan un grupo metilo a una citosina fuera de la secuencia de dinucleótidos CpG de el dicho ADN genómico, o un fragmento del mismo y

(b) tratar dicho ADN genómico de la etapa (a) o un fragmento de este con uno o más reactivos para convertir las bases de citosina no metiladas a uracilo o a otra base que se detecta diferente a la citosina en términos de propiedades de hibridación.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho ADN genómico comprende al menos una región objetivo, dicha región objetivo comprende al menos 16 nucleótidos contiguos seleccionados del grupo que consiste en sec. con núms. de ident.: 1 a 7, en donde dichos nucleótidos contiguos comprenden al menos una secuencia de dinucleótido CpG.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde una enzima o serie de enzimas se seleccionan del grupo que consiste en Alu Metiltransferasa, Haelll Metiltransferasa, MSP1 Metiltransferasa, y DNMT2.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde, el reactivo es una solución de un bisulfito, sulfito de hidrógeno o disulfito.

5. Uso de un método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4 en el diagnóstico, pronóstico, seguimiento y/o clasificación de trastornos proliferativos celulares.


 

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