Método para reprogramar células diferenciadas.

Un método in vitro para reprogramar una célula diferenciada aislada en una célula madre indiferenciada,

que comprende la etapa de fusionar dicha célula diferenciada con una célula pluripotente aislada, en donde dicha célula pluripotente aislada se trata in vitro con una cantidad adecuada de activador de la ruta Wnt/ β-catenina que es al menos una isoforma de la proteína Wnt o un inhibidor de la glucógeno sintasa quinasa-3.

Método para reprogramar células diferenciadas Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para reprogramar una célula diferenciada a una célula indiferenciada por medio de un activador Wnt/p-catenina o un inhibidor GSK-3.

Antecedentes de la invención

La ruta de señalización Wnt/p-catenina regula varios procesos celulares durante el desarrollo de vertebrados e invertebrados, incluyendo la proliferación y diferenciación celular, muerte celular, y organogénesis (Karner et al., 26; Reya y Clevers, 25). Además la ruta Wnt/p-catenina controla la homeostasis tisular y la regeneración en respuesta a un daño en el pez cebra, Xenopus, planarios, e incluso en mamíferos adultos (Gurley et al., 28; Ito et al., 27; Osakada et al., 27; Petersen y Reddien, 28; Stoick-Cooper et al., 27; Yokoyama et al., 27).

La p-catenina une las cadherinas al citoesqueleto en la adhesión célula-célula y actúa como una molécula de señalización intracelular en la ruta Wnt. La unión de los ligandos Wnt a los receptores Frizzled y LRP5/6 da como resultado la inactivación de un complejo de destrucción multiproteico, que está compuesto por glucógeno sintasa quinasa-3 (GSK-3), Axin y proteína de la poliposis adenomatosa cólica (APC). Esta inactivación da lugar a una disminución de la fosforilación de la p-catenina, lo que permite entonces que la p-catenina escape a la degradación mediada por la ubiquitina - proteosoma (Willert y Jones, 26). Como consecuencia, la p-catenina se acumula en el citoplasma y se traslada al núcleo, dando lugar a la activación transcripclonal de una plétora de genes diana que controlan varios procesos celulares y tisulares (Hoppler y Kavanagh, 27). En ausencia de activación Wnt, la p- catenina se fosforila por el complejo de destrucción y se degrada por el sistema de ubiquitina - proteosoma. La activación de la señalización Wnt/p-catenina induce la expresión de múltiples antagonistas que actúan de manera coordinada para cerrar la ruta simultáneamente en muchos niveles. Extracelularmente, las proteínas Wif-1 y Dkk inhiben la señalización Wnt interactuando con la proteína Wnt y los receptores LRP5/6, respectivamente (Kawano y Kypta, 23). Intracelularmente, tanto la Nkd-1 como la Axin 2 potencian la degradación de p-catenina por medio del aumento de la formación del complejo de destrucción (Behrens, 25; Wharton et al., 21). Las proteínas Wnt forman una gran familia de isoformas (desde la Wnt1 a Wnt1b, Wnt11 y Wnt16) (Kikuchi et al., 27). Entre estas, la Wnt3a ha demostrado que potencia la auto-renovación y mantiene la totipotencia de las células madre embrionarias (ES) y las células madre hematopoyéticas (HSC) (Antón et al., 27; Reya et al., 23) por medio de la acumulación de p-catenina en el núcleo celular. Así mismo, tanto la activación de los homólogos GSK-3ay GSK-3/3 como las mutaciones en APC dan lugar a la estabilización de la p-catenina y compromete seriamente la capacidad de las células ES para diferenciarse y para mantener su rigor (Doble et al., 27; Kielman et al., 22; Sato et al., 24).

La reprogramación puede permitir la indiferenciación de las células diferenciadas hacia la pluripotencia y puede tener lugar por medio de diferentes mecanismos. La transferencia nuclear somática ha permitido la clonación de diferentes animales por medio de la reprogramación de un núcleo diferenciado (Vajta, 27). Recientes hallazgos ha demostrado que la sobre-expresión de cuatro factores de transcripción específicos de células ES que codifican genes de células somáticas de ratón y ser humano pueden inducirlas a convertirse en pluripotentes (Aoi et al., 28; Brambrink et al., 28; Hanna et al., 28; Kim et al., 28; Lowry et al., 28; Maherali et al., 27; Park et al., 28; Takahashi et al., 27; Takahashi y Yamanaka, 26; Yu et al., 27). Las células somáticas de ratón y ser humano también se pueden reprogramar por fusión con células ES, y Nanog, un factor que mantiene las células ES en su estado indiferenciado, aumenta la pluripotencia de los híbridos (Cowan et al., 25; Silva et al., 26; Tada et al., 1997; Tada et al., 21). También se han visto en los híbridos célula ES-timocitos, la reactivación del cromosoma X inactivo, la corrección de la metilación de ADN asociada con genes impresos, y la reactivación del transgén Oct4- GFP. Además, cuando estas células híbridas se introducen en blastocistos diploides huésped, contribuyen a las tres capas germinales de los embriones quiméricos (Tada et al., 1997; Tada et al., 21). Se han comunicado hallazgos similares tras la fusión de fibroblastos humanos con células ES humanas. Los híbridos tetraploides que se obtenían mostraban el fenotipo y tasa de crecimiento de las células ES humanas. El genoma somático se reprogramó, como se demuestra por el análisis transcripcional de genoma completo tipo célula ES humana (Cowan et al., 25).

La Solicitud de Patente WO 27/115216 proporciona métodos para reprogramar terapéuticamente células madre adultas de seres humanos en células pluripotentes. Tales métodos consisten en el aislamiento de una célula madre adulta de ser humano y ponerla en contacto con un medio que comprende factores estimulantes que inducen el desarrollo de la célula madre en una célula reprogramada terapéuticamente. El medio comprende PM-1. Tal método ha sido propuesto también en la Solicitud de Patente WO 25/123123 en la que el factor estimulante es un producto químico seleccionado de entre el grupo que consiste en 5-aza-2-desoxicitidina, inhibidor de la histona des- acetilasa, ácido n-butírico y tricostatina.

La Solicitud de Patente WO 27/5472 desvela métodos para reprogramar y modificar genéticamente células. En

esta solicitud se obtiene un genoma pluripotente a partir de un genoma diferenciado fusionando una célula pluripotente con una célula diferenciada en presencia de Nanog o un inhibidor MEK.

La Solicitud de Patente WO 27/19398 proporciona métodos mejorados para reprogramar una célula animal somática diferenciada en una célula madre indiferenciada. Tales métodos comprenden (a) inyectar una o más células animales somáticas diferenciadas en un oocito, (i) remodelar la envoltura nuclear del núcleo de la células somática y (ii) reprogramar la cromatina de la célula somática y (b) transferir o fusionar el núcleo remodelado resultante que se obtiene en (a) en el citoplasma enucleado de una célula embrionaria indiferenciada para formar una célula madre indiferenciada.

La Solicitud de Patente WO 27/16245 se refiere a métodos de reprogramación de células madre adultas o células madre que se obtienen de la sangre del cordón umbilical o placentario o del tejido del cordón umbilical o la placenta o del líquido amniótico o del amnios. Las células madre reprogramadas se obtienen exponiendo células madre pluripotentes adultas o células progenitoras o células madre pluripotentes o células progenitoras obtenidas de tejido del cordón umbilical o la placenta o de la sangre del cordón umbilical o la placenta o del líquido amniótico o del amnios a una cantidad eficaz de medio de células madre embrionarias o a un procedimiento de enucleación para retirar el ADN nuclear de la células madre seguido por la introducción de material nuclear de un paciente que se va a tratar. El medio de células madre embrionarias es un medio mínimo esencial que comprende al menos un factor de crecimiento, glucosa, aminoácidos no esenciales, insulina y transferrina. El factor de crecimiento es el factor de crecimiento de fibroblastos, el factor de transformación del crecimiento beta o mezclas de los mismos y dicho medio comprende además al menos un componente adicional que se selecciona de entre el grupo que consiste en ácido aminobutírico, ácido pipecólico, litio y mezclas de los mismos.

La Solicitud de Patente WO 25/33297 desvela composiciones, métodos y kits para la reprogramación de transferencia no nuclear de una célula adulta diferenciada que se obtiene de un tejido de un adulto en una célula tipo ES. El método de producción de una célula tipo célula madre embrionaria reprogramada comprende poner en contacto una célula adulta diferenciada con una bacteria Mycobacterium leprae, o componentes de la misma que se seleccionan de entre el grupo que consiste en PGL-1, una fracción de pared celular completa, una proteína de la pared celular, un lípido de la pared celular, un carbohidrato de la pared celular, una proteína liberada por una bacteria viable, y una proteína segregada por una bacteria viable.

La Solicitud de Patente WO 25/68615 proporciona un método de cultivo de una célula madre pluripotente a la vez que se inhibe la diferenciación de la célula madre pluripotente por supresión de la señalización de Wnt/(5- catenina. El supresor... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para reprogramar una célula diferenciada aislada en una célula madre indiferenciada, que comprende la etapa de fusionar dicha célula diferenciada con una célula pluripotente aislada, en donde dicha célula pluripotente aislada se trata in vitro con una cantidad adecuada de activador de la ruta Wnt/ (5-catenina que es al menos una isoforma de la proteína Wnt o un inhibidor de la glucógeno sintasa quinasa-3.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la célula pluripotente aislada se trata in vitro antes o después de la etapa de fusión de dicha célula diferenciada con dicha célula pluripotente.

3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la célula diferenciada se selecciona de entre el grupo de: célula somática, célula madre neural, fibroblasto embrionario, timocito.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la célula pluripotente aislada se selecciona de entre el grupo de: célula madre adulta, célula madre embrionaria.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la célula pluripotente aislada es una célula de ratón o una célula humana y la célula diferenciada es una célula de ratón o humana.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la isoforma de Wnt se selecciona de entre el grupo de: Wntl, Wnt2, Wnt2b/13, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt1a, Wnt1b, Wnt11 o Wnt16.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el inhibidor de la glucógeno sintasa quinasa-3 es BIO o CHIR9921 o un análogo de los mismos.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende además la sobreexpresión de la proteína Nanog en la célula pluripotente aislada.

9. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7 que comprende además la sobre-expresión de la proteína Nanog en la célula fusionada.

1. El método de acuerdo con las reivindicaciones 8 o 9 en el que la sobre-expresión de la proteína Nanog se obtiene modificando genéticamente la célula pluripotente aislada o la célula fusionada o transduciendo la célula pluripotente aislada o la célula fusionada con un vector apropiado.