Métodos para el análisis de trastornos proliferativos celulares de la próstata.

Un método para detectar un trastorno proliferativo celular de la próstata en un sujeto que comprende determinar los niveles de expresión de RASSF2 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto,

y seleccionada del grupo que consiste en eyaculación, orina, pasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas, donde la expresión disminuida de y/o metilación de CpG en el gen RASSF22 es indicativa de la presencia de dicho trastorno.

Métodos para el análisis de trastornos proliferativos celulares de la próstata Campo de la invención

La presente Invención se refiere a secuencias de ADN genómlco que muestran patrones de expresión alterados en estados de enfermedad en relación a normales y proporciona métodos, usos de ácidos nucleicos y usos de kits para detectar, o para diagnosticar carcinoma de próstata.

Antecedentes

Incidencia y diagnóstico del cáncer

El cáncer es la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos. Las tasas de mortalidad pueden mejorarse significativamente si se mejorasen los métodos de exploración actuales en cuanto al cumplimiento por parte del paciente, la sensibilidad y la facilidad de la exploración. Los métodos recomendados actuales para el diagnóstico del cáncer son a menudo invasivos, caros o de otro modo no son adecuados para su aplicación con pruebas de exploración en toda la población.

Incidencia y diagnóstico del cáncer de próstata. El cáncer de próstata es la neoplasia más común entre los hombres en los Estados Unidos (~2. nuevos casos por año), y la sexta causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en hombres en todo el mundo (-24. por año). El cáncer de próstata es principalmente una enfermedad de los ancianos, teniendo la enfermedad aproximadamente un 16 % de los hombres con edades entre 6 y 79. De acuerdo con algunas estimaciones en el momento de la autopsia, el 8 % de todos los hombres mayores de 8 años de edad tienen alguna forma de enfermedad de próstata (por ejemplo, cáncer, HBP, prostatitis, etc.). La hipertrofia benigna de próstata está presente en aproximadamente un 5 % de 5 años o más, y en el 95 % de los hombres de 75 o más. Resulta evidente a partir de estos informes que el cáncer de próstata no es a menudo una enfermedad de la que fallezcan los hombres, pero sí con la que lo hacen. Pruebas recientes sugieren que la incidencia del cáncer de próstata puede estar de hecho en descenso, probablemente como resultado de un mejor tratamiento, una mejor cirugía, y una detección más temprana.

Las guías actuales para la exploración del cáncer de próstata se han sugerido por la American Cáncer Society y son las siguientes: A los 5 años de edad, los profesionales de la salud deben ofrecer una prueba en sangre para el antígeno específico de próstata (PSA) y efectuar un examen rectal digital (ERD). Se recomienda que las poblaciones de alto riesgo, tales como los afroamericanos y aquellos con historial familiar de enfermedad de la próstata, deben comenzar a explorarse a los 45 años de edad. Los hombres sin patología prostática anormal tienen generalmente un nivel de PSA en sangre por debajo de 4 ng/ml. Los niveles de PSA entre 4 ng/ml y 1 ng/ml (denominados la "zona gris") tienen un 25 % de probabilidades de tener cáncer de próstata. El resultado es que el 75 % de las veces, los hombres con un ERD y una PSA en esta zona negra tienen una biopsia negativa, o aparentemente innecesaria. Por encima de la zona gris, la probabilidad de tener cáncer de próstata es significativa (> 67 %) y aumenta incluso más a medida que aumentan los niveles de PSA. Existen numerosos métodos para medir la PSA (PSA libre porcentual, velocidad de PSA, densidad de PSA, etc.), y cada uno tiene una precisión asociada para detectar la presencia del cáncer. Sin embargo, incluso con las mejoras menores en la detección, y los descensos comunicados en la mortalidad asociados con la exploración, la frecuencia de falsos positivos sigue siendo alta. La especificidad reducida es el resultado, en parte, de la PSA aumentada en sangre asociada a la HBP, y la prostatitis. También se ha estimado que hasta un 45 % de las biopsias de próstata con las orientaciones actuales son falsos negativos, dando como resultado una sensibilidad reducida incluso con biopsia.

La biopsia guiada TRUS se considera el patrón de oro para el diagnóstico del cáncer. Las recomendaciones para la biopsia están basadas en niveles anormales de PSA y/o ERD anormal. Para la PSA, hay una zona gris donde un gran porcentaje de biopsias quizá no son necesarias. Sin embargo, la capacidad para detectar el cáncer en esta zona gris (niveles de PSA de 4, a 1 ng/ml) es difícil sin biopsia. Debido a esta falta de especificidad, el 75 % de los hombres que se someten a biopsia no tienen cáncer. Sin embargo, sin biopsia, no se detectarían aquellos con cáncer, dando como resultado una morbilidad y mortalidad aumentadas. Sin embargo, los riesgos asociados con una biopsia innecesaria también son elevados.

Está claro que hay necesidad de una prueba temprana y específica para el cáncer para una detección y control del tratamiento más precisos, para mejorar las tasas de morbilidad y mortalidad. Sin embargo, usando un examen histológico rutinario, a menudo es difícil distinguir entre hiperplasia de la próstata de las etapas tempranas del carcinoma de próstata, incluso si se obtiene una biopsia adecuada (McNeal J. E. et al., Hum. Pathol. 21, 32:441- 6). Además, las muestras de biopsia pequeñas o de otro modo insuficientes a menudo impiden el análisis.

Incidencia y diagnóstico del cáncer de colon. En los Estados Unidos, la incidencia anual de cáncer colorrectal es de aproximadamente 15., muriendo 56.6 individuos de cáncer colorrectal cada año. El riesgo de cáncer colorrectal a lo largo de la vida en la población general de aproximadamente un 5 a un 6 porciento. A pesar de los

esfuerzos intensivos en los últimos años en la exploración y detección temprana del cáncer de colon, a día de hoy la mayoría de los casos se diagnostican en un estado avanzado con metástasis regional o distal. Mientras que las opciones terapéuticas incluyen cirugía y adyuvante o quimioterapia paliativa, la mayoría de los pacientes fallecen a causa de la progresión de su cáncer en unos pocos meses. Identificar los cambios moleculares que subyacen al desarrollo del cáncer de colon pueden ayudar a desarrollar nuevas opciones de control, exploración, diagnósticas y terapéuticas que puedan mejorar el pronóstico pobre general de estos pacientes.

Las orientaciones actuales para exploración colorrectal de acuerdo con la American Cáncer Society utilizan una de cinco opciones diferentes para la exploración en los individuos de riesgo medio de 5 años de edad o mayores. Estas opciones incluyen 1) pruebas de sangre oculta en heces (FOBT) anualmente, 2) sigmoidoscopia flexible cada cinco años, 3) FPBT anual más sigmoidoscopia flexible cada cinco años, 4) enema de bario con doble contraste (EBDC) cada cinco años o 5) colonoscopia cada diez años. Aunque estos procedimientos de ensayo están bien aceptados por la comunidad médica, la implementación de exploración extensiva del cáncer colorrectal no se ha llevado a cabo aún. El cumplimiento por parte del paciente es un factor principal para el uso limitado debido a la incomodidad o a los inconvenientes asociados con los procedimientos. La prueba FOBT, aunque es un procedimiento no invasivo, necesita restricciones de tipo dietético y otras durante 3-5 días antes de la prueba. Los niveles de sensibilidad para esta prueba también son muy bajos para el adenocarcinoma colorrectal, con amplia variabilidad dependiendo de la prueba. Las medidas de sensibilidad para la detección de adenomas son incluso menor ya que la mayoría de los adenomas no sangran. Por el contrario, la sensibilidad para procedimientos más invasivos, tales como la sigmoidoscopia y la colonoscopia es bastante elevada debido a la visualización directa del lumen del colon. Estudios no aleatorizados han evaluado la eficacia de estas técnicas, sin embargo, usando datos de estudios de control de caso y datos del National Polyp Study (EE.UU.) se ha demostrado que la extirpación de pólipos adenomatosos da como resultado una reducción del 76-9 % en la incidencia de CCR. La sigmoidoscopia tiene la limitación de solo visualizar el lado izquierdo del colon, dejando las lesiones en el colon derecho sin detectar. Ambos procedimientos de determinación del alcance son caros, necesitan de una preparación catártica y tienen un riesgo aumentado de morbilidad y mortalidad. Las pruebas mejoradas con una sensibilidad aumentada, especificidad, facilidad de uso y costes disminuidos se necesitan claramente antes de que la exploración general en la población para cáncer colorrectal sea rutinaria.

La detección temprana del cáncer colorrectal se basa generalmente en la prueba de sangre fecal oculta (FOBT) efectuada anualmente en individuos asintomáticos. Las recomendaciones actuales adaptadas por varias organizaciones del cuidado de la salud, incluyendo la American Cáncer Society, indican el comienzo de la prueba de sangre fecal oculta a la edad de 5 años, repitiéndose anualmente hasta el momento en que el paciente... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar un trastorno proliferativo celular de la próstata en un sujeto que comprende determinar los niveles de expresión de RASSF2 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto, y seleccionada del grupo que consiste en eyaculación, orina, pasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas, donde la expresión disminuida de y/o metilación de CpG en el gen RASSF22 es indicativa de la presencia de dicho trastorno.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho nivel de expresión se determina detectando la presencia, ausencia o nivel de ARNm transcrito a partir de dicho gen, o donde dicho nivel de expresión se determina detectando la presencia, ausencia o nivel de un polipéptido codificado por dicho gen o secuencia del mismo, o donde dicha expresión se determina detectando la presencia o ausencia de metilación de CpG en dicho gen, donde la presencia de metilación indica la presencia de un carcinoma.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, donde dicho polipéptido se detecta mediante uno o más medios seleccionados del grupo que comprende análisis de transferencia de Western, cromatografía, inmunoensayo, inmunoensayo ELISA, radioinmunoensayo, anticuerpo y combinación de los mismos.

4. Un método para detectar un trastorno proliferativo celular de la próstata en un sujeto, que comprende poner en contacto ADN genómico aislado de una muestra biológica obtenida de dicho sujeto, seleccionada del grupo que consiste en eyaculación, orina, pasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas, con al menos un reactivo, o series de reactivos que distinguen entre dinucleótidos de CpG metilados y no metilados dentro de al menos una región diana del ADN genómico, donde la al menos una región diana es una secuencia de al menos 16 nucleótidos contiguos de SEC ID N°: 1, donde dichos nucleótidos contiguos comprenden al menos una secuencia de dinucleótido de CpG, y mediante el cual la detección del carcinoma, al menos en parte, se posibilita y donde ma metilación de CpG en la SEC ID N°: 1 es indicativa de dicho trastorno.

5. Un método para detectar un trastorno proliferativo celular de la próstata, que comprende:

a) extraer o de otro modo aislar ADN genómico de una muestra biológica obtenida del sujeto, seleccionada del grupo que consiste en eyaculación, orina, pasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas;

b) tratar el ADN genómico de a), o un fragmento del mismo, con uno o más reactivos para convertir las bases de citosina que no están metiladas en la posición 5' de las mismas a uracilo u otra base que sea diferente de manera detectable en cuanto a propiedades de hibridación;

c) poner en contacto el ADN genómico tratado, o el fragmento tratado del mismo, con una enzima de amplificación y al menos un cebador que comprende, una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos que es complementaria a, o híbrida en condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N°: 6, 7, 16, 17, y complementos de las mismas, donde el ADN genómico tratado o el fragmento del mismo bien se amplifica para producir al menos un amplificado, o no se amplifica; y

d) determinar, basándose en la presencia o ausencia de, o en una propiedad de dicho amplificado, el estado o nivel de metilación de al menos un dinucleótido de CpG de SEC ID N°: 1, o un promedio, o un valor que refleje un estado o nivel de metilación promedio de una pluralidad dinucleótidos de CpG de SEC ID N°: 1, mediante el cual al menos uno de detectar y diagnosticar cáncer, al menos en parte, se posibilita y donde la metilación de CpG es indicativa de cáncer de próstata.

6. El método de reivindicación 5, donde poner en contacto o amplificar en c) comprende el uso de al menos un método seleccionado del grupo que comprende: el uso de una ADN polimerasa resistente al calor como enzima de amplificación; el uso de una polimerasa que carece de actividad de 5'-3' exonucleasa; el uso de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR); la generación de una molécula de ácido nucleico amplificada que porta un marcador detectable.

7. El método de reivindicación 5, que además comprende en la etapa d) el uso de al menos una molécula de ácido nucleico o molécula de ácido peptidonucleico que comprenden en cada caso una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o híbrida en condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 6, 7, 16, 17, y complementos de las mismas, donde dicha molécula de ácido nucleico o molécula de ácido peptidonucleico suprime la amplificación del ácido nucleico al que está hibridada, y/o donde determinar en d) comprende la hibridación de al menos una molécula de ácido nucleico o molécula de ácido peptidonucleico en cada caso comprendiendo una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o híbrida en condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 6, 7, 16, 17, y complementos de las mismas.

8. El método de reivindicación 7, que además comprende extender al menos una de dichas moléculas de ácido nucleico en al menos una base nucleotídica.

9. El método de reivindicación 7, donde poner en contacto o amplificar en c), comprende el uso de cebadores específicos de metllación.

1. Un método para detectar el cáncer de próstata, que comprende:

a) extraer o de otro modo aislar ADN genómico de una muestra biológica obtenida del sujeto, seleccionada del grupo que consiste en eyaculación, orina, pasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas;

b) digerir el ADN genómico de a), o un fragmento del mismo, con una o más enzimas de restricción sensibles a metilación;

poner en contacto el ADN digerido con enzima de restricción de b), con una enzima de amplificación y al menos dos cebadores adecuados para la amplificación de una secuencia que comprende al menos un dinucleótido de CpG de SEC ID N°: 1; y

c) determinar, basándose en la presencia o ausencia de un amplificado el estado o nivel de metilación de al menos un dinucleótido de CpG de SEC ID N°: 1, mediante el cual al menos uno de detectar y clasificar el cáncer, al menos en parte, se posibilita y donde ma metilación de CpG en la SEC ID N°: 1 es indicativa de cáncer de próstata.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde la presencia o ausencia de un amplificado se determina mediante hibridación a al menos un ácido nucleico o ácido peptidonucleico que es idéntico, complementario, o híbrida en condiciones rigurosas o elevadamente rigurosas con un segmento de al menos 16 bases de longitud de SEC ID N°: 1.

12. Uso de un ácido nucleico tratado derivado de la SEC ID N°: 1 genómica en la detección del cáncer de próstata, donde se convierte al menos una base de citosina no metilada de la secuencia de ADN genómico a uracilo u otra base que es diferente de manera detectable a citosina en cuanto a su hibridación, o uso de un ácido nucleico en la detección del cáncer de próstata, comprendiendo dicho ácido nucleico al menos 16 nucleótidos contiguos, comprendiendo preferentemente al menos 5 nucleótidos contiguos, de una secuencia de ADN genómico tratado seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N°: 6, 7, 16, 17, y secuencias complementarias a estas, donde dicho ácido nucleico comprende al menos una base que se ha convertido de una base de citosina no metilada de la secuencia de ADN genómico a uracilo u otra base que es diferente de manera detectable a citosina en cuanto a su hibridación, donde la secuencia de bases contiguas comprende al menos una secuencia de dinucleótido de CpG, TpG o CpAy donde la metilación de CpG de SEC ID N°: 1 es indicativa de cáncer de próstata.

13. Uso de un kit en el diagnóstico y/o detección de cáncer de próstata, donde la expresión disminuida de RASSF2A es indicativa de cáncer de próstata, siendo dicho kit adecuado para llevar a cabo el método de acuerdo con la reivindicación 2 y que comprende a) una pluralidad de ollgonucleótidos o polinucleótidos capaces de hibridar en condiciones rigurosas o moderadamente rigurosas a los productos de transcripción del gen RASSF2; (b) un envase adecuado para contener a los oligonucleótldos o polinucleótidos y una muestra biológica del paciente que comprende los productos de transcripción donde los ollgonucleótidos o polinucleótidos pueden hibridar en condiciones rigurosas o moderadamente rigurosas con los productos de transcripción, (c) medios para detectar la hibridación de (b); y opclonalmente, (d) Instrucciones para el uso e interpretación de los resultados del kit, o siendo dicho kit adecuado para llevar a cabo el método de acuerdo con la reivindicación 3 y que comprende (a) un medio para detectar polipéptidos de RASSF2; (b) un envase adecuado para contener dicho medio y la muestra biológica del paciente que comprende los polipéptidos donde los medios pueden formar complejos con los polipéptidos; (c) un medio para detectar los complejos de (b).

14. Uso de un kit en el diagnóstico y/o detección de cáncer de próstata, donde la metilación de CpG es Indicativa de cáncer de próstata, siendo dicho kit adecuado para llevar a cabo el método de acuerdo con la reivindicación 5 y que comprende (a) reactivo de bisulfito; (b) un envase adecuado para contener dicho reactivo de bisulfito y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de ollgonucleótidos que contienen dos ollgonucleótidos cuyas secuencias en cada caso son idénticas, complementarias, o hibridan en condiciones rigurosas o elevadamente rigurosas con un segmento de 9 o preferentemente 18 bases de longitud de una secuencia seleccionada de las SEC ID N°: 6, 7, 16, 17, o siendo dicho kit adecuado para llevar a cabo el método de acuerdo con la reivindicación 1 y que comprende (a) un reactivo de enzima de restricción sensible a metilación; (b) un envase adecuado para contener dicho reactivo y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de ollgonucleótidos, uno o una pluralidad de ácidos nucleicos o ácidos peptidonucleicos que sean idénticos, complementarios, o hibridan en condiciones rigurosas o elevadamente rigurosas con un segmento de al menos 9 bases de longitud de SEC ID N°: 1; y opcionalmente (d) Instrucciones para el uso e Interpretación de los resultados del kit.